应用巢式RT-PCR检测原发性肝细胞癌患者外周血中的微转移
作者：周京旭 杨希山 袁爱力 林金容 林鸿 赖卓胜 黄宇琦
单位：周京旭(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；杨希山(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；袁爱力(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；林金容(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；林鸿(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；赖卓胜(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；黄宇琦(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)
关键词：原发性肝细胞癌；甲胎蛋白；微转移；巢式逆转录PCR
应用巢式RT 〔摘要〕 目的 以AFPmRNA为标志基因，检测原发性肝细胞癌患者外周血中微转移情况。方法 应用巢式RT-PCR方法，检测71例肝细胞癌、21例肝硬化患者、28例健康对照、4例转移性肝癌、4例肝脓肿、4例肝血管瘤及5例其它恶性肿瘤患者外周血中AFPmRNA的表达。结果 71例肝癌患者中，AFPmRNA阳性39例，阳性率为54.9%，其中8例有远处转移的全部阳性(100%)，未发现远处转移者阳性31例，阳性率为49.2%。21例肝硬化患者中仅2例阳性，而转移性肝癌、肝血管瘤、肝脓肿、其它恶性肿瘤、健康对照均为阴性。结论 检测肝细胞癌患者外周血中的AFPmRNA，是一种早期发现肝细胞癌血道播散的灵敏方法。
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〔中图分类号〕 R735.7；R730.43 〔文献标识码〕B
Detection of peripheral blood micrometastasis in patients with hepatocellular carcinoma by nested RT-PCR
ZHOU Jing-xu,YANG Xi-shan,YUAN Ai-li,et al.
(PLA Institute for Digestive Diseases,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
〔Abstract〕 Objective To detect hepatocyte-associated gene AFPmRNA to demonstrate micrometastasis in peripheral blood.Methods AFPmRNA in peripheral blood was detected in 71 case with PHC,21 cases with cirrhosis,28 normal healthy controls,4 cases with metastatic liver cancer,4 cases with liver hemangioma,4 cases with liver abscess and 5 cases with other maligant diseases by means of nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Results Human AFPmRNA was detected in 39 out of 71 cases of PHC(54.9%),in which 8 patients with distal metastasis were all positive and in 31 without distal metastasis the positive rate was 49.2% (P<0.01).AFPmRNA was also positive in 2 cases of cirrhosis (2/21,9.5%),but negative in normal healthy control,metastatic liver cancer,liver hemangioma,liver abscess and other maligant disease.Conclusions Nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction is a very sensitive method for early detecting micrometastasis in patients with PHC,and suitable for extensive clinical application.
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〔Key words〕 primary hepatocellular carcinoma; alpha-fetoprotein(AFP); micrometastasis;nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction
原发性肝细胞癌的早期诊断率、可手术切除率近年来明显提高。特别是正位肝移植手术的开展，使肝癌合并肝硬化患者治愈有一线曙光。但患者术后复发率仍高，其主要原因之一是术前已发生了目前检查手段未能检测到的血道微转移[1-2]。近年来多聚合酶链反应技术的应用，使检测外周血中少量肿瘤细胞成为可能。作者采用巢式RT-PCR技术，以AFPmRNA为肝癌细胞的标志基因对原发性肝细胞癌患者外周血中的肿瘤细胞进行检测，并就AFPmRNA在原发性肝细胞癌血道转移的诊断价值进行评价。
材料与方法
检测对象：1997.2～1997.10我院住院原发性肝细胞癌71例，男63例，女8例，年龄17～70岁，平均44.9岁，经手术切除病理证实23例；肝穿活检病理证实6例，其余42例根据临床表现、血清AFP和影像学技术确诊。肝癌远处转移依靠X线片、B超、CT、MRI及全身骨扫描确诊。肝硬化21例，男16例，女5例，年龄31～62岁，平均42.4岁。正常对照28例，男17例，女11例，年龄21～48岁，平均35.2岁，其中20例本院健康献血人员。8例为无肝脏疾患的胃肠炎患者。转移性肝癌4例，肝血管瘤4例，肝脓肿4例。
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标本收集：受检者抽取肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液分离有核细胞，-70℃保存。同时抽血收集血清进行AFP检测。
RNA提取：采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取有核细胞总mRNA[3]，经紫外分光光度计和变性胶电泳鉴定，证明制备RNA的纯度及未被降解。
巢式逆转录酶聚合酶链反应：RF-PCR引物[4]由Sangon公司合成，引物序列见表1。根据引物设计，第一轮PCR产物长度为174bp，第二轮PCR终产物长度为101bp，内含一个Pst Ⅰ核酸内切酶位点，可将终产物酶切成60bp和41bp。可用此酶进行PCR扩增产物特异性鉴定。逆转录采用外端反义引物，M-MLV 200u,37℃，60分钟。PCR循环参数为：94℃ 30秒，55℃ 40秒72℃ 40秒，循环40次，最后在72℃继续延伸7分钟。两轮循环参数相同。产物可用电泳检测，其特异性可用酶切分析。
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表1 AFP-mRNA引物
引 物
位 置
序 列
Ex-Sense
90-112
5′-ACTGAATCCAGAACACTGCATAG-3′
Ex-antisense
263-241
5′-TGCAGTCAATGCATCTTTCACCA-3′
IN-sense
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112-145
5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′
IN-antisense
222-200
5′-AAGTGGCTTCTTGAACAAACTGC-3′
统计分析：采用X2检验，分析各组间差异。
结果
1.PCR 产物分析2%琼脂糖电泳，在紫外灯下，AFPmRNA阳性者可见101bp电泳带。该产物用Pstl酶切后可分为61bp和40bp长度片段。结果见附图1、2。
2.外周血AFPmRNA检测结果：肝癌组外周血AFPmRNA检出39/71(54.9%)例，肝硬化检出2/21(9.5%)例，转移性肝癌、肝血管瘤、肝内脓肿、其它恶性肿瘤及健康对照均未检出。见表2。
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表2 各组外周血AFPmRNA检测结果
例数
AFPmRNA(-)
AFPmRNA(+)
原发性肝细胞癌
71
32
39
肝硬化
21
19
2
转移性肝癌
, 百拇医药
4
4
0
肝血管瘤
4
4
0
其他恶性肿瘤
5
5
0
胰头癌
3
3
, 百拇医药
0
肝恶性淋巴瘤
1
1
0
肝肉瘤
1
1
0
肝脓肿
4
4
0
健康对照
, 百拇医药
28
28
0
3.血AFPmRNA与不同临床参数的关系：将71例原发性肝癌患者按肿瘤大体分型大小、有无肝内转移、门脉癌栓及远处转移分成各组，各组AFPmRNA的阳性率见附表3和附表4。 表3 AFPmRNA与临床参数
临床参数
例数
AFP>20
P值
AFPmRNA
(+)(%)
P值
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巨块型
62
41(66.1%)
31(50.0%)
<5cm
11
6(54.4%)
2(18.3%)
≥5cm
51
35(68.5%)
29(56.9%)*
, 百拇医药
多发结节型
9
6(66.7%)
7(77.8%)
肝内转移
有
23
15(65.2%)
19(88.9%)
无
48
32(67.7%)
20(41.6%)**
, 百拇医药
门脉癌栓
有
21
13(61.9%)
17(80.9%)
无
50
33(66.0%)
22(44.0%)**
远处转移
有
8
5(62.5%)
, 百拇医药
8(100%)
无
63
43(68.3%)
31(49.2%)**
备注：与相应对照组相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01。 表4 AFPmRNA与肝癌分期的关系
临床分期
Ⅰ(%)
Ⅱ(%)
Ⅲ(%)
AFPmRNA阳性
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2(18.3)
7(29.2)
30(83.3)
AFPmRNA阴性
9(81.7)
17(79.8)
6(16.7)
总 计
11
24
36
由表3可见，肿瘤直径≥5cm的巨块型肝癌AFPmRNA阳性率高于肿瘤直径<5cm巨块型肝癌(P<0.05)；有肝内转移、门脉癌栓和远处转移组AFPmRNA的阳性率显著高于无肝内转移、门脉癌栓和远处转移组(P<0.01)；多结节性肝癌AFPmRNA阳性较巨块型肝癌稍高，但无统计学意义(P=0.229)，而各组AFP血清水平无显著差异(P>0.05)。
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由表4可见，AFPmRNA与肝癌临床分期明显相关，Ⅲ期AFPmRNA阳性率和Ⅰ、Ⅱ期差别显著(P<0.01)。
讨论
原发性肝癌的转移是影响肝癌患者预后的重要因素，也是肝癌治疗失败的主要原因之一。早期发现转移，对指导患者的治疗、预后评价具有重要意义。近年来，一些研究者采用RT-PCR技术扩增肿瘤相关基因(标志基因)来检测循环血(骨髓)中少量肿瘤细胞来判定肿瘤血道转移的高危人群，早期诊断血道转移。如Morno[5]等用前列腺特异性膜抗原(PSA)mRNA检测外周血中前列腺癌细胞，Burchill[6]等用CK20mRNA检测外周血(骨髓)中的结肠癌细胞等等。其中标志基因的选择是决定检测特异性和敏感性的关键因素。一般来说，标志基因必须满足两个基本条件：在肿瘤细胞中强表达，而在外周血细胞中不表达。
AFP是一种胚胎性蛋白，研究证实，AFPmRNA在肝癌细胞中强表达，正常成人在肝细胞中微量表达，而在外周血细胞中不表达[7-8]，因而可用AFPmRNA作为肝细胞癌的标志基因，进行血道转移的检测。
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本组以AFPmRNA作为标志基因应用巢氏RT-PCR技术，检测71例肝癌患者，阳性率为54.9%(39/71)；而在肝硬化组阳性率为9.5%(2/21)，转移性肝癌、肝血管瘤、肝脓肿、其它肿瘤及健康对照均为阴性。肝癌病人AFPmRNA的阳性率较国外报道稍高[4，8]，可能本组晚期病人较多有关。而在肝硬化病人亦有AFPmRNA阳性的病例，推测可能在肝硬化进展过程中，由于肝纤维结构破坏，有新生的肝细胞脱落入血所致，但其阳性率远低于肝癌组。
本研究还发现，AFPmRNA 的检出率与肿瘤的大小、临床分期、门脉癌栓、肝内和肝外转移密切相关。>5cm的巨块型肝癌远较<5cm的肝癌阳性率高(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ期患者阳性率(18.3%、29.2%)远较Ⅲ期患者阳性率(83.3%)低，差异明显；AFPmRNA在门脉癌栓、肝内转移高达80.9%和88.9%，远处转移患者高达100%，与国外研究报告基本一致[4，8]。提示外周血中肝癌细胞的出现与肝癌的进展密切相关，外周血细胞AFPmRNA 检测对估计肝癌有无血行播散、肝内和肝外转移有重要价值，可作为判断肝癌患者预后和有无血道播散的重要指标。
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肿瘤细胞从原发部位脱落，侵蚀血管进入血循环是肿瘤转移过程中的主要步骤之一[10]。Nakano[11]等报道，即使直径<2cm的高分化肝细胞癌，肿瘤细胞也可能侵蚀血管壁形成血道微转移。Koop[12]等用活体视频显微镜(intravital videomicroscopy)观察B16F10黑色素瘤细胞株在鸡囊胚(chick embryos)血循环中的转归，发现24小时内80%以上的黑色素瘤细胞能在血循环中存活并从血管渗出。而不是象过去想象的那样大部分被血流的机械动力和免疫系统所破坏。动物实验证实，大约0.01%循环血中的肿瘤细胞可在远处器官生存下来，形成转移灶。我们的实验结果提示肝细胞癌血道播散发生的时间远比过去认为的早，即使是小肝癌，也可能发生血道播散。并且，血道播散可能是一种较连续的过程。用RT-PCR技术检测循环血中的肝癌细胞作为肝癌转移或复发的标准，有助于判定目前检测手段不能发现的无明显临床症状的早期转移或复发病例，提高医患的警惕性，加强随诊和给予恰当的治疗，是改善预后的重要措施。
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应用RT-PCR技术检测循环血中的肝癌细胞是一种灵敏度高、特异性较强的方法，不仅可用来判定肝癌患者有无血道播散，而且可用于指导治疗或判定疗效。
作者简介：周京旭(1969-)男，浙江安吉人，硕士，主治医师，从事消化内科专业。
参考文献
1，Nagasue,N,Uchida M,Makino Y,et al.Incidence and factors associated with intrahepatic recurrence following resection of hepatocellular carcinoma.Gastroenterol, 1993;105:488-490
2，Yokoyama I,Todo S,Iwa tsuki S,et al.Liver transplantation in the treatment of primary liver cancer.Hepatogastroenterol, 1990；37:188-193
, http://www.100md.com
3，Chomczynski P and Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987；162:156-159
4，Kodeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood.Cancer,1995；75(a):2214-2221
5，Burchill SA,Bradburg,Pittman K,et al.Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Br J Cancer, 1995；71(3):218-281
, 百拇医药
6，Niwa Y,Matsumura M,Shiratori Y,et al.Quantitation of α-fetoprotein and albumin messenger RNAs in human hepatocellular carcinoma.Hepatol, 1996；23:1384-1392
7，Matsumura M, Niwa Y, Kato N, et al. Detection of α-fetoprotein mRNA,an indicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma in the circulation is possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma.Hepatol, 1994；20(6):1418-1425
8，Hillaire S,Barbn V,Boucher E,et al.Albumin messener RNA as a marker of circulating hepatocytes in hepatocellular carcinoma.Gastroenterol, 1994；106(1):239
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9，Moreno JG, Croce CM, Fischer R, et al.Detection of hematogenous micrometastasis in patients with prostate cancer.Cancer Res, 1992；52:6110-6112
10，Chambers AF,MacDonald IC,Schmidf EE,et al.Step in tumor metastasis new concepts from intravital videomicroscopy.Cancer and Metastasis Reviews, 1995；14:279-301
11，Nakano M,Saito A,Yamamoto M,et al.Stromal and blood vessel wall invasion in well-differentiated hepatocellular carcinoma.Liver, 1997；17:41-61
12，Koop S,MacDonald IC,Luzzi K,et al.Fate of melanoma cells entering the microcirculation:over 80% survive and extravasate.Cancer Res, 1995；55:2520-2523
收稿日期：1999-5-10, 百拇医药
单位：周京旭(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；杨希山(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；袁爱力(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；林金容(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；林鸿(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；赖卓胜(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)；黄宇琦(第一军医大学南方医院消化所 广州 510515)
关键词：原发性肝细胞癌；甲胎蛋白；微转移；巢式逆转录PCR
应用巢式RT 〔摘要〕 目的 以AFPmRNA为标志基因，检测原发性肝细胞癌患者外周血中微转移情况。方法 应用巢式RT-PCR方法，检测71例肝细胞癌、21例肝硬化患者、28例健康对照、4例转移性肝癌、4例肝脓肿、4例肝血管瘤及5例其它恶性肿瘤患者外周血中AFPmRNA的表达。结果 71例肝癌患者中，AFPmRNA阳性39例，阳性率为54.9%，其中8例有远处转移的全部阳性(100%)，未发现远处转移者阳性31例，阳性率为49.2%。21例肝硬化患者中仅2例阳性，而转移性肝癌、肝血管瘤、肝脓肿、其它恶性肿瘤、健康对照均为阴性。结论 检测肝细胞癌患者外周血中的AFPmRNA，是一种早期发现肝细胞癌血道播散的灵敏方法。
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〔中图分类号〕 R735.7；R730.43 〔文献标识码〕B
Detection of peripheral blood micrometastasis in patients with hepatocellular carcinoma by nested RT-PCR
ZHOU Jing-xu,YANG Xi-shan,YUAN Ai-li,et al.
(PLA Institute for Digestive Diseases,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
〔Abstract〕 Objective To detect hepatocyte-associated gene AFPmRNA to demonstrate micrometastasis in peripheral blood.Methods AFPmRNA in peripheral blood was detected in 71 case with PHC,21 cases with cirrhosis,28 normal healthy controls,4 cases with metastatic liver cancer,4 cases with liver hemangioma,4 cases with liver abscess and 5 cases with other maligant diseases by means of nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Results Human AFPmRNA was detected in 39 out of 71 cases of PHC(54.9%),in which 8 patients with distal metastasis were all positive and in 31 without distal metastasis the positive rate was 49.2% (P<0.01).AFPmRNA was also positive in 2 cases of cirrhosis (2/21,9.5%),but negative in normal healthy control,metastatic liver cancer,liver hemangioma,liver abscess and other maligant disease.Conclusions Nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction is a very sensitive method for early detecting micrometastasis in patients with PHC,and suitable for extensive clinical application.
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〔Key words〕 primary hepatocellular carcinoma; alpha-fetoprotein(AFP); micrometastasis;nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction
原发性肝细胞癌的早期诊断率、可手术切除率近年来明显提高。特别是正位肝移植手术的开展，使肝癌合并肝硬化患者治愈有一线曙光。但患者术后复发率仍高，其主要原因之一是术前已发生了目前检查手段未能检测到的血道微转移[1-2]。近年来多聚合酶链反应技术的应用，使检测外周血中少量肿瘤细胞成为可能。作者采用巢式RT-PCR技术，以AFPmRNA为肝癌细胞的标志基因对原发性肝细胞癌患者外周血中的肿瘤细胞进行检测，并就AFPmRNA在原发性肝细胞癌血道转移的诊断价值进行评价。
材料与方法
检测对象：1997.2～1997.10我院住院原发性肝细胞癌71例，男63例，女8例，年龄17～70岁，平均44.9岁，经手术切除病理证实23例；肝穿活检病理证实6例，其余42例根据临床表现、血清AFP和影像学技术确诊。肝癌远处转移依靠X线片、B超、CT、MRI及全身骨扫描确诊。肝硬化21例，男16例，女5例，年龄31～62岁，平均42.4岁。正常对照28例，男17例，女11例，年龄21～48岁，平均35.2岁，其中20例本院健康献血人员。8例为无肝脏疾患的胃肠炎患者。转移性肝癌4例，肝血管瘤4例，肝脓肿4例。
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标本收集：受检者抽取肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液分离有核细胞，-70℃保存。同时抽血收集血清进行AFP检测。
RNA提取：采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取有核细胞总mRNA[3]，经紫外分光光度计和变性胶电泳鉴定，证明制备RNA的纯度及未被降解。
巢式逆转录酶聚合酶链反应：RF-PCR引物[4]由Sangon公司合成，引物序列见表1。根据引物设计，第一轮PCR产物长度为174bp，第二轮PCR终产物长度为101bp，内含一个Pst Ⅰ核酸内切酶位点，可将终产物酶切成60bp和41bp。可用此酶进行PCR扩增产物特异性鉴定。逆转录采用外端反义引物，M-MLV 200u,37℃，60分钟。PCR循环参数为：94℃ 30秒，55℃ 40秒72℃ 40秒，循环40次，最后在72℃继续延伸7分钟。两轮循环参数相同。产物可用电泳检测，其特异性可用酶切分析。
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表1 AFP-mRNA引物
引 物
位 置
序 列
Ex-Sense
90-112
5′-ACTGAATCCAGAACACTGCATAG-3′
Ex-antisense
263-241
5′-TGCAGTCAATGCATCTTTCACCA-3′
IN-sense
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5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′
IN-antisense
222-200
5′-AAGTGGCTTCTTGAACAAACTGC-3′
统计分析：采用X2检验，分析各组间差异。
结果
1.PCR 产物分析2%琼脂糖电泳，在紫外灯下，AFPmRNA阳性者可见101bp电泳带。该产物用Pstl酶切后可分为61bp和40bp长度片段。结果见附图1、2。
2.外周血AFPmRNA检测结果：肝癌组外周血AFPmRNA检出39/71(54.9%)例，肝硬化检出2/21(9.5%)例，转移性肝癌、肝血管瘤、肝内脓肿、其它恶性肿瘤及健康对照均未检出。见表2。
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表2 各组外周血AFPmRNA检测结果
例数
AFPmRNA(-)
AFPmRNA(+)
原发性肝细胞癌
71
32
39
肝硬化
21
19
2
转移性肝癌
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4
4
0
肝血管瘤
4
4
0
其他恶性肿瘤
5
5
0
胰头癌
3
3
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0
肝恶性淋巴瘤
1
1
0
肝肉瘤
1
1
0
肝脓肿
4
4
0
健康对照
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28
0
3.血AFPmRNA与不同临床参数的关系：将71例原发性肝癌患者按肿瘤大体分型大小、有无肝内转移、门脉癌栓及远处转移分成各组，各组AFPmRNA的阳性率见附表3和附表4。 表3 AFPmRNA与临床参数
临床参数
例数
AFP>20
P值
AFPmRNA
(+)(%)
P值
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巨块型
62
41(66.1%)
31(50.0%)
<5cm
11
6(54.4%)
2(18.3%)
≥5cm
51
35(68.5%)
29(56.9%)*
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多发结节型
9
6(66.7%)
7(77.8%)
肝内转移
有
23
15(65.2%)
19(88.9%)
无
48
32(67.7%)
20(41.6%)**
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门脉癌栓
有
21
13(61.9%)
17(80.9%)
无
50
33(66.0%)
22(44.0%)**
远处转移
有
8
5(62.5%)
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8(100%)
无
63
43(68.3%)
31(49.2%)**
备注：与相应对照组相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01。 表4 AFPmRNA与肝癌分期的关系
临床分期
Ⅰ(%)
Ⅱ(%)
Ⅲ(%)
AFPmRNA阳性
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2(18.3)
7(29.2)
30(83.3)
AFPmRNA阴性
9(81.7)
17(79.8)
6(16.7)
总 计
11
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由表3可见，肿瘤直径≥5cm的巨块型肝癌AFPmRNA阳性率高于肿瘤直径<5cm巨块型肝癌(P<0.05)；有肝内转移、门脉癌栓和远处转移组AFPmRNA的阳性率显著高于无肝内转移、门脉癌栓和远处转移组(P<0.01)；多结节性肝癌AFPmRNA阳性较巨块型肝癌稍高，但无统计学意义(P=0.229)，而各组AFP血清水平无显著差异(P>0.05)。
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由表4可见，AFPmRNA与肝癌临床分期明显相关，Ⅲ期AFPmRNA阳性率和Ⅰ、Ⅱ期差别显著(P<0.01)。
讨论
原发性肝癌的转移是影响肝癌患者预后的重要因素，也是肝癌治疗失败的主要原因之一。早期发现转移，对指导患者的治疗、预后评价具有重要意义。近年来，一些研究者采用RT-PCR技术扩增肿瘤相关基因(标志基因)来检测循环血(骨髓)中少量肿瘤细胞来判定肿瘤血道转移的高危人群，早期诊断血道转移。如Morno[5]等用前列腺特异性膜抗原(PSA)mRNA检测外周血中前列腺癌细胞，Burchill[6]等用CK20mRNA检测外周血(骨髓)中的结肠癌细胞等等。其中标志基因的选择是决定检测特异性和敏感性的关键因素。一般来说，标志基因必须满足两个基本条件：在肿瘤细胞中强表达，而在外周血细胞中不表达。
AFP是一种胚胎性蛋白，研究证实，AFPmRNA在肝癌细胞中强表达，正常成人在肝细胞中微量表达，而在外周血细胞中不表达[7-8]，因而可用AFPmRNA作为肝细胞癌的标志基因，进行血道转移的检测。
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本组以AFPmRNA作为标志基因应用巢氏RT-PCR技术，检测71例肝癌患者，阳性率为54.9%(39/71)；而在肝硬化组阳性率为9.5%(2/21)，转移性肝癌、肝血管瘤、肝脓肿、其它肿瘤及健康对照均为阴性。肝癌病人AFPmRNA的阳性率较国外报道稍高[4，8]，可能本组晚期病人较多有关。而在肝硬化病人亦有AFPmRNA阳性的病例，推测可能在肝硬化进展过程中，由于肝纤维结构破坏，有新生的肝细胞脱落入血所致，但其阳性率远低于肝癌组。
本研究还发现，AFPmRNA 的检出率与肿瘤的大小、临床分期、门脉癌栓、肝内和肝外转移密切相关。>5cm的巨块型肝癌远较<5cm的肝癌阳性率高(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ期患者阳性率(18.3%、29.2%)远较Ⅲ期患者阳性率(83.3%)低，差异明显；AFPmRNA在门脉癌栓、肝内转移高达80.9%和88.9%，远处转移患者高达100%，与国外研究报告基本一致[4，8]。提示外周血中肝癌细胞的出现与肝癌的进展密切相关，外周血细胞AFPmRNA 检测对估计肝癌有无血行播散、肝内和肝外转移有重要价值，可作为判断肝癌患者预后和有无血道播散的重要指标。
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肿瘤细胞从原发部位脱落，侵蚀血管进入血循环是肿瘤转移过程中的主要步骤之一[10]。Nakano[11]等报道，即使直径<2cm的高分化肝细胞癌，肿瘤细胞也可能侵蚀血管壁形成血道微转移。Koop[12]等用活体视频显微镜(intravital videomicroscopy)观察B16F10黑色素瘤细胞株在鸡囊胚(chick embryos)血循环中的转归，发现24小时内80%以上的黑色素瘤细胞能在血循环中存活并从血管渗出。而不是象过去想象的那样大部分被血流的机械动力和免疫系统所破坏。动物实验证实，大约0.01%循环血中的肿瘤细胞可在远处器官生存下来，形成转移灶。我们的实验结果提示肝细胞癌血道播散发生的时间远比过去认为的早，即使是小肝癌，也可能发生血道播散。并且，血道播散可能是一种较连续的过程。用RT-PCR技术检测循环血中的肝癌细胞作为肝癌转移或复发的标准，有助于判定目前检测手段不能发现的无明显临床症状的早期转移或复发病例，提高医患的警惕性，加强随诊和给予恰当的治疗，是改善预后的重要措施。
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应用RT-PCR技术检测循环血中的肝癌细胞是一种灵敏度高、特异性较强的方法，不仅可用来判定肝癌患者有无血道播散，而且可用于指导治疗或判定疗效。
作者简介：周京旭(1969-)男，浙江安吉人，硕士，主治医师，从事消化内科专业。
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收稿日期：1999-5-10, 百拇医药