子宫内膜癌p16/MTS1基因失活的研究
作者：于莎莎 迟闺珠 朱章菱 肖白 王跃
单位：于莎莎(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)；迟闺珠(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)；朱章菱(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)；肖白(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)；王跃(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)
关键词：子宫内膜癌；p16/MTS1；抑癌基因
子宫内膜癌p16 〔摘要〕 目的 探讨p16/MTS1基因在子宫内膜癌组织的表达及意义。方法 采用显微切割-聚合酶链反应方法，对29例子宫内膜癌组织和癌旁正常组织中p16/MTS1基因纯合缺失进行检测。并用Fisher精确检验的方法，对p16/MTS1基因纯合缺失与临床病理关系进行统计分析。结果 29例子宫内膜癌组织，p16/MTS1基因纯合缺失率为24.14%。Ⅰ期纯合缺失率为24.00%，Ⅱ期纯合缺失率为33.33%。结论 p16/MTS1基因纯合缺失与子宫内膜癌的发生有关。
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〔中图分类号〕 R737.33 〔文献标识码〕B
Study on p16/MTS1 gene inactivation in carcinoma of endometrium
YU sha-sha,CHI Gui-zhu,ZHU Zhang-ling,et al.
(Chao Yang Hospital,Affiliate Hospital,Capital University of Medical Sciences, Beijing 100020)
〔Abstract〕 Objective To probe the expression of p16/MTS1 gene in carcinoma of endometrium.Methods Homozygous deletion of p16/MTS1 gene was examined by micro-cut PCR methods in tissues both of and adjacent to tumor from 29 cases of carcinoma of endometrium,The relation with clinicopathology was analysed by Fisher excates.Results 24.14% homozygous deletion of p16/MTS1 gene was found in carcinoma of endometrium.Conclusions There was a relationship between homozygous deletion of p16/MTS1 gene and occurrencs of carcinoma of endometrium.
, 百拇医药
〔Key words〕 Carcinoma of endometrium;p16/MTS1;Gene
抑癌基因的表达异常在恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用。p16基因是1994年4月报道的多肿瘤抑制基因(Multiple tumorsuppressor 1,MTS1)[1]，p16/MTS1基因的突变的缺失广泛存在于人类多种原发性肿瘤组织及肿瘤细胞株中[1，2]。但p16/MTS1基因在子宫内膜癌中的变化，国内尚未见报道。为分析p16/MTS1基因失活与子宫内膜癌的临床、病理关系，我们采用显微切割-聚合酶链反应(PCR)方法，对29例子宫内膜癌组织及癌旁正常组织进行检测，分析肿瘤组织及癌旁正常组织中p16/MTS1基因失活情况，以探讨p16/MTS1基因结构和功能异常与子宫内膜癌的发生及临床病理关系。现报告如下。
材料和方法
一、研究对象及标本来源：1995年10月～1997年12月我科收治的子宫内膜癌患者29例，其中13例取新鲜肿瘤组织和癌旁组织测定，16例为石蜡包埋肿瘤组织。年龄为28～80岁，中位52.90±11.46岁。按1988年FIGO手术分期标准，Ⅰ期25例(Ⅰb期14例、Ⅰc期11例)，Ⅱ期3例，Ⅲ期1例。组织学分级G1 7例，G2 10例，G3 12例。腺癌25例，腺鳞癌3例，腺棘癌1例。所有标本经组织病理学诊断证实，治疗为次广泛子宫切除加盆腔淋巴结清扫，术后辅以孕激素治疗。全部患者均随访至今，其中1例死亡。
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二、主要方法
1.显微切割提取DNA 将肿瘤标本(新鲜或石蜡包埋)制成5μm的切片，不加盖玻片，HE染色。在低倍显微镜，用手术切片刮取病理片上的癌细胞，置于有lysis buffer和蛋白酶k的eppendorf管中。37℃消化过夜，48℃ 2hr煮沸5min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后溶于20ul dd H2O中。
2.p16/MTS1基因纯合缺失检测 用多重PCR法扩增p16/MTS1基因外显子1和2，同时扩增β-珠蛋白基因作为内对照。引物序列为：Exonl (S)GAA GAA AGA GGA GGG GCT G；(AS) GCG CTA CC TG AT TCC AAT TC.Exon;2(S) GGA AAT TGC AAA CTG GAA GC；(AS) TCA TCA GTC CTC ACC TGA G。内对照(S) GGT ACC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAG ACA GGT ACG GCT GTC ATC；(AS) CCC TTC CTA TGA CAT GAA C。PCR反应循环参数为94℃ 1min,60℃ 1min,72℃ 1min。35个循环后，72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳或8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色分析。
, 百拇医药
3.统计学分析 两资料间差异检验用Fisher精确法检验。
结果
一、p16/MTS1 基因纯合缺失检测结果
对29例患者进行p16/MTS1基因纯合缺失检测，有7例纯合缺失，纯合缺失率为(7/29)24.14%。癌旁正常组织均未发现纯合缺失。
二、p16/MTS1基因纯合缺失与临床分期关系：Ⅰ期患者p16/MTS1纯合缺失6例(6/25)，Ⅱ期1例(1/3)；Ⅱ期缺失率高于Ⅰ期(P<0.05)。其中Ⅰb期3例(3/14)，Ⅰc期(3/11)，Ⅰc期缺失率高于Ⅰb期。(P<0.05)。
三、p16/MTS1基因纯合缺失与肿瘤分化程度关系：高分化肿瘤中，p16/MTS1基因纯合缺失为0(0/7)，中分化肿瘤2例(2/10)。低分化肿瘤5例(5/12)。低分化肿瘤p16/MTS1基因纯合缺失率高于高分化肿瘤(P<0.05)。
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四、p16/MTS1基因纯合缺失与肌层浸润关系：肿瘤肌层浸润深度<1/2,p16/MTS1基因纯合缺失2例(2/13)，肿瘤肌层浸润深度>1/2者，5例(5/16)；肌层浸润深度>1/2者，p16/MTS1基因纯合缺失率高于肌层浸润深度<1/2者(P<0.05)。见下表。
病理因素与p16/MTS1基因纯合缺失关系
总例数
缺失例数
缺失率(%)
临床分期
Ⅰ期
25
6
, http://www.100md.com 24.00
Ⅱ期
3
1
33.33
肿瘤分化程度
G1
7
0
0
G2
10
2
20.00
, 百拇医药
G3
12
5
41.67
肌层浸润深度
<1/2
13
2
15.38
>1/2
16
2
31.25
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讨论
一、p16/MTS1与肿瘤关系：p16/MTS1基因是1994年4月报道的一种新型的抑癌基因。p16/MTS1直接抑制细胞周期依赖性激酶4(CDK4)，可阻断细胞周期进程而抑制癌细胞生长。p16/MTS1基因位于人第9号染色体的p21区域。由于这个部位的缺失、突变，易发生恶性肿瘤。研究发现，来源于黑色素瘤、肺、乳腺、脑、骨、皮肤、膀胱、肾及卵巢等部位的癌细胞系均可出现高频率的p16/MTS1基因纯合缺失，75%的癌细胞株有p16/MTS1基因缺失或突变，超过p53基因的50%突变率[3～10]。在人体肿瘤组织的检测中，同样发现有p16/MTS1基因的异常，包括肺、食管、卵巢、肾、膀胱、乳腺、脑、鼻咽等部位的肿瘤。p16/MTS1基因的缺失可导致肿瘤细胞无限生长。以上事实预示着p16/MTS1基因在肿瘤发生过程中扮演重要角色。
二、p16/MTS1基因纯合缺失与子宫内膜癌的发生及临床病理关系：我们采用显微切割-聚合酶链反应(PCR)方法，经显微操作，直接从病理切片上取得经病理确认的肿瘤细胞，行PCR分析，力求避免正常细胞污染，以灵敏检测p16/MTS1基因的纯合缺失。本研究29例子宫内膜癌标本中p16/MTS1基因纯合缺失率为24.14%(7/29)；正常癌旁组织无p16/MTS1抑癌基因纯合缺失；提示p16/MTS1基因纯合缺失与子宫内膜癌的发生有关。
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本研究中，Ⅱ期病例中p16/MTS1基因纯合缺失高于Ⅰ期，而且Ⅰc期高于Ⅰb期，低分化癌p16基因纯合缺失率高于高分化癌，肌层浸润超过1/2者，p16/MTS1基因纯合缺失高于肌层浸润<1/2者。推测p16/MTS1基因纯合缺失与子宫内膜癌的临床分期、病理分级、肌层浸润等生物学特征有关。由于本研究病例尚少，有待增加检测病例数量，进一步论证。
作者简介：于莎莎(1957-)，女，山东烟台人，医学学士，副主任医师，副教授。从事妇产科专业。
参考文献
1，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus I,et al.A cell types.Science,1994；264:436
2，Cairrs P,Polascik TJ,Eby Y,et al.Frequency of homozygous deletion at p16 CKDN2 in primary tumors.Nature Genetics,1995；11:210
, 百拇医药
3，Zhou X,Tarmin L,Yin J,et al.The MTS1 gene is frequently mutated in primary human esophageal tumors.Oncogene,1994；9:3737
4，Walker DG,Duan W,Popovic EA,et al.Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytomas.Cancer Res,1995；55:20
5，Cairns P, Tokino K, Eby Y, et al. Localization of tumor suppressor loci on chromosome 9 in primary human renal cell carcinomas.Cancer Res,1995；55:224
, 百拇医药
6，Ohta M,Nagai H,Shimizu M,et al.Rarity of somatic and germline mutations of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor gene,CDK41,in melanoma.Cancer Res,1994；54:5269
7，Spruck CH,Gonzalez-Zulueta M,Shibata A,et al.P16 gene uncultured tumours.Nature,1994；370:183
8，Jen J,Harper JW,Bigner SH,et al.Deletion of p16 and p15 gene in brain tumors.Cancer Res，1994；54:6353
9，Okamoto A,Hussain SP,Hagiware K,et al.Mutations in the p16 INK4/MTS1/CDKN2.P15INK4B/MTS2.and p18 genes in primary and metastatic lung cancer.Cancer Res, 1995；55:1448
10，Xu L,Sgroi D,Beauchamp RL,et al.Mutational analysis of CDKN2(MTS1 p16 INK4) in human breast carcinomas.Cancer Res.1994;54:5262
收稿日期：1999-3-14, 百拇医药
单位：于莎莎(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)；迟闺珠(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)；朱章菱(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)；肖白(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)；王跃(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科 北京 100020)
关键词：子宫内膜癌；p16/MTS1；抑癌基因
子宫内膜癌p16 〔摘要〕 目的 探讨p16/MTS1基因在子宫内膜癌组织的表达及意义。方法 采用显微切割-聚合酶链反应方法，对29例子宫内膜癌组织和癌旁正常组织中p16/MTS1基因纯合缺失进行检测。并用Fisher精确检验的方法，对p16/MTS1基因纯合缺失与临床病理关系进行统计分析。结果 29例子宫内膜癌组织，p16/MTS1基因纯合缺失率为24.14%。Ⅰ期纯合缺失率为24.00%，Ⅱ期纯合缺失率为33.33%。结论 p16/MTS1基因纯合缺失与子宫内膜癌的发生有关。
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〔中图分类号〕 R737.33 〔文献标识码〕B
Study on p16/MTS1 gene inactivation in carcinoma of endometrium
YU sha-sha,CHI Gui-zhu,ZHU Zhang-ling,et al.
(Chao Yang Hospital,Affiliate Hospital,Capital University of Medical Sciences, Beijing 100020)
〔Abstract〕 Objective To probe the expression of p16/MTS1 gene in carcinoma of endometrium.Methods Homozygous deletion of p16/MTS1 gene was examined by micro-cut PCR methods in tissues both of and adjacent to tumor from 29 cases of carcinoma of endometrium,The relation with clinicopathology was analysed by Fisher excates.Results 24.14% homozygous deletion of p16/MTS1 gene was found in carcinoma of endometrium.Conclusions There was a relationship between homozygous deletion of p16/MTS1 gene and occurrencs of carcinoma of endometrium.
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〔Key words〕 Carcinoma of endometrium;p16/MTS1;Gene
抑癌基因的表达异常在恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用。p16基因是1994年4月报道的多肿瘤抑制基因(Multiple tumorsuppressor 1,MTS1)[1]，p16/MTS1基因的突变的缺失广泛存在于人类多种原发性肿瘤组织及肿瘤细胞株中[1，2]。但p16/MTS1基因在子宫内膜癌中的变化，国内尚未见报道。为分析p16/MTS1基因失活与子宫内膜癌的临床、病理关系，我们采用显微切割-聚合酶链反应(PCR)方法，对29例子宫内膜癌组织及癌旁正常组织进行检测，分析肿瘤组织及癌旁正常组织中p16/MTS1基因失活情况，以探讨p16/MTS1基因结构和功能异常与子宫内膜癌的发生及临床病理关系。现报告如下。
材料和方法
一、研究对象及标本来源：1995年10月～1997年12月我科收治的子宫内膜癌患者29例，其中13例取新鲜肿瘤组织和癌旁组织测定，16例为石蜡包埋肿瘤组织。年龄为28～80岁，中位52.90±11.46岁。按1988年FIGO手术分期标准，Ⅰ期25例(Ⅰb期14例、Ⅰc期11例)，Ⅱ期3例，Ⅲ期1例。组织学分级G1 7例，G2 10例，G3 12例。腺癌25例，腺鳞癌3例，腺棘癌1例。所有标本经组织病理学诊断证实，治疗为次广泛子宫切除加盆腔淋巴结清扫，术后辅以孕激素治疗。全部患者均随访至今，其中1例死亡。
, 百拇医药
二、主要方法
1.显微切割提取DNA 将肿瘤标本(新鲜或石蜡包埋)制成5μm的切片，不加盖玻片，HE染色。在低倍显微镜，用手术切片刮取病理片上的癌细胞，置于有lysis buffer和蛋白酶k的eppendorf管中。37℃消化过夜，48℃ 2hr煮沸5min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后溶于20ul dd H2O中。
2.p16/MTS1基因纯合缺失检测 用多重PCR法扩增p16/MTS1基因外显子1和2，同时扩增β-珠蛋白基因作为内对照。引物序列为：Exonl (S)GAA GAA AGA GGA GGG GCT G；(AS) GCG CTA CC TG AT TCC AAT TC.Exon;2(S) GGA AAT TGC AAA CTG GAA GC；(AS) TCA TCA GTC CTC ACC TGA G。内对照(S) GGT ACC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAG ACA GGT ACG GCT GTC ATC；(AS) CCC TTC CTA TGA CAT GAA C。PCR反应循环参数为94℃ 1min,60℃ 1min,72℃ 1min。35个循环后，72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳或8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色分析。
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3.统计学分析 两资料间差异检验用Fisher精确法检验。
结果
一、p16/MTS1 基因纯合缺失检测结果
对29例患者进行p16/MTS1基因纯合缺失检测，有7例纯合缺失，纯合缺失率为(7/29)24.14%。癌旁正常组织均未发现纯合缺失。
二、p16/MTS1基因纯合缺失与临床分期关系：Ⅰ期患者p16/MTS1纯合缺失6例(6/25)，Ⅱ期1例(1/3)；Ⅱ期缺失率高于Ⅰ期(P<0.05)。其中Ⅰb期3例(3/14)，Ⅰc期(3/11)，Ⅰc期缺失率高于Ⅰb期。(P<0.05)。
三、p16/MTS1基因纯合缺失与肿瘤分化程度关系：高分化肿瘤中，p16/MTS1基因纯合缺失为0(0/7)，中分化肿瘤2例(2/10)。低分化肿瘤5例(5/12)。低分化肿瘤p16/MTS1基因纯合缺失率高于高分化肿瘤(P<0.05)。
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四、p16/MTS1基因纯合缺失与肌层浸润关系：肿瘤肌层浸润深度<1/2,p16/MTS1基因纯合缺失2例(2/13)，肿瘤肌层浸润深度>1/2者，5例(5/16)；肌层浸润深度>1/2者，p16/MTS1基因纯合缺失率高于肌层浸润深度<1/2者(P<0.05)。见下表。
病理因素与p16/MTS1基因纯合缺失关系
总例数
缺失例数
缺失率(%)
临床分期
Ⅰ期
25
6
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Ⅱ期
3
1
33.33
肿瘤分化程度
G1
7
0
0
G2
10
2
20.00
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G3
12
5
41.67
肌层浸润深度
<1/2
13
2
15.38
>1/2
16
2
31.25
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讨论
一、p16/MTS1与肿瘤关系：p16/MTS1基因是1994年4月报道的一种新型的抑癌基因。p16/MTS1直接抑制细胞周期依赖性激酶4(CDK4)，可阻断细胞周期进程而抑制癌细胞生长。p16/MTS1基因位于人第9号染色体的p21区域。由于这个部位的缺失、突变，易发生恶性肿瘤。研究发现，来源于黑色素瘤、肺、乳腺、脑、骨、皮肤、膀胱、肾及卵巢等部位的癌细胞系均可出现高频率的p16/MTS1基因纯合缺失，75%的癌细胞株有p16/MTS1基因缺失或突变，超过p53基因的50%突变率[3～10]。在人体肿瘤组织的检测中，同样发现有p16/MTS1基因的异常，包括肺、食管、卵巢、肾、膀胱、乳腺、脑、鼻咽等部位的肿瘤。p16/MTS1基因的缺失可导致肿瘤细胞无限生长。以上事实预示着p16/MTS1基因在肿瘤发生过程中扮演重要角色。
二、p16/MTS1基因纯合缺失与子宫内膜癌的发生及临床病理关系：我们采用显微切割-聚合酶链反应(PCR)方法，经显微操作，直接从病理切片上取得经病理确认的肿瘤细胞，行PCR分析，力求避免正常细胞污染，以灵敏检测p16/MTS1基因的纯合缺失。本研究29例子宫内膜癌标本中p16/MTS1基因纯合缺失率为24.14%(7/29)；正常癌旁组织无p16/MTS1抑癌基因纯合缺失；提示p16/MTS1基因纯合缺失与子宫内膜癌的发生有关。
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本研究中，Ⅱ期病例中p16/MTS1基因纯合缺失高于Ⅰ期，而且Ⅰc期高于Ⅰb期，低分化癌p16基因纯合缺失率高于高分化癌，肌层浸润超过1/2者，p16/MTS1基因纯合缺失高于肌层浸润<1/2者。推测p16/MTS1基因纯合缺失与子宫内膜癌的临床分期、病理分级、肌层浸润等生物学特征有关。由于本研究病例尚少，有待增加检测病例数量，进一步论证。
作者简介：于莎莎(1957-)，女，山东烟台人，医学学士，副主任医师，副教授。从事妇产科专业。
参考文献
1，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus I,et al.A cell types.Science,1994；264:436
2，Cairrs P,Polascik TJ,Eby Y,et al.Frequency of homozygous deletion at p16 CKDN2 in primary tumors.Nature Genetics,1995；11:210
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3，Zhou X,Tarmin L,Yin J,et al.The MTS1 gene is frequently mutated in primary human esophageal tumors.Oncogene,1994；9:3737
4，Walker DG,Duan W,Popovic EA,et al.Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytomas.Cancer Res,1995；55:20
5，Cairns P, Tokino K, Eby Y, et al. Localization of tumor suppressor loci on chromosome 9 in primary human renal cell carcinomas.Cancer Res,1995；55:224
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6，Ohta M,Nagai H,Shimizu M,et al.Rarity of somatic and germline mutations of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor gene,CDK41,in melanoma.Cancer Res,1994；54:5269
7，Spruck CH,Gonzalez-Zulueta M,Shibata A,et al.P16 gene uncultured tumours.Nature,1994；370:183
8，Jen J,Harper JW,Bigner SH,et al.Deletion of p16 and p15 gene in brain tumors.Cancer Res，1994；54:6353
9，Okamoto A,Hussain SP,Hagiware K,et al.Mutations in the p16 INK4/MTS1/CDKN2.P15INK4B/MTS2.and p18 genes in primary and metastatic lung cancer.Cancer Res, 1995；55:1448
10，Xu L,Sgroi D,Beauchamp RL,et al.Mutational analysis of CDKN2(MTS1 p16 INK4) in human breast carcinomas.Cancer Res.1994;54:5262
收稿日期：1999-3-14, 百拇医药