23-羟基桦木酸体外和体内抗黑色素瘤作用的研究
作者：叶银英 何道伟 叶文才 张庆文 赵守训
单位：叶银英(南京铁道医学院科学研究所 南京 210009)；何道伟(南京铁道医学院科学研究所 南京 210009)；叶文才(中国药科大学天然药物化学教研室)；张庆文(中国药科大学天然药物化学教研室)；赵守训(中国药科大学天然药物化学教研室)
关键词：23-羟基桦木酸；黑色素瘤细胞；细胞凋亡
23 〔摘要〕 目的 研究23-羟基桦木酸对体内、外B16黑色素瘤细胞生长的抑制及诱导凋亡作用。方法 应用MTT分析，电镜观察，流式细胞仪，肿瘤体积大小测定等方法，对23-羟基桦木酸诱导黑色素瘤细胞进行检测和观察。结果 23-羟基桦木酸体外30～80μg/ml处理，体内300mg/kg～600mg/kg灌胃时，对B16细胞有显著的生长抑制作用，有一定的剂量依赖关系并出现大量的凋亡细胞，同时体内肿瘤细胞被阻滞在G0～G1期，DNA合成受阻，肿瘤体积缩小。结论 23-羟基桦木酸对体内外黑色素瘤细胞增殖有强烈的抑制作用，诱导肿瘤细胞死亡的主要途径是凋亡。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R730.53；R739.5 〔文献标识码〕 A
The study of 23-hydroxyl betulinic acid against melanoma in vivo and in vitro
YE Yin-ying,HE Dao-wei，YE Wen-cai et al.
(Research institute of medicine,Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009)
〔Abstract〕 Objective To study 23-hydroxyl betulinic acid induced apoptosis and growth inhibition of B16 melanoma cell in vivo and in vitro.Methods MTT assay,electronic microscopy,flow cytometry and tumor volume assay were used to examine the effect of 23-hydroxyl betulinic acid on B16 melanoma cell line.Results 30～80μg/ml 23-hydroxyl betulinic acid in vitro and 300mg/kg～600mg/kg P.O.in vitro markedly inhibited the growth of B16 cells at a dose-dependent manner with a great number of apoptotic cells seen.Tumor size decreased markedly.Flow cytometry showed cell accumulation at G0～G1 stage and DNA synthesis retardation.Conclusions 23-hydroxyl betulinic acid potently inhibited the growth of B16 cell that functioned by induction of apoptosis.
, 百拇医药
〔Key words〕 23-hydroxyl betulinic acid;B16 melanoma cell;apoptosis
23-羟基桦木酸是从中药提取的衍生物，具有最有效的抗黑色素瘤成分。本中药具有清热解毒作用，由它提取的化合物经体外抑瘤实验，都有抑制黑色素瘤的活性成分，通过7种衍生物抑瘤实验的比较、分析，表明23-羟基桦木酸对黑色素瘤细胞抑制最明显。体外抑制黑色素瘤作用明显，对体内是否也有明显的抑制作用呢?我们以B16黑色素瘤细胞系为材料，进行体内、体外抑瘤实验的比较研究，确定它的疗效，为寻找新的临床治疗药物提供理论依据。
材料和方法
一、材料：细胞系培养条件：小鼠黑色素瘤细胞系B16和人黑色素瘤细胞系A375由上海细胞所引进，培养在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，用0.25%胰酶消化传代，每两天传一次代。药物配制：23-羟基桦木酸由中国药科大学天然药物化学教研室分离、提取。体外给药的配制：将提取的23-羟基桦木酸粉末高温、高压灭菌，然后用0.05%的DMSO溶解粉末，用含有血清的RPMI1640配成100μg/ml的原液呈悬浮状，放入4℃冰箱，经常摇动，再用含有血清的RPMI1640培养液稀释成需要的浓度。体内给药的药物配制：将提取的23-羟基桦木酸用研钵研磨细后，再用蒸馏水配成所需浓度的悬液。实验动物：BALB/C小鼠，2月龄，体重18～22g，雌雄各半。
, http://www.100md.com
二、方法：1.MTT实验：将10、20、40、80μg/ml 23-羟基桦木酸的药物浓度作用于96孔板细胞中培养3天，每孔加入5μg/ml MTT(Sigma)20μl，继续培养4小时，轻轻吸去上清液，加入1N HCL-异丙醇。每孔的沉淀物，用吸管用力吹打均匀，在核酸蛋白检测仪(型号SPECTRA MAX-250，波长570 nm)进行检测。生长抑制率=[1-(实验孔的OD值/对照孔的OD值)]×100%。2.荷瘤小鼠的抑瘤实验：取小鼠B16细胞系对数生长期细胞，用生理盐水配成一定浓度接种于BALB/C小鼠的脚掌(2.4×106/只)。共分5组，对照组(不给药)，100mg/kg,300mg/kg，600mg/kg，前四组在接种B16黑色素瘤细胞后的第二天就连续15天给小鼠灌胃。最后一组在前四组已灌胃10天，这组小鼠肿瘤平均体积已长至11.38mm3，再开始给药，同样连续灌胃15天停药，以后每3天用游标卡尺测一次肿瘤体积，公式：a×b2(a为长径，b为短径)。3.肿瘤组织的电镜观察：小鼠实验结束时，取100μg/ml,300μg/ml,对照组小鼠的肿瘤组织块进行常规的戊二醛固定、包埋后，切片测定并进行拍照记录。4.细胞周期及DNA碎片的分析：小鼠实验结束时，取300mg/kg,600mg/kg(形成肿瘤后再治疗的小鼠)，对照组的肿瘤组织块，用剪刀剪碎、匀浆、尼龙网过滤，用PBS洗涤3次，1000转/分离心，加1%Triton-X-100，33℃孵育，离心，加0.01%KNA酶消化，离心，加0.005%PI染色，用300目尼龙网过滤，15分钟后上机检测(美国BD公司FACS Calibur机)。
, http://www.100md.com
结果
一、23-羟基桦木酸对黑色素瘤细胞增殖的影响：
从图1、图2中看出，不同浓度的23-羟基桦木酸作用于黑色素瘤细胞3天，都受到不同程度的抑制。经统计学t检验分析，有显著差异，40μg/ml～80μg/ml的浓度与对照组比较，P<0.001。用MTT法测得人A375细胞的半数抑制量IC50为11.46μg/ml，小鼠B16细胞为17.99μg/ml。23-羟基桦木酸对人A375细胞系的敏感性高于B16细胞系。同一浓度的药物作用于细胞时间不同，显示出抑制效应也不同，随着药物作用时间的延长，对肿瘤细胞的抑制率增加(图3)。
图1 23-羟基桦木酸对人A375黑色素瘤细胞增殖的影响
, 百拇医药
图2 23-羟基桦木酸对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的影响
图3 23-羟基桦木酸对小鼠B16黑色素瘤细胞的时间抑制效应
二、体内抑瘤作用：1.第一批体内抑瘤实验：每只BALB/C小鼠脚掌接种B16细胞1.5×106，第二天进行灌胃治疗，与对照组比较，肿瘤形成能力明显降低，30天后，对照组4/9小鼠生长肿瘤，而600mg/ml组在接种后18天，有3/9小鼠长瘤，至21天只有2/6长瘤，第26天全部缩小退去(0/9)。从表1中可以看出，随着药物剂量的增加，小鼠长瘤的数目减少。
表1 23-羟基桦木酸对B16黑色素瘤细胞体内抑瘤的影响
, http://www.100md.com
组别
药和物浓度
(μg/ml)
长瘤小鼠数
肿瘤体积大小
1
0
4/9(44.4%)
米粒大小
2
100
3/9(33.3%)
半个米粒大小
, http://www.100md.com
3
300
2/10(20%)
半个米粒大小
4
600
0/9(0)
肿瘤消失
2.第一批体内抑瘤实验：每只BALB/C小鼠脚掌接种B16细胞2.4×106，40天后全部处死小鼠，剥离肿瘤组织进行称重。从表2可以看出，随着药物浓度的增加，组织块重量减小，肿瘤的抑制率上升。 表2 23-羟基桦木酸对B16细胞的体内抑瘤作用
药物剂量
, http://www.100md.com
(mg/kg)
给药程序
小鼠数量
(只)
肿瘤重量
(mg)
抑瘤率
(%)
0
第二天灌胃
12
200
/
, 百拇医药
100
第二天灌胃
10
180
10
300
第二天灌胃
11
100
50
600
第二天灌胃
10
, http://www.100md.com
50
75
600
第十天灌胃
8
50
75
从图4中可以看出，100，300，600mg/kg三组小鼠在接种B16黑色素瘤细胞后的第二天，就进行药物治疗，第八天给药组与不给药组都开始长肿瘤，但与对照组比较，肿瘤体积明显要小一些，随着时间的延长，肿瘤缩小更多些。最后一组600mg/kg组在接种肿瘤细胞后第十天开始药物治疗，肿瘤已长至11.38mm3，肿瘤继续长大，第十二天，肿瘤体积长到13.94mm3，然后逐渐缩小，到40天时平均体积只有5.75mm3，与开始治疗时比较，8只小鼠有7只小鼠瘤块消退。
, http://www.100md.com
图4 23-羟基桦木酸对B16肿瘤细胞的抑制作用
图5A B16细胞(对照组)×6000
三、电镜观察：电镜下，体内、体外，加药与不加药黑色素瘤B16细胞形态相比(图5A)，可见加药后B16细胞发生了典型的凋亡细胞形态变化，细胞变小、胞浆浓缩、内质网扩张、核仁消失、染色质聚集浓缩为一个或数个团块，有时可形成新月帽状，许多细胞内出现空泡，最后形成外膜包绕的内涵物不外溢凋亡小体(图5B、图5C)。
, http://www.100md.com
图5B 体外给药30μg/ml×6000
图5C 体内给药300mg/kg×4000
四、23-羟基桦木酸对B16细胞周期的影响：用300，600mg/kg药物及蒸馏水治疗荷瘤小鼠15天，40天后处死小鼠，取出肿瘤组织进行细胞流式仪检测，结果表明，用300，600mg/kg23-羟基桦木酸治疗小鼠，B16黑色素瘤细胞被阻断在G0～G1期，S期明显减少(表3)，使DNA合成能力降低，因而治疗小鼠的肿瘤块明显缩小。
表3 23-羟基桦木酸对B16黑色素瘤细胞周期的影响
组别
, 百拇医药
G1(%)
S(%)
G2+M(%)
0
85.55
4.44
10.01
300(mg/kg)
94.71
2.92
2.37
600(mg/kg)
97.19
, http://www.100md.com
0
2.81
讨论
一、23-羟基桦木酸对体外黑色素瘤B16细胞有明显的抑瘤作用，电镜下观察到典型的凋亡细胞，流式细胞仪(FCM)上检测到凋亡峰的剂量效应关系(30μg/ml药物处理24小时有10.24%的细胞发生凋亡，50μg/ml有14.88%，对照组也有3.51%细胞发生凋亡)。说明药物抑瘤作用与肿瘤细胞凋亡有关，有的作者认为在寻找癌有效抑制的其它方法及药物时，应将诱导细胞凋亡的能力作为一个重要指标[1-2]。
二、肿瘤细胞凋亡研究已成为人们普遍关注的生命科学领域中的一大热点[3]，抗肿瘤药物常能诱导敏感的肿瘤细胞凋亡，并且抗肿瘤效能与肿瘤细胞在它的诱导下发生凋亡的敏感程度有关[4]。中药提取的23-羟基桦木酸对黑色素瘤细胞抗肿瘤作用，低剂量(20～40μg/ml处理48小时)诱导细胞分化，细胞形态由堆积变为平铺，与苯乙酸钠诱导黑色素瘤细胞形态变化类似，呈一定的极性生长[5]。小鼠用300～600mg/kg药物灌胃治疗移植的黑色素瘤，经FCM检测发现大量的细胞被阻滞在G0～G1期，进入S期的细胞数量减少，使细胞DNA合成能力降低，从而使肿瘤体积缩小。
, 百拇医药
三、桦树皮提取的桦木酸能诱导黑色素瘤细胞凋亡[6]，Fulda S等进一步研究，认为是引起细胞内线粒体通透性改变，最后导致细胞凋亡[7]，最近国外一些报导，桦木酸对HIV[8]、神经母细胞瘤[9]等有很好的疗效，故桦木酸是很有开发前景的药物。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39770898)
作者简介：叶银英(1939-)，女，上海浦东人，研究员。从事细胞生物学工作。
参考文献
1，廖泉，赵玉沛，蔡力行等.化疗药物不同配伍诱导人胰腺癌细胞株凋亡.中国医学科学院学报，1999；21(2)：122
2，Lowe S W,HE.Ruley,T.Jncks et al.P53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993；74:957
, 百拇医药
3，曹世龙.肿瘤学新理论与新技术.上海科技教育出版社，1997；284
4，Dive C, J.A.Hickman.Drug-target interaction:only the first step in the commitment to a programmed cell death.Br J Cancer,1991；64:192
5，叶银英，何道伟，杨天明等.苯乙酸钠对小鼠B16黑色素瘤细胞分化诱导作用.中国肿瘤临床与康复，1998；5(4)
6，Pish E.,H.chai IS.Lec et al.Discovery of betulinc acid as a selective inhibition of human melanoma that functions by induction of apoptosis.Nat Med,1995；1(10):1046
, http://www.100md.com
7，Vietinck-AJ,De-Bruyen-T,Apere-S,et al.Plant-derived leading compound for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV)infection.Planta med.1998；64(2):97
8，Fulda-S,C-Scaffidi, SA.Susin et al.Molecular ordering of apoptosis induced by anticancer drugs in neuroblastoma cells.Cancer Res,1998；64(2):97
9，Fulda S,C-Scaffidi,SA.Susin et al.Activation of mitochondria and release of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic acid.J Biol Chem,1998；273(51):53942-8, 百拇医药
单位：叶银英(南京铁道医学院科学研究所 南京 210009)；何道伟(南京铁道医学院科学研究所 南京 210009)；叶文才(中国药科大学天然药物化学教研室)；张庆文(中国药科大学天然药物化学教研室)；赵守训(中国药科大学天然药物化学教研室)
关键词：23-羟基桦木酸；黑色素瘤细胞；细胞凋亡
23 〔摘要〕 目的 研究23-羟基桦木酸对体内、外B16黑色素瘤细胞生长的抑制及诱导凋亡作用。方法 应用MTT分析，电镜观察，流式细胞仪，肿瘤体积大小测定等方法，对23-羟基桦木酸诱导黑色素瘤细胞进行检测和观察。结果 23-羟基桦木酸体外30～80μg/ml处理，体内300mg/kg～600mg/kg灌胃时，对B16细胞有显著的生长抑制作用，有一定的剂量依赖关系并出现大量的凋亡细胞，同时体内肿瘤细胞被阻滞在G0～G1期，DNA合成受阻，肿瘤体积缩小。结论 23-羟基桦木酸对体内外黑色素瘤细胞增殖有强烈的抑制作用，诱导肿瘤细胞死亡的主要途径是凋亡。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R730.53；R739.5 〔文献标识码〕 A
The study of 23-hydroxyl betulinic acid against melanoma in vivo and in vitro
YE Yin-ying,HE Dao-wei，YE Wen-cai et al.
(Research institute of medicine,Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009)
〔Abstract〕 Objective To study 23-hydroxyl betulinic acid induced apoptosis and growth inhibition of B16 melanoma cell in vivo and in vitro.Methods MTT assay,electronic microscopy,flow cytometry and tumor volume assay were used to examine the effect of 23-hydroxyl betulinic acid on B16 melanoma cell line.Results 30～80μg/ml 23-hydroxyl betulinic acid in vitro and 300mg/kg～600mg/kg P.O.in vitro markedly inhibited the growth of B16 cells at a dose-dependent manner with a great number of apoptotic cells seen.Tumor size decreased markedly.Flow cytometry showed cell accumulation at G0～G1 stage and DNA synthesis retardation.Conclusions 23-hydroxyl betulinic acid potently inhibited the growth of B16 cell that functioned by induction of apoptosis.
, 百拇医药
〔Key words〕 23-hydroxyl betulinic acid;B16 melanoma cell;apoptosis
23-羟基桦木酸是从中药提取的衍生物，具有最有效的抗黑色素瘤成分。本中药具有清热解毒作用，由它提取的化合物经体外抑瘤实验，都有抑制黑色素瘤的活性成分，通过7种衍生物抑瘤实验的比较、分析，表明23-羟基桦木酸对黑色素瘤细胞抑制最明显。体外抑制黑色素瘤作用明显，对体内是否也有明显的抑制作用呢?我们以B16黑色素瘤细胞系为材料，进行体内、体外抑瘤实验的比较研究，确定它的疗效，为寻找新的临床治疗药物提供理论依据。
材料和方法
一、材料：细胞系培养条件：小鼠黑色素瘤细胞系B16和人黑色素瘤细胞系A375由上海细胞所引进，培养在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，用0.25%胰酶消化传代，每两天传一次代。药物配制：23-羟基桦木酸由中国药科大学天然药物化学教研室分离、提取。体外给药的配制：将提取的23-羟基桦木酸粉末高温、高压灭菌，然后用0.05%的DMSO溶解粉末，用含有血清的RPMI1640配成100μg/ml的原液呈悬浮状，放入4℃冰箱，经常摇动，再用含有血清的RPMI1640培养液稀释成需要的浓度。体内给药的药物配制：将提取的23-羟基桦木酸用研钵研磨细后，再用蒸馏水配成所需浓度的悬液。实验动物：BALB/C小鼠，2月龄，体重18～22g，雌雄各半。
, http://www.100md.com
二、方法：1.MTT实验：将10、20、40、80μg/ml 23-羟基桦木酸的药物浓度作用于96孔板细胞中培养3天，每孔加入5μg/ml MTT(Sigma)20μl，继续培养4小时，轻轻吸去上清液，加入1N HCL-异丙醇。每孔的沉淀物，用吸管用力吹打均匀，在核酸蛋白检测仪(型号SPECTRA MAX-250，波长570 nm)进行检测。生长抑制率=[1-(实验孔的OD值/对照孔的OD值)]×100%。2.荷瘤小鼠的抑瘤实验：取小鼠B16细胞系对数生长期细胞，用生理盐水配成一定浓度接种于BALB/C小鼠的脚掌(2.4×106/只)。共分5组，对照组(不给药)，100mg/kg,300mg/kg，600mg/kg，前四组在接种B16黑色素瘤细胞后的第二天就连续15天给小鼠灌胃。最后一组在前四组已灌胃10天，这组小鼠肿瘤平均体积已长至11.38mm3，再开始给药，同样连续灌胃15天停药，以后每3天用游标卡尺测一次肿瘤体积，公式：a×b2(a为长径，b为短径)。3.肿瘤组织的电镜观察：小鼠实验结束时，取100μg/ml,300μg/ml,对照组小鼠的肿瘤组织块进行常规的戊二醛固定、包埋后，切片测定并进行拍照记录。4.细胞周期及DNA碎片的分析：小鼠实验结束时，取300mg/kg,600mg/kg(形成肿瘤后再治疗的小鼠)，对照组的肿瘤组织块，用剪刀剪碎、匀浆、尼龙网过滤，用PBS洗涤3次，1000转/分离心，加1%Triton-X-100，33℃孵育，离心，加0.01%KNA酶消化，离心，加0.005%PI染色，用300目尼龙网过滤，15分钟后上机检测(美国BD公司FACS Calibur机)。
, http://www.100md.com
结果
一、23-羟基桦木酸对黑色素瘤细胞增殖的影响：
从图1、图2中看出，不同浓度的23-羟基桦木酸作用于黑色素瘤细胞3天，都受到不同程度的抑制。经统计学t检验分析，有显著差异，40μg/ml～80μg/ml的浓度与对照组比较，P<0.001。用MTT法测得人A375细胞的半数抑制量IC50为11.46μg/ml，小鼠B16细胞为17.99μg/ml。23-羟基桦木酸对人A375细胞系的敏感性高于B16细胞系。同一浓度的药物作用于细胞时间不同，显示出抑制效应也不同，随着药物作用时间的延长，对肿瘤细胞的抑制率增加(图3)。
图1 23-羟基桦木酸对人A375黑色素瘤细胞增殖的影响
, 百拇医药
图2 23-羟基桦木酸对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的影响
图3 23-羟基桦木酸对小鼠B16黑色素瘤细胞的时间抑制效应
二、体内抑瘤作用：1.第一批体内抑瘤实验：每只BALB/C小鼠脚掌接种B16细胞1.5×106，第二天进行灌胃治疗，与对照组比较，肿瘤形成能力明显降低，30天后，对照组4/9小鼠生长肿瘤，而600mg/ml组在接种后18天，有3/9小鼠长瘤，至21天只有2/6长瘤，第26天全部缩小退去(0/9)。从表1中可以看出，随着药物剂量的增加，小鼠长瘤的数目减少。
表1 23-羟基桦木酸对B16黑色素瘤细胞体内抑瘤的影响
, http://www.100md.com
组别
药和物浓度
(μg/ml)
长瘤小鼠数
肿瘤体积大小
1
0
4/9(44.4%)
米粒大小
2
100
3/9(33.3%)
半个米粒大小
, http://www.100md.com
3
300
2/10(20%)
半个米粒大小
4
600
0/9(0)
肿瘤消失
2.第一批体内抑瘤实验：每只BALB/C小鼠脚掌接种B16细胞2.4×106，40天后全部处死小鼠，剥离肿瘤组织进行称重。从表2可以看出，随着药物浓度的增加，组织块重量减小，肿瘤的抑制率上升。 表2 23-羟基桦木酸对B16细胞的体内抑瘤作用
药物剂量
, http://www.100md.com
(mg/kg)
给药程序
小鼠数量
(只)
肿瘤重量
(mg)
抑瘤率
(%)
0
第二天灌胃
12
200
/
, 百拇医药
100
第二天灌胃
10
180
10
300
第二天灌胃
11
100
50
600
第二天灌胃
10
, http://www.100md.com
50
75
600
第十天灌胃
8
50
75
从图4中可以看出，100，300，600mg/kg三组小鼠在接种B16黑色素瘤细胞后的第二天，就进行药物治疗，第八天给药组与不给药组都开始长肿瘤，但与对照组比较，肿瘤体积明显要小一些，随着时间的延长，肿瘤缩小更多些。最后一组600mg/kg组在接种肿瘤细胞后第十天开始药物治疗，肿瘤已长至11.38mm3，肿瘤继续长大，第十二天，肿瘤体积长到13.94mm3，然后逐渐缩小，到40天时平均体积只有5.75mm3，与开始治疗时比较，8只小鼠有7只小鼠瘤块消退。
, http://www.100md.com
图4 23-羟基桦木酸对B16肿瘤细胞的抑制作用
图5A B16细胞(对照组)×6000
三、电镜观察：电镜下，体内、体外，加药与不加药黑色素瘤B16细胞形态相比(图5A)，可见加药后B16细胞发生了典型的凋亡细胞形态变化，细胞变小、胞浆浓缩、内质网扩张、核仁消失、染色质聚集浓缩为一个或数个团块，有时可形成新月帽状，许多细胞内出现空泡，最后形成外膜包绕的内涵物不外溢凋亡小体(图5B、图5C)。
, http://www.100md.com
图5B 体外给药30μg/ml×6000
图5C 体内给药300mg/kg×4000
四、23-羟基桦木酸对B16细胞周期的影响：用300，600mg/kg药物及蒸馏水治疗荷瘤小鼠15天，40天后处死小鼠，取出肿瘤组织进行细胞流式仪检测，结果表明，用300，600mg/kg23-羟基桦木酸治疗小鼠，B16黑色素瘤细胞被阻断在G0～G1期，S期明显减少(表3)，使DNA合成能力降低，因而治疗小鼠的肿瘤块明显缩小。
表3 23-羟基桦木酸对B16黑色素瘤细胞周期的影响
组别
, 百拇医药
G1(%)
S(%)
G2+M(%)
0
85.55
4.44
10.01
300(mg/kg)
94.71
2.92
2.37
600(mg/kg)
97.19
, http://www.100md.com
0
2.81
讨论
一、23-羟基桦木酸对体外黑色素瘤B16细胞有明显的抑瘤作用，电镜下观察到典型的凋亡细胞，流式细胞仪(FCM)上检测到凋亡峰的剂量效应关系(30μg/ml药物处理24小时有10.24%的细胞发生凋亡，50μg/ml有14.88%，对照组也有3.51%细胞发生凋亡)。说明药物抑瘤作用与肿瘤细胞凋亡有关，有的作者认为在寻找癌有效抑制的其它方法及药物时，应将诱导细胞凋亡的能力作为一个重要指标[1-2]。
二、肿瘤细胞凋亡研究已成为人们普遍关注的生命科学领域中的一大热点[3]，抗肿瘤药物常能诱导敏感的肿瘤细胞凋亡，并且抗肿瘤效能与肿瘤细胞在它的诱导下发生凋亡的敏感程度有关[4]。中药提取的23-羟基桦木酸对黑色素瘤细胞抗肿瘤作用，低剂量(20～40μg/ml处理48小时)诱导细胞分化，细胞形态由堆积变为平铺，与苯乙酸钠诱导黑色素瘤细胞形态变化类似，呈一定的极性生长[5]。小鼠用300～600mg/kg药物灌胃治疗移植的黑色素瘤，经FCM检测发现大量的细胞被阻滞在G0～G1期，进入S期的细胞数量减少，使细胞DNA合成能力降低，从而使肿瘤体积缩小。
, 百拇医药
三、桦树皮提取的桦木酸能诱导黑色素瘤细胞凋亡[6]，Fulda S等进一步研究，认为是引起细胞内线粒体通透性改变，最后导致细胞凋亡[7]，最近国外一些报导，桦木酸对HIV[8]、神经母细胞瘤[9]等有很好的疗效，故桦木酸是很有开发前景的药物。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39770898)
作者简介：叶银英(1939-)，女，上海浦东人，研究员。从事细胞生物学工作。
参考文献
1，廖泉，赵玉沛，蔡力行等.化疗药物不同配伍诱导人胰腺癌细胞株凋亡.中国医学科学院学报，1999；21(2)：122
2，Lowe S W,HE.Ruley,T.Jncks et al.P53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993；74:957
, 百拇医药
3，曹世龙.肿瘤学新理论与新技术.上海科技教育出版社，1997；284
4，Dive C, J.A.Hickman.Drug-target interaction:only the first step in the commitment to a programmed cell death.Br J Cancer,1991；64:192
5，叶银英，何道伟，杨天明等.苯乙酸钠对小鼠B16黑色素瘤细胞分化诱导作用.中国肿瘤临床与康复，1998；5(4)
6，Pish E.,H.chai IS.Lec et al.Discovery of betulinc acid as a selective inhibition of human melanoma that functions by induction of apoptosis.Nat Med,1995；1(10):1046
, http://www.100md.com
7，Vietinck-AJ,De-Bruyen-T,Apere-S,et al.Plant-derived leading compound for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV)infection.Planta med.1998；64(2):97
8，Fulda-S,C-Scaffidi, SA.Susin et al.Molecular ordering of apoptosis induced by anticancer drugs in neuroblastoma cells.Cancer Res,1998；64(2):97
9，Fulda S,C-Scaffidi,SA.Susin et al.Activation of mitochondria and release of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic acid.J Biol Chem,1998；273(51):53942-8, 百拇医药