外周血PMN激活吞噬化学发光与原发性肝癌患者免疫功能变化
作者：曹锐 马文书 李天星
单位：曹锐(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤科 重庆 400042)；马文书(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤科 重庆 400042)；李天星(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤科 重庆 400042)
关键词：原发性肝癌；多形核白细胞；化学发光；细胞因子
外周血PMN激活吞噬化学发光与原发性肝癌患者免疫功能变化 〔摘要〕 目的 探讨外周血多形核白细胞化学发光(Polymorphonuclear-Chemilluminescence,PMN-CL)及细胞因子活性改变与原发性肝癌的发病机制关系。方法 采用液体闪烁技术(LSC)体外激活PMN生成、释放过氧化阴离子，诱导吞噬作用产生化学发光，并应用ELISA及RIA检测相关指标IL-2、sIL-2R、IL-8、TNF、SOD，并以健康献血员为对照。结果 体内激活明显，基础CL升高(P<0.05)，最大峰值低下，峰时延迟(P<0.01)。相关指标IL-9、sIL-2R、TNF、SOD显著高于对照组(P<0.01)，IL-2低于对照组(P<0.05)。结论 原发性肝癌患者外周血PMN化学发光变化，客观反应了细胞免疫功能水平，以及超氧离子的生成、释放与损伤状态。对深入研究原发性肝癌的发病机理具有重要意义。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R735.7 〔文献标识码〕B
The PMN-CL and the change of immune function in patients with primary hepatic cancer
CAO Rui,MA Wen-shu,LI Ting-xing
(The Third Military Medical College Daping Hospital Research,Institute of Field Surgery,Chongqing 400042)
〔Abstract〕 Objective To explore the relationship of PMN-CL and the change of cytokines activity with pathogenesis of primary hepatic cancer.Methods The PMN-CL and IL-2,sIL-2R,Il-8 TNF and SOD in sera of 38 patients with primary hepatic cancer were detected by LSC(Liquid scintillation counting)、ELISA and RIA.Results The level of basic luminescence increased(P<0.05).Iym-induced phagoluminescence maximal peak value decreased.The peak time was delayed remarkably(P<0.01).At the same time,the sIL-2R、IL-8、TNF、SOD were significantly higher than those of normal control (P<0.01),IL-2 was lower than that of normal control (P<0.05).Conclusions The change of PMN-CL reflected the immunologic function of the patients and the state of production,release of hyperoxide anion which might be an important role in the research of pathogenesis of primary hepatic cancer.
, http://www.100md.com
〔Key words〕 primary hepatic cancer;cytokine;polymorphonuclear;chemilluminescence
PMN是人体外周血中主要的抗炎症细胞。近年来对PMN的吞噬化学发光研究表明，PMN-CL是反映细胞吞噬免疫功能的标志，是过氧化物离子生成释放致损伤的反应。本文研究原发性肝癌患者外周血PMN激活、依赖Luminal化学发光，诱吞噬探测极限CL值，并检测血清中相关指标IL-2、sIL-2R、IL-8、SOD以及TNF值的变化，现报道如下。
材料和方法
一、检测对象 38例原发性肝癌患者，男性28例，女性10例，中位年龄42.1±0.9岁。均符合1977年全国肝癌协作会议制订的临床标准[1]。20例健康献血员作为正常对照组，男性15例，女性5例，中位年龄37.5±1.8岁。
, 百拇医药
二、方法
1.仪器：FJ-2108细胞代谢液闪仪(262厂)，功能方式Ⅲ、测量方式Ⅳ、单光子辐射、KV0740调至仪器本底14CP/6s±2，并能敏感地对Luminal毫微摩尔浓度水平自然发光成数千倍放大。
2.Luminal(北京化工厂)：取20mg放入小烧杯，加入pH8.2 PBS 10ml，三乙胺一滴，磁搅拌18小时左右，过滤后-20℃保存，应用液计算稀释成10-4M。
3.PMN分离与浓度：肝素抗凝血用1∶1Hans平衡液(无酚红含1%小牛血清)稀释，分离装细胞分离液(比重1.077)，稀释血叠复于上面，中速离心15min，按常规提取法获得PMN，并按所需浓度稀释成悬液。
4.IL-2、sIL-2R、IL-8：ELISA双抗体夹心法，试剂盒由第四军医大学免疫教研室提供。
, 百拇医药
5.SOD：放射免疫分析法，药盒由成都同位素研究所提供。
6.TNF：试剂盒购自军事医学科学院北京邦定生物医药公司，方法按说明书操作。
结果
原发性肝癌患者PMN在体内呈被激活状态，基础化学发光值显著高于正常人对照组(P<0.05)，诱PMN吞噬酵母多糖依赖Luminal化学发光，最大峰值低下(P<0.05)。各组间PMN-CL值与分析见表1。
表1 原发性肝癌患者外周血PMN-CL测定结果
组 别
例数
本底
(cp/6s)
, 百拇医药
基础发光
(cp/6s)
Luminal
依赖发光
(sp/6s)
最大吞
噬发光
(cp/6s)
峰时/min
正常对照组
20
13±3
156±55
, 百拇医药
650±207
6892±1903
14±2
肝癌组
38
18±4*
288±102*
980±215*
4582±1705**
20±3*
*P<0.05 **P<0.01
, 百拇医药
SOD、IL-8、TNF、sIL-2R显著高于正常对照组(P<0.05～0.01)、IL-2显著低于正常对照组(P<0.05)，见表2。
表2 原发性肝癌血液细胞因子检测分析
组别
例数
IL-2
(ng/ml)
sIL-2R
(u/ml)
IL-8
(pg/ml)
TNF
, 百拇医药
(ng/ml)
SOD
(ng/ml)
正常对照组
20
19.8
±3.2
241.2
±91.3
215.3
±110.1
1.9
±0.8
, 百拇医药
300.1
±110.3
肝癌组
38
10.2
±2.5
852.3
±285.2
715.4
±88.3
5.1
±1.5
510.5
, http://www.100md.com
±160.2
P
<0.05
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
讨论
自Allen等[2]1972年发现PMN激活吞噬化学发光现象后，在研究细胞免疫机制与疾病关系、吞噬功能、细胞因子调节作用、介质生成释放等方面获得很大发展。已知发光强度的大小即反映PMN吞噬功能的强弱，又反映激活和生成氧衍生物的自由基情况。其中基础吞噬活性反映PMN在体内的预激活状态，最大吞噬活性反映经酵母多糖调理后所能达到的最大吞噬功能。本实验，Iym诱吞噬的最大峰值低下，峰时20分钟显示延迟，表明患者PMN对异物应答能力及细胞吞噬功能下降，机体调理作用失衡。基础发光总体水平升高，说明患者体内氧自由基释放增多，细胞损害加重。氧自由基的产生作为一种介质，在吞噬细胞活化、细胞毒和免疫调节中起一定作用，与造成组织损伤密切相关。SOD是一种抗氧化酶，化学本质仍属蛋白质，酶蛋白合成的增加和分泌加快了细胞内SOD的合成，这对加强体内氧化损伤的防护、控制病情发展、促进机体生理平衡有着积极作用。SOD减少或缺乏，会加重自由基对组织的损伤。本组SOD呈上升状态，机理尚不清楚，可能与机体的应激反应有关。
, 百拇医药
肝癌的发生与机体免疫应答状态、免疫调节功能失调密切相关，多种细胞因子如IL-8、IL-2、sIL-2R、TNF等在其发生发展中具有重要作用。本实验，IL-8、sIL-2R、TNF显著高于正常人，IL-2低于正常对照组，表明肝癌患者体内IL-8、TNF、sIL-2R的分泌调节功能紊乱，IL-2介导的免疫反应降低，机体抗肿瘤免疫功能减弱。研究表明，IL-2通过膜白介素2受体(mIL-2R)起作用，可溶性白介素2受体作为免疫封闭因子可与mIL-2R竞争结合IL-2，从而对机体免疫功能趋向下调[3]。IL-2/sIL-2R系统维持一定水平对机体发挥正常的抗肿瘤免疫反应至关重要。sIL-2R表达的增加非肿瘤直接所致，而与肿瘤引起的免疫反应有关[4]。关于IL-8、TNF在肝癌发生发展过程中的作用。可能与下列因素有关：(1)TNF、IL-8均能激活T、B细胞和NK细胞、单核巨噬细胞，这些活化的细胞参与肝癌免疫病理反应及炎症过程，造成肝细胞受损、坏死、肝功能改变；(2)TNF作为一种多功能细胞因子，不仅直接杀伤多系统肿瘤，也是单核细胞、巨噬细胞杀伤肿瘤的重要介质[5、7]。
, 百拇医药
综上所述：肝癌患者外周血PMN吞噬功能低下，客观反应细胞因子介质调节水平的改变，以及氧自由基生成释放构成伤害因素。PMN-CL和细胞因子检测在研究原发性肝癌免疫功能低下及其临床对策中具有重要意义。
作者简介：曹锐(1958-)，女,南充市人，硕士，副主任医师、副教授，从事肿瘤专业。
参考文献
1，《实用肿瘤学》编辑委员会.实用肿瘤学.第2册第1版.北京：人民卫生出版社.1979，112-142
2，Allen RC, Sternholm RL,and Steele RH.Evidence for the generation of electronic excitation states in human polymorphonuclear leukocytes and its participation in bactericidal activity.Biochem Biophsy Res Commun,1972；47:679-684
, 百拇医药
3，Tadatsugu T,Yasuhiro M.The IL-2/IL-2R receptor system a current overview.Cell,1993；73:5-8
4，Marino P,Cugno M,Preatonic A,et al.Increased levels of soluble interleukin-2 receptor in serum of patients with lung cancer.Br J Cancer,1990；61:434-435
5，Sheron N,Willilams R.IL-8 as a circulating cytokine:induction by recombinant tumor necrosis factor alpha.Clin Exp Immunol,1992；89:100-103
6，Wu S,Boyer CM,Whitaker RS,et al.Tumor necrosis factor as a autocrine and paracrine growth factor for ovarian cancer:monokine induction of tumor cell proliferation and tumor necrosis factor a expression.Cancer Res,1993；53:1939-1944
7，Reterso TC,Isburcker RA.Fibroproliferation in liver disease:role of monocyte factor.Hepatology,1992；15:191-197
收稿日期：1999-4-30, 百拇医药
单位：曹锐(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤科 重庆 400042)；马文书(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤科 重庆 400042)；李天星(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤科 重庆 400042)
关键词：原发性肝癌；多形核白细胞；化学发光；细胞因子
外周血PMN激活吞噬化学发光与原发性肝癌患者免疫功能变化 〔摘要〕 目的 探讨外周血多形核白细胞化学发光(Polymorphonuclear-Chemilluminescence,PMN-CL)及细胞因子活性改变与原发性肝癌的发病机制关系。方法 采用液体闪烁技术(LSC)体外激活PMN生成、释放过氧化阴离子，诱导吞噬作用产生化学发光，并应用ELISA及RIA检测相关指标IL-2、sIL-2R、IL-8、TNF、SOD，并以健康献血员为对照。结果 体内激活明显，基础CL升高(P<0.05)，最大峰值低下，峰时延迟(P<0.01)。相关指标IL-9、sIL-2R、TNF、SOD显著高于对照组(P<0.01)，IL-2低于对照组(P<0.05)。结论 原发性肝癌患者外周血PMN化学发光变化，客观反应了细胞免疫功能水平，以及超氧离子的生成、释放与损伤状态。对深入研究原发性肝癌的发病机理具有重要意义。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R735.7 〔文献标识码〕B
The PMN-CL and the change of immune function in patients with primary hepatic cancer
CAO Rui,MA Wen-shu,LI Ting-xing
(The Third Military Medical College Daping Hospital Research,Institute of Field Surgery,Chongqing 400042)
〔Abstract〕 Objective To explore the relationship of PMN-CL and the change of cytokines activity with pathogenesis of primary hepatic cancer.Methods The PMN-CL and IL-2,sIL-2R,Il-8 TNF and SOD in sera of 38 patients with primary hepatic cancer were detected by LSC(Liquid scintillation counting)、ELISA and RIA.Results The level of basic luminescence increased(P<0.05).Iym-induced phagoluminescence maximal peak value decreased.The peak time was delayed remarkably(P<0.01).At the same time,the sIL-2R、IL-8、TNF、SOD were significantly higher than those of normal control (P<0.01),IL-2 was lower than that of normal control (P<0.05).Conclusions The change of PMN-CL reflected the immunologic function of the patients and the state of production,release of hyperoxide anion which might be an important role in the research of pathogenesis of primary hepatic cancer.
, http://www.100md.com
〔Key words〕 primary hepatic cancer;cytokine;polymorphonuclear;chemilluminescence
PMN是人体外周血中主要的抗炎症细胞。近年来对PMN的吞噬化学发光研究表明，PMN-CL是反映细胞吞噬免疫功能的标志，是过氧化物离子生成释放致损伤的反应。本文研究原发性肝癌患者外周血PMN激活、依赖Luminal化学发光，诱吞噬探测极限CL值，并检测血清中相关指标IL-2、sIL-2R、IL-8、SOD以及TNF值的变化，现报道如下。
材料和方法
一、检测对象 38例原发性肝癌患者，男性28例，女性10例，中位年龄42.1±0.9岁。均符合1977年全国肝癌协作会议制订的临床标准[1]。20例健康献血员作为正常对照组，男性15例，女性5例，中位年龄37.5±1.8岁。
, 百拇医药
二、方法
1.仪器：FJ-2108细胞代谢液闪仪(262厂)，功能方式Ⅲ、测量方式Ⅳ、单光子辐射、KV0740调至仪器本底14CP/6s±2，并能敏感地对Luminal毫微摩尔浓度水平自然发光成数千倍放大。
2.Luminal(北京化工厂)：取20mg放入小烧杯，加入pH8.2 PBS 10ml，三乙胺一滴，磁搅拌18小时左右，过滤后-20℃保存，应用液计算稀释成10-4M。
3.PMN分离与浓度：肝素抗凝血用1∶1Hans平衡液(无酚红含1%小牛血清)稀释，分离装细胞分离液(比重1.077)，稀释血叠复于上面，中速离心15min，按常规提取法获得PMN，并按所需浓度稀释成悬液。
4.IL-2、sIL-2R、IL-8：ELISA双抗体夹心法，试剂盒由第四军医大学免疫教研室提供。
, 百拇医药
5.SOD：放射免疫分析法，药盒由成都同位素研究所提供。
6.TNF：试剂盒购自军事医学科学院北京邦定生物医药公司，方法按说明书操作。
结果
原发性肝癌患者PMN在体内呈被激活状态，基础化学发光值显著高于正常人对照组(P<0.05)，诱PMN吞噬酵母多糖依赖Luminal化学发光，最大峰值低下(P<0.05)。各组间PMN-CL值与分析见表1。
表1 原发性肝癌患者外周血PMN-CL测定结果
组 别
例数
本底
(cp/6s)
, 百拇医药
基础发光
(cp/6s)
Luminal
依赖发光
(sp/6s)
最大吞
噬发光
(cp/6s)
峰时/min
正常对照组
20
13±3
156±55
, 百拇医药
650±207
6892±1903
14±2
肝癌组
38
18±4*
288±102*
980±215*
4582±1705**
20±3*
*P<0.05 **P<0.01
, 百拇医药
SOD、IL-8、TNF、sIL-2R显著高于正常对照组(P<0.05～0.01)、IL-2显著低于正常对照组(P<0.05)，见表2。
表2 原发性肝癌血液细胞因子检测分析
组别
例数
IL-2
(ng/ml)
sIL-2R
(u/ml)
IL-8
(pg/ml)
TNF
, 百拇医药
(ng/ml)
SOD
(ng/ml)
正常对照组
20
19.8
±3.2
241.2
±91.3
215.3
±110.1
1.9
±0.8
, 百拇医药
300.1
±110.3
肝癌组
38
10.2
±2.5
852.3
±285.2
715.4
±88.3
5.1
±1.5
510.5
, http://www.100md.com
±160.2
P
<0.05
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
讨论
自Allen等[2]1972年发现PMN激活吞噬化学发光现象后，在研究细胞免疫机制与疾病关系、吞噬功能、细胞因子调节作用、介质生成释放等方面获得很大发展。已知发光强度的大小即反映PMN吞噬功能的强弱，又反映激活和生成氧衍生物的自由基情况。其中基础吞噬活性反映PMN在体内的预激活状态，最大吞噬活性反映经酵母多糖调理后所能达到的最大吞噬功能。本实验，Iym诱吞噬的最大峰值低下，峰时20分钟显示延迟，表明患者PMN对异物应答能力及细胞吞噬功能下降，机体调理作用失衡。基础发光总体水平升高，说明患者体内氧自由基释放增多，细胞损害加重。氧自由基的产生作为一种介质，在吞噬细胞活化、细胞毒和免疫调节中起一定作用，与造成组织损伤密切相关。SOD是一种抗氧化酶，化学本质仍属蛋白质，酶蛋白合成的增加和分泌加快了细胞内SOD的合成，这对加强体内氧化损伤的防护、控制病情发展、促进机体生理平衡有着积极作用。SOD减少或缺乏，会加重自由基对组织的损伤。本组SOD呈上升状态，机理尚不清楚，可能与机体的应激反应有关。
, 百拇医药
肝癌的发生与机体免疫应答状态、免疫调节功能失调密切相关，多种细胞因子如IL-8、IL-2、sIL-2R、TNF等在其发生发展中具有重要作用。本实验，IL-8、sIL-2R、TNF显著高于正常人，IL-2低于正常对照组，表明肝癌患者体内IL-8、TNF、sIL-2R的分泌调节功能紊乱，IL-2介导的免疫反应降低，机体抗肿瘤免疫功能减弱。研究表明，IL-2通过膜白介素2受体(mIL-2R)起作用，可溶性白介素2受体作为免疫封闭因子可与mIL-2R竞争结合IL-2，从而对机体免疫功能趋向下调[3]。IL-2/sIL-2R系统维持一定水平对机体发挥正常的抗肿瘤免疫反应至关重要。sIL-2R表达的增加非肿瘤直接所致，而与肿瘤引起的免疫反应有关[4]。关于IL-8、TNF在肝癌发生发展过程中的作用。可能与下列因素有关：(1)TNF、IL-8均能激活T、B细胞和NK细胞、单核巨噬细胞，这些活化的细胞参与肝癌免疫病理反应及炎症过程，造成肝细胞受损、坏死、肝功能改变；(2)TNF作为一种多功能细胞因子，不仅直接杀伤多系统肿瘤，也是单核细胞、巨噬细胞杀伤肿瘤的重要介质[5、7]。
, 百拇医药
综上所述：肝癌患者外周血PMN吞噬功能低下，客观反应细胞因子介质调节水平的改变，以及氧自由基生成释放构成伤害因素。PMN-CL和细胞因子检测在研究原发性肝癌免疫功能低下及其临床对策中具有重要意义。
作者简介：曹锐(1958-)，女,南充市人，硕士，副主任医师、副教授，从事肿瘤专业。
参考文献
1，《实用肿瘤学》编辑委员会.实用肿瘤学.第2册第1版.北京：人民卫生出版社.1979，112-142
2，Allen RC, Sternholm RL,and Steele RH.Evidence for the generation of electronic excitation states in human polymorphonuclear leukocytes and its participation in bactericidal activity.Biochem Biophsy Res Commun,1972；47:679-684
, 百拇医药
3，Tadatsugu T,Yasuhiro M.The IL-2/IL-2R receptor system a current overview.Cell,1993；73:5-8
4，Marino P,Cugno M,Preatonic A,et al.Increased levels of soluble interleukin-2 receptor in serum of patients with lung cancer.Br J Cancer,1990；61:434-435
5，Sheron N,Willilams R.IL-8 as a circulating cytokine:induction by recombinant tumor necrosis factor alpha.Clin Exp Immunol,1992；89:100-103
6，Wu S,Boyer CM,Whitaker RS,et al.Tumor necrosis factor as a autocrine and paracrine growth factor for ovarian cancer:monokine induction of tumor cell proliferation and tumor necrosis factor a expression.Cancer Res,1993；53:1939-1944
7，Reterso TC,Isburcker RA.Fibroproliferation in liver disease:role of monocyte factor.Hepatology,1992；15:191-197
收稿日期：1999-4-30, 百拇医药