胸腺瘤中p53、Bcl-2蛋白表达及其临床意义
作者：吴涛 涂来慧 张仁琴 吴晓华 詹溶洲 倪仙荣
单位：吴涛(第二军医大学附属长海医院神经科 上海 200433)；涂来慧(第二军医大学附属长海医院神经科 上海 200433)；张仁琴(第二军医大学附属长海医院神经科 上海 200433)；吴晓华(第二军医大学附属长海医院神经科 上海 200433)；詹溶洲(第二军医大学附属长海医院病理科 上海 200433)；倪仙荣(第二军医大学附属长海医院病理科 上海 200433)
关键词：胸腺瘤；分类；免疫组化；p53；Bcl-2
胸腺瘤中p53 〔摘要〕 目的 研究p53和Bcl-2蛋白在胸腺瘤中表达及其临床意义。方法 应用免疫组化染色方法观察胸腺瘤中p53、Bcl-2蛋白表达阳性细胞密度和分布。结果 51例胸腺瘤中41例p53蛋白表达阳性(80.4%)，p53表达与胸腺瘤浸润性密切相关，23例浸润性胸腺瘤中16例p53蛋白高度表达，而28例非浸润性胸腺瘤仅2例高度表达(P<0.01)；梭形细胞型胸腺瘤Bcl-2蛋白均为阳性。结论 提示p53表达异常发生于胸腺瘤的早期，其表达异常可作为判断胸腺瘤病变性质的指标。梭形细胞型胸腺瘤可能来源于正常胸腺髓质上皮细胞。
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〔中图分类号〕 R736.3；R730.3 〔文献标识码〕B
Expressions of p53,Bcl-2 protein in thymomas and their clinical values
WU Tao,TU Lai-hui,ZHANG Ren-qin,et al
(Department of Neurology,Changhai hospital of the Second military medical University)
〔Abstract〕 Objective To study the expressions of p53 and Bcl-2 in thymomas and their clinical values.Methods p53 and Bcl-2 protein expressions in 54 thymomas were examined immunohistochemically.Results forty-one of the fifty-one thymomas were p53 protein posititve.The expression of p53 correlated with the invasion of thymomas,16 cases out of 23 invasive thymomas were high expressors(the p53-positive tumor cells >50%),whereas only 2 cases of 28 noninvasive thymomas were high expressors.Bcl-2 expression was highly associated with the spindle thymomas.Conclusions The high rate of p53 expressions in thymomas (80.4%) suggests that p53 may be implicated in initial stages of tumorigenesis.The expression of p53 protein is a good indicator for the prognosis of thymomas.The spindle thymoma perhaps relates to the medulary epithelial origins from thymus.
, 百拇医药
〔Key words〕 thymoma;classification;p53;Bcl-2;immunohistochemistry;
p53基因是肿瘤演发的重要基因之一，其主要生物学功能为引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和促进分化，降低突变细胞的发生机率，具有抑癌和致癌双重作用，关键在于生物功能的得失。原癌基因Bcl-2是调节细胞凋亡中一个重要的调节基因，通过抑制细胞内活性氧族的产生抑制细胞的凋亡，在上皮分化和肿瘤发生中具有广泛作用。本文研究p53和Bcl-2在胸腺瘤中的表达状态，探讨胸腺瘤的发生机制。
材料
一、标本和临床资料：选自我院1977～1998年间，手术切除的胸腺瘤51例，男30例，女21例，年龄20～70岁。其中35例伴有重症肌无力(68.6%)，1例伴发天疱疮。标本均石蜡包埋，4μm厚连续切片。
, http://www.100md.com 二、胸腺瘤分类和分期：51例胸腺瘤分为：上皮细胞为主型9例，淋巴细胞为主型29例，混合型10例，梭形细胞型3例。按Masaoka[1]等分期标准分为：Ⅰ期(包膜完整，无浸润)28例，Ⅱ期(大体观肿瘤浸润周围脂肪组织或镜下包膜浸润)9例，Ⅲ期(大体观肿瘤浸润生长到周围器官，如心包、大血管、肺等)14例，Ⅳ期(肿瘤胸腔内种植转移或淋巴、血源远处转移)0例。
三、试剂和仪器：鼠抗人p53单克隆抗体(DO-7)，丹麦DAKO公司。鼠抗人Bcl-2单克隆抗体(M887)，丹麦DAKO公司。生物素标记的兔抗鼠IgG血清1∶400稀释。S-P免疫组化试剂盒，丹麦DAKO公司。
实验方法
石蜡切片，厚4μm，常规脱蜡水化，3%H2O2甲醇溶孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性；微波修复10′；非免疫羊血清封闭10′；加鼠抗人p53或Bcl-2单抗(1∶40稀释)，4℃冰箱孵育过夜；生物素标记兔抗鼠IgG血清(1∶400稀释)，室温下孵育30′；链亲和素-过氧化物酶溶液(1∶400稀释)，室温下孵育10′；新鲜配制DAB溶液显色反应10分钟左右，镜下观察；蒸馏水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。对照：空白对照，以PBS代替一抗。阳性对照，肝癌、正常胸腺作为对照。
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结果的观察与判断
胸腺瘤来源于胸腺上皮细胞的肿瘤，故以胸腺上皮细胞为观察对象，高倍镜下随机观察10个以上染色良好区域，计数500个以上上皮细胞，p53细胞核染色为阳性细胞，Bcl-2胞浆染色为阳性细胞。算出p53和Bcl-2染色阳性的细胞百分数。大于10%为阳性，其中小于50%为低度表达，大于50%为高度表达。统计学处理：p53和Bcl-2表达程度比较，用X2检验。
结果
所有切片染色良好，背景清晰。p53蛋白阳性产物位于细胞核，呈棕黄色，弥漫型或颗粒型。其数量和分布呈异质性，部分肿瘤不同区域内阳性细胞数相差较大。正常胸腺上皮细胞偶有阳性(<1%)，淋巴细胞阴性。Bcl-2蛋白阳性产物位于胞浆，尤以核周明显，呈棕黄色，阳性上皮细胞散在或均匀分布，其间淋巴细胞阳性数量不等。正常胸腺髓质淋巴细胞大多数Bcl-2阳性，皮质中部分淋巴细胞阳性。
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51例胸腺瘤中，p53蛋白表达阴性10例，阳性41例，其中低度表达23例，高度表达18例。浸润性胸腺瘤p53蛋白高度表达明显高于良性胸腺瘤(P<0.01，见表2)。p53表达与浸润程度明显相关，当胸腺瘤浸润周围器官时(Masaoka分期Ⅲ期)p53高度表达者明显多于非浸润性或仅浸润包膜及周围脂肪组织(P<0.01，见表2)。Bcl-2阳性8例(见表1)，其中Masaoka分期Ⅰ期6例，Ⅱ期2例，Bcl-2表达与浸润无相关性(P>0.05)；Bcl-2阳性病例中4例p53阴性、2例低度表达、2例高度表达。
表1 胸腺瘤分类中各亚型p53和Bcl-2蛋白表达
分型
p53蛋白表达
Bcl-2蛋白表达
阴性
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低度
高度
阴性
阳性
TE
2
2
5
8
1
TL
4
15
10
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26
3
TM
2
5
3
9
1
TS
2
1
0
0
3
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总计
10
23
18
43
8
注：TE：上皮细胞为主型 TL：淋巴细胞为主型 TM：混合细胞型 TS：梭形细胞型 表2 Masaoka分期各期胸腺瘤中p53蛋白表达
分期
阴性
低度
高度
总计
, http://www.100md.com
Ⅰ
9
17
2
28
Ⅱ
1
6
2
9
Ⅲ
0
0
14
, 百拇医药
14
讨论
p53基因突变在人类肿瘤的发生过程中具有重要作用[2]。野生型p53基因表达蛋白具有监视细胞基因组完整性的功能，当DNA发生损伤或缺陷时，p53可上调p21/WAF1，后者具有抑制细胞周期素/细胞周期依赖性激酶(CDK)底物磷酸化作用，导致G1期阻滞，使细胞赢得时间，在进入S期之前修复损伤的DNA；如修复失败，则通过诱导细胞凋亡途径将其清除，从而防止具有癌变倾向的细胞在体内存活。当p53基因发生突变后，生物活性丧失，干扰共表达的野生型p53功能。突变型p53基因为致癌基因，有增殖、转化和致癌潜能。野生型p53蛋白半衰期短，不能用免疫组化方法测出，而突变型半衰期延长，可以用免疫组化方法检出[3]，因此，免疫组化方法检出的p53蛋白大多数属突变型。本研究用p53单抗DO-7(识别野生型和突变型p53蛋白45-54氨基酸残基)对胸腺瘤进行免疫组化研究，结果51例胸腺瘤中41例阳性，p53表达程度与肿瘤浸润程度明显相关。胸腺瘤包膜完整者，p53表达水平较低，当胸腺瘤浸润周围器官时，p53表达明显增高，结果显示p53表达与肿瘤浸润明显相关，与Tateyama[4]和Hayashi[5]等研究结果基本相同。本组51例胸腺瘤即使包膜完整p53阳性率也较高(19/28)，提示p53表达异常发生在胸腺瘤形成的早期。
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原癌基因Bcl-2是调控细胞凋亡途径中一个重要的调节基因[6]，其表达的Bcl-2蛋白是一种26KD的细胞膜蛋白，主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上，是一种抗氧化剂，通过抑制细胞内活性氧族的产生，从而抑制细胞凋亡，并不促进细胞增殖。Bcl-2在上皮细胞恶性肿瘤中表达变化很大[7]，在前列腺癌中，Bcl-2表达与激素治疗耐药和复发相关，而肺癌和乳腺癌则预后良好。LeBum[8]等研究发现在胎儿胸腺髓质中大部分细胞表达Bcl-2，而皮质区仅少数细胞表达Bcl-2。本研究发现梭形细胞型胸腺瘤Bcl-2均为阳性，提示胸腺瘤梭形细胞可能来源于正常胸腺髓质上皮细胞[9]。
作者简介：吴涛(1964-)，男，辽宁大连人，硕士，主治医师，讲师，从事神经病学专业，重症肌无力研究。
参考文献
1，masaoka A,Monden Y,Nakahara K,et al.Follow-up study of thymomas with special reference to their clinical stages.Cancer 1981；48:2485-2492
, http://www.100md.com
2，Harris CC and Hollstein M.Clinical implications of the p53 tumor-suppressor gene.N Eng J Med 1993；329:1318-1327
3，Editoral p53 in tumour pathology can we trust immunohistochemisty?-revisited! J Pathol,1994；172:1-4
4，Tateyama H,Eimoto T,Tada T,et al.p53 protein expression and p53 mutation in thymic epithelial tumours.Am J Clin Pathol,1995；104:375-381
5，Hayashi Y,Ishii N,Obayashi C,et al.Virchows Archiv,1995；426:43-50
, 百拇医药
6，Kroemer G.The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis.The mechanism of Bcl-2 provides clues for therapeutic interventions.Nature Med 1997；3:614-620
7，Lu QL,Abel P,Foster CS,et al.Bcl-2 Role in epithelial differentiation and oncogenesis. Hum Pathol,1996；27:102-110
8，Leburn DP,Warnke RA,Cleary ML.Expression of Bcl-2 in fetal tissues suggests a role in morphogenesis.Am J Pathol,1993；142:743-753
9，Brocheriou I, Carnot F, Briere F. Immunohistochemical detection of Bcl-2 protein in thymoma.Histopathol,1995；27:251-255
收稿日期：1999-5-31, 百拇医药
单位：吴涛(第二军医大学附属长海医院神经科 上海 200433)；涂来慧(第二军医大学附属长海医院神经科 上海 200433)；张仁琴(第二军医大学附属长海医院神经科 上海 200433)；吴晓华(第二军医大学附属长海医院神经科 上海 200433)；詹溶洲(第二军医大学附属长海医院病理科 上海 200433)；倪仙荣(第二军医大学附属长海医院病理科 上海 200433)
关键词：胸腺瘤；分类；免疫组化；p53；Bcl-2
胸腺瘤中p53 〔摘要〕 目的 研究p53和Bcl-2蛋白在胸腺瘤中表达及其临床意义。方法 应用免疫组化染色方法观察胸腺瘤中p53、Bcl-2蛋白表达阳性细胞密度和分布。结果 51例胸腺瘤中41例p53蛋白表达阳性(80.4%)，p53表达与胸腺瘤浸润性密切相关，23例浸润性胸腺瘤中16例p53蛋白高度表达，而28例非浸润性胸腺瘤仅2例高度表达(P<0.01)；梭形细胞型胸腺瘤Bcl-2蛋白均为阳性。结论 提示p53表达异常发生于胸腺瘤的早期，其表达异常可作为判断胸腺瘤病变性质的指标。梭形细胞型胸腺瘤可能来源于正常胸腺髓质上皮细胞。
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〔中图分类号〕 R736.3；R730.3 〔文献标识码〕B
Expressions of p53,Bcl-2 protein in thymomas and their clinical values
WU Tao,TU Lai-hui,ZHANG Ren-qin,et al
(Department of Neurology,Changhai hospital of the Second military medical University)
〔Abstract〕 Objective To study the expressions of p53 and Bcl-2 in thymomas and their clinical values.Methods p53 and Bcl-2 protein expressions in 54 thymomas were examined immunohistochemically.Results forty-one of the fifty-one thymomas were p53 protein posititve.The expression of p53 correlated with the invasion of thymomas,16 cases out of 23 invasive thymomas were high expressors(the p53-positive tumor cells >50%),whereas only 2 cases of 28 noninvasive thymomas were high expressors.Bcl-2 expression was highly associated with the spindle thymomas.Conclusions The high rate of p53 expressions in thymomas (80.4%) suggests that p53 may be implicated in initial stages of tumorigenesis.The expression of p53 protein is a good indicator for the prognosis of thymomas.The spindle thymoma perhaps relates to the medulary epithelial origins from thymus.
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〔Key words〕 thymoma;classification;p53;Bcl-2;immunohistochemistry;
p53基因是肿瘤演发的重要基因之一，其主要生物学功能为引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和促进分化，降低突变细胞的发生机率，具有抑癌和致癌双重作用，关键在于生物功能的得失。原癌基因Bcl-2是调节细胞凋亡中一个重要的调节基因，通过抑制细胞内活性氧族的产生抑制细胞的凋亡，在上皮分化和肿瘤发生中具有广泛作用。本文研究p53和Bcl-2在胸腺瘤中的表达状态，探讨胸腺瘤的发生机制。
材料
一、标本和临床资料：选自我院1977～1998年间，手术切除的胸腺瘤51例，男30例，女21例，年龄20～70岁。其中35例伴有重症肌无力(68.6%)，1例伴发天疱疮。标本均石蜡包埋，4μm厚连续切片。
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三、试剂和仪器：鼠抗人p53单克隆抗体(DO-7)，丹麦DAKO公司。鼠抗人Bcl-2单克隆抗体(M887)，丹麦DAKO公司。生物素标记的兔抗鼠IgG血清1∶400稀释。S-P免疫组化试剂盒，丹麦DAKO公司。
实验方法
石蜡切片，厚4μm，常规脱蜡水化，3%H2O2甲醇溶孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性；微波修复10′；非免疫羊血清封闭10′；加鼠抗人p53或Bcl-2单抗(1∶40稀释)，4℃冰箱孵育过夜；生物素标记兔抗鼠IgG血清(1∶400稀释)，室温下孵育30′；链亲和素-过氧化物酶溶液(1∶400稀释)，室温下孵育10′；新鲜配制DAB溶液显色反应10分钟左右，镜下观察；蒸馏水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。对照：空白对照，以PBS代替一抗。阳性对照，肝癌、正常胸腺作为对照。
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结果的观察与判断
胸腺瘤来源于胸腺上皮细胞的肿瘤，故以胸腺上皮细胞为观察对象，高倍镜下随机观察10个以上染色良好区域，计数500个以上上皮细胞，p53细胞核染色为阳性细胞，Bcl-2胞浆染色为阳性细胞。算出p53和Bcl-2染色阳性的细胞百分数。大于10%为阳性，其中小于50%为低度表达，大于50%为高度表达。统计学处理：p53和Bcl-2表达程度比较，用X2检验。
结果
所有切片染色良好，背景清晰。p53蛋白阳性产物位于细胞核，呈棕黄色，弥漫型或颗粒型。其数量和分布呈异质性，部分肿瘤不同区域内阳性细胞数相差较大。正常胸腺上皮细胞偶有阳性(<1%)，淋巴细胞阴性。Bcl-2蛋白阳性产物位于胞浆，尤以核周明显，呈棕黄色，阳性上皮细胞散在或均匀分布，其间淋巴细胞阳性数量不等。正常胸腺髓质淋巴细胞大多数Bcl-2阳性，皮质中部分淋巴细胞阳性。
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51例胸腺瘤中，p53蛋白表达阴性10例，阳性41例，其中低度表达23例，高度表达18例。浸润性胸腺瘤p53蛋白高度表达明显高于良性胸腺瘤(P<0.01，见表2)。p53表达与浸润程度明显相关，当胸腺瘤浸润周围器官时(Masaoka分期Ⅲ期)p53高度表达者明显多于非浸润性或仅浸润包膜及周围脂肪组织(P<0.01，见表2)。Bcl-2阳性8例(见表1)，其中Masaoka分期Ⅰ期6例，Ⅱ期2例，Bcl-2表达与浸润无相关性(P>0.05)；Bcl-2阳性病例中4例p53阴性、2例低度表达、2例高度表达。
表1 胸腺瘤分类中各亚型p53和Bcl-2蛋白表达
分型
p53蛋白表达
Bcl-2蛋白表达
阴性
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低度
高度
阴性
阳性
TE
2
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TM
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TS
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总计
10
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注：TE：上皮细胞为主型 TL：淋巴细胞为主型 TM：混合细胞型 TS：梭形细胞型 表2 Masaoka分期各期胸腺瘤中p53蛋白表达
分期
阴性
低度
高度
总计
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Ⅰ
9
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2
28
Ⅱ
1
6
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Ⅲ
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讨论
p53基因突变在人类肿瘤的发生过程中具有重要作用[2]。野生型p53基因表达蛋白具有监视细胞基因组完整性的功能，当DNA发生损伤或缺陷时，p53可上调p21/WAF1，后者具有抑制细胞周期素/细胞周期依赖性激酶(CDK)底物磷酸化作用，导致G1期阻滞，使细胞赢得时间，在进入S期之前修复损伤的DNA；如修复失败，则通过诱导细胞凋亡途径将其清除，从而防止具有癌变倾向的细胞在体内存活。当p53基因发生突变后，生物活性丧失，干扰共表达的野生型p53功能。突变型p53基因为致癌基因，有增殖、转化和致癌潜能。野生型p53蛋白半衰期短，不能用免疫组化方法测出，而突变型半衰期延长，可以用免疫组化方法检出[3]，因此，免疫组化方法检出的p53蛋白大多数属突变型。本研究用p53单抗DO-7(识别野生型和突变型p53蛋白45-54氨基酸残基)对胸腺瘤进行免疫组化研究，结果51例胸腺瘤中41例阳性，p53表达程度与肿瘤浸润程度明显相关。胸腺瘤包膜完整者，p53表达水平较低，当胸腺瘤浸润周围器官时，p53表达明显增高，结果显示p53表达与肿瘤浸润明显相关，与Tateyama[4]和Hayashi[5]等研究结果基本相同。本组51例胸腺瘤即使包膜完整p53阳性率也较高(19/28)，提示p53表达异常发生在胸腺瘤形成的早期。
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原癌基因Bcl-2是调控细胞凋亡途径中一个重要的调节基因[6]，其表达的Bcl-2蛋白是一种26KD的细胞膜蛋白，主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上，是一种抗氧化剂，通过抑制细胞内活性氧族的产生，从而抑制细胞凋亡，并不促进细胞增殖。Bcl-2在上皮细胞恶性肿瘤中表达变化很大[7]，在前列腺癌中，Bcl-2表达与激素治疗耐药和复发相关，而肺癌和乳腺癌则预后良好。LeBum[8]等研究发现在胎儿胸腺髓质中大部分细胞表达Bcl-2，而皮质区仅少数细胞表达Bcl-2。本研究发现梭形细胞型胸腺瘤Bcl-2均为阳性，提示胸腺瘤梭形细胞可能来源于正常胸腺髓质上皮细胞[9]。
作者简介：吴涛(1964-)，男，辽宁大连人，硕士，主治医师，讲师，从事神经病学专业，重症肌无力研究。
参考文献
1，masaoka A,Monden Y,Nakahara K,et al.Follow-up study of thymomas with special reference to their clinical stages.Cancer 1981；48:2485-2492
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2，Harris CC and Hollstein M.Clinical implications of the p53 tumor-suppressor gene.N Eng J Med 1993；329:1318-1327
3，Editoral p53 in tumour pathology can we trust immunohistochemisty?-revisited! J Pathol,1994；172:1-4
4，Tateyama H,Eimoto T,Tada T,et al.p53 protein expression and p53 mutation in thymic epithelial tumours.Am J Clin Pathol,1995；104:375-381
5，Hayashi Y,Ishii N,Obayashi C,et al.Virchows Archiv,1995；426:43-50
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6，Kroemer G.The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis.The mechanism of Bcl-2 provides clues for therapeutic interventions.Nature Med 1997；3:614-620
7，Lu QL,Abel P,Foster CS,et al.Bcl-2 Role in epithelial differentiation and oncogenesis. Hum Pathol,1996；27:102-110
8，Leburn DP,Warnke RA,Cleary ML.Expression of Bcl-2 in fetal tissues suggests a role in morphogenesis.Am J Pathol,1993；142:743-753
9，Brocheriou I, Carnot F, Briere F. Immunohistochemical detection of Bcl-2 protein in thymoma.Histopathol,1995；27:251-255
收稿日期：1999-5-31, 百拇医药