原发性非小细胞肺癌P16基因的缺失及其临床意义
作者：王继旺 辛洪涛 侯林江 杨胥英 王磊
单位：王继旺(山东省高唐县医院)；辛洪涛(山东省立医院 济南250012)；侯林江(山东省高唐县医院)；杨胥英(山东省立医院 济南250012)；王磊(山东省立医院 济南250012)
关键词：肺癌；非小细胞；基因P16；基因缺失
原发性非小细胞肺癌P16基因的缺失及其临床意义 〔摘要〕 目的 探讨P16基因缺失与非小细胞肺癌病理类型、临床分期的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术，检测31例非小细胞肺癌及相应匹配癌旁正常组织中P16基因外显子2的缺失情况。结果 31例非小细胞肺癌组织中，7例P16基因纯合性缺失，缺失频率为22.6%。其中鳞癌6例，腺癌1例。7例缺失均为Ⅲ、Ⅳ期临床病例。结论 P16基因缺失可能在非小细胞肺癌的发生、发展中起作用，并与病理类型、临床分期有关。
, http://www.100md.com
〔中图分类号〕R734.2 〔文献标识码〕B
Deletion of P16 gene in non-small cell lung cancer
WANG Ji-wang,XIN Hong-tao,HOU Lin-jiang,et al
(Shandong Provicial Hospital,Jinan 250012)
〔Abstract〕 Objective To investigate the possible relationship between deletion of P16 gene and cellular type、clinical stages of non-small cell lung cancer.Methods A total of 31 non-small cell lung cancer tissue specimens and matched normal lung tissue was examined for deletion of P16 gene by polymerase chain reaction analysis.Results The homozygous deletion of the P16 gene in seven samples were confired by PCR with a 22.6% rate of P16 gene deletion,including 6 squamous carcinormas、1 adenocarcinomas.The seven patients with homozygous deletions were in stage Ⅲ or Ⅳ.Conclusions These data suggest that P16 gene alterations may play a role in the progression of human non-small cell lung cancer and have relationship with cellular type and clinic stages.
, 百拇医药
〔Key words〕 lung neoplasms;carcinoma;non-small cell;gene P16;gene deletion
现代肿瘤分子生物学及分子遗传学的发展已向人们揭示：癌组织的发生、发展与癌基因的升调节及抑癌基因的降调节之间平衡失调相关联[1]。新近发现并命名的抑癌基因P16，在人类多种恶性肿瘤中存在着不同形式的改变[2、3]而有关P16基因在非小细胞肺癌(Nonsmall cell lung cancer;NSCLC)中的研究国内报道甚少，我们应用聚合酶链式反应(PCR)技术对31例NSCLC标本进行了P16基因纯合性缺失检测，以了解P16基因缺失与NSCLC的组织病理类型、临床分期的关系。
材料与方法
一、标本来源：31例NSCLC癌变组织及相应匹配正常组织来自山东省立医院、山东省肿瘤防治院、山东医科大学附属医院住院病例手术切除标本，并经病理证实。获取标本后1小时内用液氮冷却，保存在-70℃冰箱中以备提取DNA。
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二、标本DNA提取：应用常规方法提取肿瘤细胞基因组DNA，在紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，取少量DNA以备PCR扩增。
三、引物设计：根据已知的P16基因序列，在第2外显子的两侧设计1对扩增引物。引物序列为：Ps1：5′-ACAAGCTTCCCTTCCGTCATGC-3′；Ps2：5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′。上述引物购自中国科学院微生物研究所。
四、PCR扩增：PCR反应混合液含1×PCR缓冲液、200μmol/L dNTp、1μmol/L扩增引物、200ng模板DNA，反应体积为50μl。混合后94℃变性4分钟，加1μ1Taq DNA聚合酶，上层覆盖石蜡油，在PE 9600扩增仪上进行如下循环：94℃变性40秒，58℃退火40秒，72℃延长1分钟，35个循环后72℃再延长7分钟。取10μl在2%琼脂糖凝胶上电泳分析并拍照。
五、统计方法：用四格表的确切概率法。
, 百拇医药
结果
一、PCR扩增结果：31例NSCLC癌组织中，有7例P16基因缺失扩增阳性，P16基因在NSCLC中的缺失频率为22.6%。
二、P16基因缺失与组织病理类型的关系：7例缺失标本中，鳞癌6例，腺癌1例，其缺失频率分别为33.3%和7.7%(见表1)。
表1 P16基因外显子2缺失与组织病理类型关系
病理学
类型
例数
P16基因外显子2
阳性缺失数
P16基因外显子2
, http://www.100md.com
阴性缺失数
缺失频率
(%)
鳞癌
18
6
12
33.3*
腺癌
13
1
12
7.7*
, http://www.100md.com
合计
31
7
24
22.6
*P=0.0245
三、P16基因缺失与临床分期的关系：31例原发性NSCLC病例，按WHO标准TNM进行分期，其中Ⅲ、Ⅳ期病例19例，Ⅰ、Ⅱ期12例(见表2)。
表2 P16基因外显子2缺失与临床分期关系
临床
分期
例数
, http://www.100md.com
P16基因外显子2
阳性缺失数
P16基因外显子2
阴性缺失数
缺失频率
(%)
Ⅰ或Ⅱ
12
0
12
0*
Ⅲ或Ⅳ
19
, http://www.100md.com
7
12
36.8*
合 计
31
7
24
22.6
*P=0.0261
讨论
P16基因表达产物-P16蛋白是迄今为止人类发现的第一个最直接的抑制肿瘤发生的细胞固有成分，它与许多肿瘤的发生发展密切相关，是细胞增殖周期的调节和抑制者[4、5]。有学者将野生型P16基因导入P16基因缺失的肿瘤细胞系中，能明显抑制肿瘤细胞的生长[3]。因此，P16基因已被人们普遍认为是一个重要的多重肿瘤抑制基因。
, 百拇医药
P16基因的抑癌机理与细胞周期的调控密切相关。体外研究证实P16蛋白能特异地抑制CDK4的活性，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖[4、6]。近年来有关P16基因在肿瘤中的异常国外已有大量报道，并存有争议。Shapiro等[7]用Southern印迹方法检测了27例NSCLC肿瘤组织，仅发现2例纯合性缺失(7.4%)，而Kelley等[8]的结果为23%，其原因是由于检测方法、标本选择及实验条件的不同而有所差异。Okamoto等[9]用Southern印迹方法检测了22例有转移的NSCLC，4例纯合性缺失(18.2%)，而在25例未有转移的原发性NSCLC肿瘤组织仅有1例缺失(4%)，其原因是P16基因缺失与肿瘤的转移和病程进展有密切关系，提示它在不同类型肿瘤的发生发展中可能起着不同的作用，可能是肿瘤发生发展的晚期事件[10]。
本文采用PCR技术检测的31例NSCLC标本，7例缺失，缺失频率为22.6%，与国外文献报道相一致[8]。进一步证实了中国人原发性NSCLC的发生、发展与P16基因失活相关。同时也表明P16基因纯合性缺失与组织病理类型、临床分期有关。7例缺失病例，6例为鳞癌(33.3%)，1例为腺癌(7.7%)差异显著(P<0.05)。7例缺失病例均为临床Ⅲ、Ⅳ，与ⅠⅡ期相比有显著差异(P<0.05)。从初步的实验结果可以看出，P16基因缺失在不同的组织病理类型中所起的作用不同，且多见于晚期病例，说明P16基因缺失在NSCLC病程进展中起一定的作用，但能否作为一种预后指标，则有待于进一步的研究和临床观察。
, 百拇医药
(本工作在山东医科大学遗传实验室完成，感谢龚瑶琴副教授所提供的工作条件及指导)
作者简介：王继旺(1966-)，男，硕士，主治医师，从事呼吸内科专业。
参考文献
1，赵丽，赵晓航，吴晏.P16(MTS1)，一个新的引人注目的抑癌基因科学，1996；3：51
2，Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al.Deletion of the cyclin-dependent kinase 4 in multiple human cancer.Nature,1994；368:753
3，Arap W,Nishikama k,Furnari FB,et al.Replacement of the p16/CDKN2 gene suppress human glioma cell growth.Cancer Res,1995；55:1351
, 百拇医药
4，Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CKD4.Nature,1993；366:704
5，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994；264:436
6，David CS,Lisa V.Characterization of chromosome 9 in human ovarian neoplasm identifies frequent genetic imbalance on 9q and rare alterations involoving 9q,including CDNK2.Cancer Res,1995；15(55):2150
, 百拇医药
7，shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al.Reciprocal Rb inactivation and p16INK4 expression in primary lung cancers and cell lines.Cancer Res,1995；55:505
8，Kelley MJ, Nakagawa K, Stinberg SM, et al.Differenrial inactivation of CDNK2 and Rb protein in non-small-cell and small-cell lung cancer cell lines.J.Natl.Cancer.Int,1995；87(10):756
9，Okamoto A,Hussain SP,Hagiwara K,et al.Mutations in the p16INK4/MTS1/CDNK2,p15INK4B/MTS2,and p18 genes in primary and metastative lung cancer.Cancer Res.1995；55:1448
10，傅松滨综述，李濮审校.多重肿瘤抑制基因MST1/P16/CDKS与细胞周期调节.国外医学.遗传学分册，1996；19：6
收稿日期：1999-5-31, 百拇医药
单位：王继旺(山东省高唐县医院)；辛洪涛(山东省立医院 济南250012)；侯林江(山东省高唐县医院)；杨胥英(山东省立医院 济南250012)；王磊(山东省立医院 济南250012)
关键词：肺癌；非小细胞；基因P16；基因缺失
原发性非小细胞肺癌P16基因的缺失及其临床意义 〔摘要〕 目的 探讨P16基因缺失与非小细胞肺癌病理类型、临床分期的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术，检测31例非小细胞肺癌及相应匹配癌旁正常组织中P16基因外显子2的缺失情况。结果 31例非小细胞肺癌组织中，7例P16基因纯合性缺失，缺失频率为22.6%。其中鳞癌6例，腺癌1例。7例缺失均为Ⅲ、Ⅳ期临床病例。结论 P16基因缺失可能在非小细胞肺癌的发生、发展中起作用，并与病理类型、临床分期有关。
, http://www.100md.com
〔中图分类号〕R734.2 〔文献标识码〕B
Deletion of P16 gene in non-small cell lung cancer
WANG Ji-wang,XIN Hong-tao,HOU Lin-jiang,et al
(Shandong Provicial Hospital,Jinan 250012)
〔Abstract〕 Objective To investigate the possible relationship between deletion of P16 gene and cellular type、clinical stages of non-small cell lung cancer.Methods A total of 31 non-small cell lung cancer tissue specimens and matched normal lung tissue was examined for deletion of P16 gene by polymerase chain reaction analysis.Results The homozygous deletion of the P16 gene in seven samples were confired by PCR with a 22.6% rate of P16 gene deletion,including 6 squamous carcinormas、1 adenocarcinomas.The seven patients with homozygous deletions were in stage Ⅲ or Ⅳ.Conclusions These data suggest that P16 gene alterations may play a role in the progression of human non-small cell lung cancer and have relationship with cellular type and clinic stages.
, 百拇医药
〔Key words〕 lung neoplasms;carcinoma;non-small cell;gene P16;gene deletion
现代肿瘤分子生物学及分子遗传学的发展已向人们揭示：癌组织的发生、发展与癌基因的升调节及抑癌基因的降调节之间平衡失调相关联[1]。新近发现并命名的抑癌基因P16，在人类多种恶性肿瘤中存在着不同形式的改变[2、3]而有关P16基因在非小细胞肺癌(Nonsmall cell lung cancer;NSCLC)中的研究国内报道甚少，我们应用聚合酶链式反应(PCR)技术对31例NSCLC标本进行了P16基因纯合性缺失检测，以了解P16基因缺失与NSCLC的组织病理类型、临床分期的关系。
材料与方法
一、标本来源：31例NSCLC癌变组织及相应匹配正常组织来自山东省立医院、山东省肿瘤防治院、山东医科大学附属医院住院病例手术切除标本，并经病理证实。获取标本后1小时内用液氮冷却，保存在-70℃冰箱中以备提取DNA。
, http://www.100md.com
二、标本DNA提取：应用常规方法提取肿瘤细胞基因组DNA，在紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，取少量DNA以备PCR扩增。
三、引物设计：根据已知的P16基因序列，在第2外显子的两侧设计1对扩增引物。引物序列为：Ps1：5′-ACAAGCTTCCCTTCCGTCATGC-3′；Ps2：5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′。上述引物购自中国科学院微生物研究所。
四、PCR扩增：PCR反应混合液含1×PCR缓冲液、200μmol/L dNTp、1μmol/L扩增引物、200ng模板DNA，反应体积为50μl。混合后94℃变性4分钟，加1μ1Taq DNA聚合酶，上层覆盖石蜡油，在PE 9600扩增仪上进行如下循环：94℃变性40秒，58℃退火40秒，72℃延长1分钟，35个循环后72℃再延长7分钟。取10μl在2%琼脂糖凝胶上电泳分析并拍照。
五、统计方法：用四格表的确切概率法。
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结果
一、PCR扩增结果：31例NSCLC癌组织中，有7例P16基因缺失扩增阳性，P16基因在NSCLC中的缺失频率为22.6%。
二、P16基因缺失与组织病理类型的关系：7例缺失标本中，鳞癌6例，腺癌1例，其缺失频率分别为33.3%和7.7%(见表1)。
表1 P16基因外显子2缺失与组织病理类型关系
病理学
类型
例数
P16基因外显子2
阳性缺失数
P16基因外显子2
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阴性缺失数
缺失频率
(%)
鳞癌
18
6
12
33.3*
腺癌
13
1
12
7.7*
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合计
31
7
24
22.6
*P=0.0245
三、P16基因缺失与临床分期的关系：31例原发性NSCLC病例，按WHO标准TNM进行分期，其中Ⅲ、Ⅳ期病例19例，Ⅰ、Ⅱ期12例(见表2)。
表2 P16基因外显子2缺失与临床分期关系
临床
分期
例数
, http://www.100md.com
P16基因外显子2
阳性缺失数
P16基因外显子2
阴性缺失数
缺失频率
(%)
Ⅰ或Ⅱ
12
0
12
0*
Ⅲ或Ⅳ
19
, http://www.100md.com
7
12
36.8*
合 计
31
7
24
22.6
*P=0.0261
讨论
P16基因表达产物-P16蛋白是迄今为止人类发现的第一个最直接的抑制肿瘤发生的细胞固有成分，它与许多肿瘤的发生发展密切相关，是细胞增殖周期的调节和抑制者[4、5]。有学者将野生型P16基因导入P16基因缺失的肿瘤细胞系中，能明显抑制肿瘤细胞的生长[3]。因此，P16基因已被人们普遍认为是一个重要的多重肿瘤抑制基因。
, 百拇医药
P16基因的抑癌机理与细胞周期的调控密切相关。体外研究证实P16蛋白能特异地抑制CDK4的活性，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖[4、6]。近年来有关P16基因在肿瘤中的异常国外已有大量报道，并存有争议。Shapiro等[7]用Southern印迹方法检测了27例NSCLC肿瘤组织，仅发现2例纯合性缺失(7.4%)，而Kelley等[8]的结果为23%，其原因是由于检测方法、标本选择及实验条件的不同而有所差异。Okamoto等[9]用Southern印迹方法检测了22例有转移的NSCLC，4例纯合性缺失(18.2%)，而在25例未有转移的原发性NSCLC肿瘤组织仅有1例缺失(4%)，其原因是P16基因缺失与肿瘤的转移和病程进展有密切关系，提示它在不同类型肿瘤的发生发展中可能起着不同的作用，可能是肿瘤发生发展的晚期事件[10]。
本文采用PCR技术检测的31例NSCLC标本，7例缺失，缺失频率为22.6%，与国外文献报道相一致[8]。进一步证实了中国人原发性NSCLC的发生、发展与P16基因失活相关。同时也表明P16基因纯合性缺失与组织病理类型、临床分期有关。7例缺失病例，6例为鳞癌(33.3%)，1例为腺癌(7.7%)差异显著(P<0.05)。7例缺失病例均为临床Ⅲ、Ⅳ，与ⅠⅡ期相比有显著差异(P<0.05)。从初步的实验结果可以看出，P16基因缺失在不同的组织病理类型中所起的作用不同，且多见于晚期病例，说明P16基因缺失在NSCLC病程进展中起一定的作用，但能否作为一种预后指标，则有待于进一步的研究和临床观察。
, 百拇医药
(本工作在山东医科大学遗传实验室完成，感谢龚瑶琴副教授所提供的工作条件及指导)
作者简介：王继旺(1966-)，男，硕士，主治医师，从事呼吸内科专业。
参考文献
1，赵丽，赵晓航，吴晏.P16(MTS1)，一个新的引人注目的抑癌基因科学，1996；3：51
2，Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al.Deletion of the cyclin-dependent kinase 4 in multiple human cancer.Nature,1994；368:753
3，Arap W,Nishikama k,Furnari FB,et al.Replacement of the p16/CDKN2 gene suppress human glioma cell growth.Cancer Res,1995；55:1351
, 百拇医药
4，Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CKD4.Nature,1993；366:704
5，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994；264:436
6，David CS,Lisa V.Characterization of chromosome 9 in human ovarian neoplasm identifies frequent genetic imbalance on 9q and rare alterations involoving 9q,including CDNK2.Cancer Res,1995；15(55):2150
, 百拇医药
7，shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al.Reciprocal Rb inactivation and p16INK4 expression in primary lung cancers and cell lines.Cancer Res,1995；55:505
8，Kelley MJ, Nakagawa K, Stinberg SM, et al.Differenrial inactivation of CDNK2 and Rb protein in non-small-cell and small-cell lung cancer cell lines.J.Natl.Cancer.Int,1995；87(10):756
9，Okamoto A,Hussain SP,Hagiwara K,et al.Mutations in the p16INK4/MTS1/CDNK2,p15INK4B/MTS2,and p18 genes in primary and metastative lung cancer.Cancer Res.1995；55:1448
10，傅松滨综述，李濮审校.多重肿瘤抑制基因MST1/P16/CDKS与细胞周期调节.国外医学.遗传学分册，1996；19：6
收稿日期：1999-5-31, 百拇医药