脐血造血细胞的体外扩增及分化特性
作者：张建华 田志刚 张彩 王郡甫 孙内
单位：张建华 田志刚 张彩 王郡甫 孙内(山东省医学科学院基础医学研究所山东肿瘤生物治疗研究中心 济南 250062)
关键词：造血生长因子；脐血；扩增
中国肿瘤生物治疗杂志000209
摘 要 目的： 了解造血生长因子的不同组合对人脐血CD34+细胞的扩增效应及分化特性。方法： 采用人脐血单个核细胞(MNC)经rhIL-1，rhIL-3，rhIL-6，rhG-CSF，rhGM-CSF和rhSCF的不同组合进行体外扩增培养, 动态观察了不同细胞因子组合对有核细胞总数的扩增数量,应用流式细胞技术(FACS)动态分析了造血细胞的表面标志, 并对液态扩增后造血细胞的粒-巨噬集落形成率(CFU-GM)进行了动态观察。结果: 经上述6种细胞因子培养20 d, 有核细胞总数增殖44倍, 液态扩增培养8 d后, CFU-GM比原代MNC增加14.74倍, 扩增18 d后, CFU-GM明显减少, 仅为原代MNC的6.42倍, 且集落小于前者。扩增培养至6～8 d时, CD34+细胞总数是原代MNC的127.79～196.40倍, 18 d时下降至101.51倍。结论： 外源性造血生长因子可使脐血CD34+细胞及CFU-GM产生明显的扩增效应。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R392.12
in vitro Expansion and Differentiation of Cord Blood Hemotopoietic Cells
Zhang Jianhua Tian Zhigang Zhang Cai Wang Junfu Sun Rui
(Shandong Cancer Biotherapy Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062 )
Abstract Objective: To explore the role of human hematopoietic growth factors (HGFs) in proliferation and differentiation of cord blood CD34+cells. Methods: Human cord blood mononuclear cells (MNC) were cultured with different combinations of HGFs (including rhIL-1, rhIL-3, rhIL-6, rhG-CSF, rhGM-CSF and rhSCF). The expansion folds of MNC, the changes of cellular surface markers by FACS, and CFU-GM of hematopoietic cells were observed. Results: The total nucleated cells expanded by 44 folds after cultured with 6 cytokines for 20 days. The number of CFU-GM increased by 14.74 folds after cultured in liquid for 8 days, but decreased heavily after 18 days. The total number of CD34+ cells increased by 127.79～196.40 folds at 6 to 8 day, but decreased to 101.51 folds at 18 day. Conclusion: Human hematopoietic growth factors can increase the expansion of cord blood CD34+ cells and CFU-GM significantly.
, 百拇医药
Key words hematopoietic growth factors; cord blood; expansion
脐血作为造血干/祖细胞的来源具有诸多优点, 应用前景广泛。采用多种细胞因子组合，建立大量扩增脐血造血干/祖细胞的培养体系，已逐渐成为人们关注的热点。本研究动态观察了脐血MNC经不同细胞因子组合刺激的增殖效应及CD34+细胞的分化特性。
1 材料与方法
1.1 标本采集及MNC制备
无菌采取健康足月产新鲜胎儿脐血, 肝素防凝, 经淋巴细胞分离液(比重1.077)2 000 r/min离心20 min, 取界面层MNC, 生理盐水洗2次备用。
1.2 造血生长因子
, 百拇医药
rhIL-1(Genzyme),rhIL-3(Sandos), rhIL-6(本室自制,比活性>2×108 U/mg), rhG-CSF(Kirin), rhGM-CSF(Sandos), rhSCF(Sandos)。
1.3 造血细胞体外扩增培养
IMDM(Gibco)中含10%人AB血清和不同的造血生长因子(终浓度分别为rhIL-1 5 ng/ml, rhIL-3 2 ng/ml，rhIL-6 300 U/ml，rhG-CSF 10 ng/ml，rhGM-CSF 200 U/ml，rhSCF 50 ng/ml)，脐血MNC浓度为4×105/ml。37℃，5%CO2孵箱中培养, 分别于8, 11, 15, 20 d传代或换液，并计有核细胞数量。
不同细胞因子组合为:
, 百拇医药
(1) rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF
(2) rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF
(3) rhIL-1+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF
(4) rhIL-1+rhIL-3+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF
(5) rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhGM-CSF+rhSCF
(6) rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhSCF
(7) rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF
, 百拇医药
1.4 扩增前后CFU-GM培养
分别取原代脐血MNC和扩增至4， 6， 8， 11， 14， 18 d的细胞, 加入含10%人AB血清, 10%马血清, 0.3%琼脂的IMDM中, 造血生长因子终浓度分别为: rhIL-3 2 ng/ml， rhGM-CSF 200 U/ml， 细胞1×105/ml, 混匀接种于12孔板中, 1 ml/孔, 3复孔, 37℃, 5%CO2孵箱中培养8 d, 甲醇固定, 取出半固体凉干, Giemsa染色, 普通光镜计数>50个细胞的集落。
1.5 细胞表面标志分析
将经 rhIL-1，rhIL-3，rhIL-6，rhG-CSF，rhGM-CSF和rhSCF刺激扩增至6， 8， 11， 14， 18 d的细胞和培养前的MNC进行流式细胞仪(FACScan, BD公司)检测。 标记抗体分别为: FITC结合的CD34抗体和FITC/PE结合的CD34/CD38双标记抗体(Pharmingen), 并设FITC结合的小鼠 IgG(BD公司)为对照。 取各样本5×105细胞, 加入上述抗体(1∶10), 4℃孵育30 min, 洗涤重悬后上样测试。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 不同造血生长因子组合对脐血MNC的扩增效应
如表1所示，脐血MNC经细胞因子不同组合分别培养，观察有核细胞增殖倍数，结果证明，含rhSCF的组合具有较强的增殖能力，其中含rhIL-1，rhIL-3，rhIL-6，rhGM-CSF，rhG-CSF和rhSCF 6种细胞因子的组合在8，11，15和20 d时增殖倍数可分别达7，20，36和44倍。
2.2 扩增前后CFU-GM培养
扩增前原代脐血MNC和经rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF刺激液态扩增培养后CFU-GM的动态变化见表2。
经上述6种造血生长因子扩增至8 d, CFU-GM扩增倍数最高, 是脐血MNC的14.74倍, 且多以>100个细胞的大集落为主, 11 d时CFU-GM扩增倍数开始下降, 18 d时仅为5.98倍, 所形成的集落明显小于8 d时。表明CFU-GM的增殖高峰在第2周, 第3周下降明显。
, 百拇医药
2.3 扩增前后细胞表面标志分析
表3显示经造血生长因子刺激, 脐血MNC扩增前后CD34+细胞的动态变化。原代脐血MNC CD34+细胞仅为1.61%, 而扩增至6 d, CD34+细胞为34.29%达高峰。扩增至8 d,脐血造血细胞中CD34+细胞总数是原代MNC的196.40倍。18 d后CD34+细胞虽降为3.74%, 但仍高于原代MNC, CD34+细胞总数仍是后者的101.51倍。
表1 不同造血生长因子组合对脐血MNC的扩增效应
Tab.1 Effects of different combination of hematopoietic
factors on expansion of cord blood mononuclear cells Cytokines
, 百拇医药
Folds of amplification
Day 8
Day 11
Day 15
Day 20
IL-1,3,6,G,GM,SCF
7.00
20.00
36.00
44.00
IL-3,6,G,GM,SCF
5.00
, 百拇医药
15.50
28.00
40.00
IL-1,6,G,GM,SCF
5.00
15.00
28.00
32.00
IL-1,3,G,GM,SCF
5.50
15.60
28.00
, 百拇医药
37.50
IL-1,3,6,GM,SCF
5.00
15.50
27.50
36.00
IL-1,3,6,G,SCF
5.00
15.50
27.50
31.50
IL-1,3,6,G,GM
, http://www.100md.com
5.00
13.50
21.50
30.00
表2 脐血造血细胞扩增前后CFU-GM的动态变化
Tab.2 The dynamic changes of CFU-GM from cord blood
hemotopoietic cells after expansion Time
(days)
Total cell
number
, 百拇医药
CFU-GM
(1×105MNC)
Expansion
folds
0
1.00×106
127.00±76.27
1.00
4
2.08×106
408.67±18.15
, 百拇医药
6.68
6
6.00×106
257.00±42.34
12.14
8
1.20×107
156.67±19.55
14.74
11
2.00×107
82.67±18.21
, 百拇医药
13.02
14
2.72×107
60.00±14.20
12.85
18
4.07×107
18.67±6.66
5.98
表4显示扩增前后CD34+细胞亚群的变化, 在扩增至6 d时, CD34+/CD38-细胞为24.34%, CD34+/CD38+细胞为13.05%。18 d后, CD34+/CD38-细胞亚群则明显低于CD34+/CD38+亚群。表3 人脐血体外培养前后CD34+细胞的动态观察
, http://www.100md.com
Tab.3 The number of cord blood CD34+ cells
after expansion in vitro Time
(days)
CD34+ cells
(%)
Number of CD34+
cells
Expansion
folds
0
, http://www.100md.com
1.61
1.61×104
1.00
6
34.29
2.06×106
127.79
8
26.35
3.16×106
196.40
11
, 百拇医药
9.72
1.94×106
120.75
14
6.03
1.64×106
101.87
18
3.74
1.63×106
101.51
表4 人脐血体外培养前后CD34+细胞亚群的动态
, 百拇医药
Tab.4 The dynamic changes of phenotypes of cord blood
CD34+ subsets after cultiviation in vitro Time(days)
CD34+/CD38-(%)
CD34+/CD38+(%)
0
1.23
0.61
6
24.34
, http://www.100md.com
13.05
8
19.28
9.67
11
5.86
4.70
14
3.66
3.87
18
1.90
3.56
, 百拇医药
3 讨 论
脐血不仅含有丰富的干/祖细胞，对造血生长因子刺激的增殖效应亦优于骨髓干/祖细胞[1,2]。正常情况下造血干细胞处于相对静止期(G0期)，本研究利用早期激活因子(rhIL-6，rhIL-3，rhSCF和rhIL-1)、中期生长因子(rhIL-3，rhGM-CSF)和晚期系特异性生长因子(rhG-CSF)的不同组合对脐血干/祖细胞进行体外长期培养和扩增，结果表明，rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF组合对有核细胞的扩增效应明显优于其它组合，rhSCF在不同扩增体系中的作用尤为明显。体外液态扩增培养6～14 d后，细胞的CFU-GM总数可维持在原代MNC的12.14～12.85倍，18 d后迅速下降。经外源性造血生长因子作用6～8 d，干细胞初期分化产生的早期祖细胞显示了明显的扩增效应，CD34+细胞总数达到了原代MNC的127.79～196.40倍，11 d后逐渐下降，18 d时仍为101.51倍。同时，CD34+/CD38-细胞的比例不断减少，表明在CD34+细胞扩增至一定数量时也伴随着祖细胞的定向分化。如何达到既能扩增干细胞又能大量扩增造血祖细胞，以满足临床移植的需要仍是当前急待解决的难题[3]。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助项目和山东省自然科学基金项目
张建华,女,46岁,副主任技师,主要从事肿瘤免疫和实验血液学的研究
参 考 文 献
1，Hows JM, Marsh JC, Bradley BA, et al. Human cord blood: A source of transplantable stem cells? Bone Marrow Transplant, 1992, 9: 105
2，Hows JM, Bradley BA, Marsh JC, et al. Growth of human umbilical cord blood in long term haemopoietic cultures. Lancet, 1992, 340: 73
3，裴雪涛, 王立生, 徐 黎, 等. 造血生长因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用. 中华血液学杂志, 1996, 17 (6): 304
(1999-08-30收稿； 1999-12-06修回), 百拇医药
单位：张建华 田志刚 张彩 王郡甫 孙内(山东省医学科学院基础医学研究所山东肿瘤生物治疗研究中心 济南 250062)
关键词：造血生长因子；脐血；扩增
中国肿瘤生物治疗杂志000209
摘 要 目的： 了解造血生长因子的不同组合对人脐血CD34+细胞的扩增效应及分化特性。方法： 采用人脐血单个核细胞(MNC)经rhIL-1，rhIL-3，rhIL-6，rhG-CSF，rhGM-CSF和rhSCF的不同组合进行体外扩增培养, 动态观察了不同细胞因子组合对有核细胞总数的扩增数量,应用流式细胞技术(FACS)动态分析了造血细胞的表面标志, 并对液态扩增后造血细胞的粒-巨噬集落形成率(CFU-GM)进行了动态观察。结果: 经上述6种细胞因子培养20 d, 有核细胞总数增殖44倍, 液态扩增培养8 d后, CFU-GM比原代MNC增加14.74倍, 扩增18 d后, CFU-GM明显减少, 仅为原代MNC的6.42倍, 且集落小于前者。扩增培养至6～8 d时, CD34+细胞总数是原代MNC的127.79～196.40倍, 18 d时下降至101.51倍。结论： 外源性造血生长因子可使脐血CD34+细胞及CFU-GM产生明显的扩增效应。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R392.12
in vitro Expansion and Differentiation of Cord Blood Hemotopoietic Cells
Zhang Jianhua Tian Zhigang Zhang Cai Wang Junfu Sun Rui
(Shandong Cancer Biotherapy Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062 )
Abstract Objective: To explore the role of human hematopoietic growth factors (HGFs) in proliferation and differentiation of cord blood CD34+cells. Methods: Human cord blood mononuclear cells (MNC) were cultured with different combinations of HGFs (including rhIL-1, rhIL-3, rhIL-6, rhG-CSF, rhGM-CSF and rhSCF). The expansion folds of MNC, the changes of cellular surface markers by FACS, and CFU-GM of hematopoietic cells were observed. Results: The total nucleated cells expanded by 44 folds after cultured with 6 cytokines for 20 days. The number of CFU-GM increased by 14.74 folds after cultured in liquid for 8 days, but decreased heavily after 18 days. The total number of CD34+ cells increased by 127.79～196.40 folds at 6 to 8 day, but decreased to 101.51 folds at 18 day. Conclusion: Human hematopoietic growth factors can increase the expansion of cord blood CD34+ cells and CFU-GM significantly.
, 百拇医药
Key words hematopoietic growth factors; cord blood; expansion
脐血作为造血干/祖细胞的来源具有诸多优点, 应用前景广泛。采用多种细胞因子组合，建立大量扩增脐血造血干/祖细胞的培养体系，已逐渐成为人们关注的热点。本研究动态观察了脐血MNC经不同细胞因子组合刺激的增殖效应及CD34+细胞的分化特性。
1 材料与方法
1.1 标本采集及MNC制备
无菌采取健康足月产新鲜胎儿脐血, 肝素防凝, 经淋巴细胞分离液(比重1.077)2 000 r/min离心20 min, 取界面层MNC, 生理盐水洗2次备用。
1.2 造血生长因子
, 百拇医药
rhIL-1(Genzyme),rhIL-3(Sandos), rhIL-6(本室自制,比活性>2×108 U/mg), rhG-CSF(Kirin), rhGM-CSF(Sandos), rhSCF(Sandos)。
1.3 造血细胞体外扩增培养
IMDM(Gibco)中含10%人AB血清和不同的造血生长因子(终浓度分别为rhIL-1 5 ng/ml, rhIL-3 2 ng/ml，rhIL-6 300 U/ml，rhG-CSF 10 ng/ml，rhGM-CSF 200 U/ml，rhSCF 50 ng/ml)，脐血MNC浓度为4×105/ml。37℃，5%CO2孵箱中培养, 分别于8, 11, 15, 20 d传代或换液，并计有核细胞数量。
不同细胞因子组合为:
, 百拇医药
(1) rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF
(2) rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF
(3) rhIL-1+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF
(4) rhIL-1+rhIL-3+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF
(5) rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhGM-CSF+rhSCF
(6) rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhSCF
(7) rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF
, 百拇医药
1.4 扩增前后CFU-GM培养
分别取原代脐血MNC和扩增至4， 6， 8， 11， 14， 18 d的细胞, 加入含10%人AB血清, 10%马血清, 0.3%琼脂的IMDM中, 造血生长因子终浓度分别为: rhIL-3 2 ng/ml， rhGM-CSF 200 U/ml， 细胞1×105/ml, 混匀接种于12孔板中, 1 ml/孔, 3复孔, 37℃, 5%CO2孵箱中培养8 d, 甲醇固定, 取出半固体凉干, Giemsa染色, 普通光镜计数>50个细胞的集落。
1.5 细胞表面标志分析
将经 rhIL-1，rhIL-3，rhIL-6，rhG-CSF，rhGM-CSF和rhSCF刺激扩增至6， 8， 11， 14， 18 d的细胞和培养前的MNC进行流式细胞仪(FACScan, BD公司)检测。 标记抗体分别为: FITC结合的CD34抗体和FITC/PE结合的CD34/CD38双标记抗体(Pharmingen), 并设FITC结合的小鼠 IgG(BD公司)为对照。 取各样本5×105细胞, 加入上述抗体(1∶10), 4℃孵育30 min, 洗涤重悬后上样测试。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 不同造血生长因子组合对脐血MNC的扩增效应
如表1所示，脐血MNC经细胞因子不同组合分别培养，观察有核细胞增殖倍数，结果证明，含rhSCF的组合具有较强的增殖能力，其中含rhIL-1，rhIL-3，rhIL-6，rhGM-CSF，rhG-CSF和rhSCF 6种细胞因子的组合在8，11，15和20 d时增殖倍数可分别达7，20，36和44倍。
2.2 扩增前后CFU-GM培养
扩增前原代脐血MNC和经rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF刺激液态扩增培养后CFU-GM的动态变化见表2。
经上述6种造血生长因子扩增至8 d, CFU-GM扩增倍数最高, 是脐血MNC的14.74倍, 且多以>100个细胞的大集落为主, 11 d时CFU-GM扩增倍数开始下降, 18 d时仅为5.98倍, 所形成的集落明显小于8 d时。表明CFU-GM的增殖高峰在第2周, 第3周下降明显。
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2.3 扩增前后细胞表面标志分析
表3显示经造血生长因子刺激, 脐血MNC扩增前后CD34+细胞的动态变化。原代脐血MNC CD34+细胞仅为1.61%, 而扩增至6 d, CD34+细胞为34.29%达高峰。扩增至8 d,脐血造血细胞中CD34+细胞总数是原代MNC的196.40倍。18 d后CD34+细胞虽降为3.74%, 但仍高于原代MNC, CD34+细胞总数仍是后者的101.51倍。
表1 不同造血生长因子组合对脐血MNC的扩增效应
Tab.1 Effects of different combination of hematopoietic
factors on expansion of cord blood mononuclear cells Cytokines
, 百拇医药
Folds of amplification
Day 8
Day 11
Day 15
Day 20
IL-1,3,6,G,GM,SCF
7.00
20.00
36.00
44.00
IL-3,6,G,GM,SCF
5.00
, 百拇医药
15.50
28.00
40.00
IL-1,6,G,GM,SCF
5.00
15.00
28.00
32.00
IL-1,3,G,GM,SCF
5.50
15.60
28.00
, 百拇医药
37.50
IL-1,3,6,GM,SCF
5.00
15.50
27.50
36.00
IL-1,3,6,G,SCF
5.00
15.50
27.50
31.50
IL-1,3,6,G,GM
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5.00
13.50
21.50
30.00
表2 脐血造血细胞扩增前后CFU-GM的动态变化
Tab.2 The dynamic changes of CFU-GM from cord blood
hemotopoietic cells after expansion Time
(days)
Total cell
number
, 百拇医药
CFU-GM
(1×105MNC)
Expansion
folds
0
1.00×106
127.00±76.27
1.00
4
2.08×106
408.67±18.15
, 百拇医药
6.68
6
6.00×106
257.00±42.34
12.14
8
1.20×107
156.67±19.55
14.74
11
2.00×107
82.67±18.21
, 百拇医药
13.02
14
2.72×107
60.00±14.20
12.85
18
4.07×107
18.67±6.66
5.98
表4显示扩增前后CD34+细胞亚群的变化, 在扩增至6 d时, CD34+/CD38-细胞为24.34%, CD34+/CD38+细胞为13.05%。18 d后, CD34+/CD38-细胞亚群则明显低于CD34+/CD38+亚群。表3 人脐血体外培养前后CD34+细胞的动态观察
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Tab.3 The number of cord blood CD34+ cells
after expansion in vitro Time
(days)
CD34+ cells
(%)
Number of CD34+
cells
Expansion
folds
0
, http://www.100md.com
1.61
1.61×104
1.00
6
34.29
2.06×106
127.79
8
26.35
3.16×106
196.40
11
, 百拇医药
9.72
1.94×106
120.75
14
6.03
1.64×106
101.87
18
3.74
1.63×106
101.51
表4 人脐血体外培养前后CD34+细胞亚群的动态
, 百拇医药
Tab.4 The dynamic changes of phenotypes of cord blood
CD34+ subsets after cultiviation in vitro Time(days)
CD34+/CD38-(%)
CD34+/CD38+(%)
0
1.23
0.61
6
24.34
, http://www.100md.com
13.05
8
19.28
9.67
11
5.86
4.70
14
3.66
3.87
18
1.90
3.56
, 百拇医药
3 讨 论
脐血不仅含有丰富的干/祖细胞，对造血生长因子刺激的增殖效应亦优于骨髓干/祖细胞[1,2]。正常情况下造血干细胞处于相对静止期(G0期)，本研究利用早期激活因子(rhIL-6，rhIL-3，rhSCF和rhIL-1)、中期生长因子(rhIL-3，rhGM-CSF)和晚期系特异性生长因子(rhG-CSF)的不同组合对脐血干/祖细胞进行体外长期培养和扩增，结果表明，rhIL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF组合对有核细胞的扩增效应明显优于其它组合，rhSCF在不同扩增体系中的作用尤为明显。体外液态扩增培养6～14 d后，细胞的CFU-GM总数可维持在原代MNC的12.14～12.85倍，18 d后迅速下降。经外源性造血生长因子作用6～8 d，干细胞初期分化产生的早期祖细胞显示了明显的扩增效应，CD34+细胞总数达到了原代MNC的127.79～196.40倍，11 d后逐渐下降，18 d时仍为101.51倍。同时，CD34+/CD38-细胞的比例不断减少，表明在CD34+细胞扩增至一定数量时也伴随着祖细胞的定向分化。如何达到既能扩增干细胞又能大量扩增造血祖细胞，以满足临床移植的需要仍是当前急待解决的难题[3]。
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国家自然科学基金资助项目和山东省自然科学基金项目
张建华,女,46岁,副主任技师,主要从事肿瘤免疫和实验血液学的研究
参 考 文 献
1，Hows JM, Marsh JC, Bradley BA, et al. Human cord blood: A source of transplantable stem cells? Bone Marrow Transplant, 1992, 9: 105
2，Hows JM, Bradley BA, Marsh JC, et al. Growth of human umbilical cord blood in long term haemopoietic cultures. Lancet, 1992, 340: 73
3，裴雪涛, 王立生, 徐 黎, 等. 造血生长因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用. 中华血液学杂志, 1996, 17 (6): 304
(1999-08-30收稿； 1999-12-06修回), 百拇医药