应用图象处理系统对深低温停循环后神经细胞中钙颗粒定量分析
作者：李莉 邵新立 刘春新汪艳
单位：430072 武汉大学分析测试中心(李莉)；北京天坛医院神经外科研究所博士后；站(邵新立)；湖北医科大学实验中心(刘新春、汪艳)
关键词：细胞化学；神经生理学；钙/代谢；低温,人工；神经元/超微结构；二磷酸盐类/治疗应用；狗
摘 要 目的 用草酸 摘 要 目的 用草酸-焦锑酸钾细胞化学法显示深低温(18℃)停循环(DHCA)120分
钟后脑神经细胞内Ca2+的分布及超微结构改变。方法 利用图象处理系统同时对正常组、对照
组及保护组细胞内钙颗粒的体密度、数密度及颗粒大小等进行定量分析。结果 DHCA 120分钟
, 百拇医药
后脑神经细胞超微结构破坏严重，细胞内钙颗粒明显增加。但在DHCA期间应用1,6-二磷酸果
糖(FDP)脑保护液后，细胞内钙颗粒明显减少，超微结构破坏明显减轻。结论 在DHCA中,FDP可以有效地防止脑细胞的损伤。
中图号 R318.03;R338.25
Quantitative Study on Ca2+ Granules in Neuron after Deep Hypothermic Circulatory Arrest by
, 百拇医药 Using Image Processing System Li Li, Shao Xinli, Liu Chunxin, et al.Center of Analysis & Measurement,Wuhan University, Wuhan 430072
Abstract Objective The distribution of Ca2+ and ultrastructural changes in brain neuron after 120
minutes of deep hypothermic (18℃) circulatory arrest (DHCA) were determined by using K-pyroantimonate
, http://www.100md.com
cytochemistry method. Methods The image processing system was employed to measure the volume density,count density as well as the size of the intracellular Ca2+ granules of the normal group, contrasting group and
the protected group. Results The ultrastructure of brain neuron was damaged severely, and the intracellular
Ca2+ granules increased significantly after 120 minutes of DHCA. When fructose-1,6-diphosphate (FDP)
, http://www.100md.com
cerebro-protection liquid was employed during DHCA, the number of intracellular Ca2+ granules decreased
significantly while the damage to the ultrastructure was reduced to a great degree. Conclusion FDP can
efficiently protect brain neuron in DHCA.
Key words cytochemistry;neurophysiology;calcium/metab;hypothermia,induced;neurons/ultrastruct;
, http://www.100md.com
diphosphonates/ther use;dogs
钙内流及随后的细胞内钙超载，能导致一定类型的细胞死亡，这已被认为是缺血缺氧性细
胞损伤的一个基本原因。近年来临床与实验研究表明，在15℃ ～18℃的深低温下，脑组织可以
耐受缺血缺氧的时限为45～60分钟〔1〕，然而停循环时间太短，许多复杂畸形的修复手术又不
能顺利完成。本实验采用犬DHCA模型，结合焦锑酸钾组化技术，观察DHCA 120分钟后脑神经
细胞内Ca2+分布和超微结构改变，并应用图象处理系统对细胞内钙颗粒的数密度、体密度及颗
粒大小等参数进行定量分析，试图探索钙内流在超微结构改变中的重要作用，寻求一种DHCA
, 百拇医药
120分钟下脑保护的有效方法。
材 料 和 方 法
一、DHCA脑损伤动物模型的建立
用闭胸式体外循环(CPB)方法建立犬DHCA模型，动物经血流降温至鼓膜温18℃后，停止
全身循环2小时.，期间以冰袋覆盖头部维持脑温，用α方式管理血气。停循环结束后复温至37℃，继续观察8小时后处死动物。
9只成年犬随机分成三组，正常组(n=1)、对照组(n=4)进行单纯18℃DHCA 2小时，术
中不用药物，脑保护组(n=4)于DHCA结束时经颈静脉向头部注射FDP 375 mg/kg(Sigma公司
, 百拇医药
产品)。其中对照组又分为DHCA结束、再灌60分钟和术后8小时三个小组。保护组分为再灌60
分钟和术后8小时二个小组。取右侧额顶叶皮质观察。
二、Ca2+电镜组化显示技术〔2,3〕
迅速取样后，将样品放在预冷的蜡板上并在组织表面滴预冷的3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾
溶液，切小组织后置于上液中进行0～4℃固定2小时，随后用7.5%蔗糖-90 mmol/L草酸钾溶液振
荡浸洗，继之以1%锇酸-2%焦锑酸钾做后固定，然后进行酒精梯度脱水，环氧树脂812浸透过
液，平板包埋、超薄切片后经醋酸铀与柠檬酸铅电子双重染色，日立H-600透射电镜观察、拍
, http://www.100md.com
照。
三、对细胞内钙颗粒进行定量分析〔4,5〕
细胞内钙颗粒的数密度(NV)为单位体积(1μm3)内该颗粒的数量，可按公式Nv=NA·D
计算〔6〕。NA为颗粒的面数密度，即单位截面积(A)中钙颗粒数(n)，NA＝(n)/(A)，D为颗粒
的平均直径。式中n, A及同一截面内各颗粒的直径d1, d2, …, dn都可用图象分析仪测得。体密度
VV为单位体积细胞质内的颗粒体积VV=(n)/(i=1Axi)/(n)/(i=1Ari)(Axi为第i张照片上钙颗粒的截
, 百拇医药
面面积，Ari为第i张照片上参照系的截面面积)。
二维图象上的面积通过图象处理仪很容易测得。收集资料时，在H-600透射电镜下观察，放大倍数6 000倍左右。动物共分三组：正常组、对照组和保护组。其中对照组又分为DHCA结
束、再灌60分钟和术后8小时，保护组分为再灌60分钟和术后8小时.。每组约拍6张照片，共获
40张左右。电镜照片通过摄像机输入显示屏。我们通过Ca2+细胞化学技术能使细胞内Ca2+原位
沉淀，在电镜下可见到高电子密度的Ca2+颗粒，图象处理仪很容易分辨。通过二值图分割，留
下感兴趣的钙离子颗粒，由德国产IBAS图象处理系统进行分析计算，从而获得颗粒直径、颗粒
, 百拇医药
平均面积、颗粒的最大径和最小径等参数。再通过计算求得数密度和体密度，结果见表1，并
用t检验求出各组t值，得出各组间的参数差异程度。
结 果
一、细胞的超微结构改变
在透射电镜下可见正常组神经细胞内钙颗粒分布较少, 细胞器结构正常。见图1。对照组
在经DHCA 2小时后，神经细胞破坏明显，线粒体肿胀，嵴断裂，胞质与线粒体内均可见到较
多黑色圆形钙颗粒，大小不等、分布不均，呈单个沉着，见图2。DHCA 2小时再灌注60分钟，致密颗粒呈簇状聚积于线粒体，粗面内质网与高尔基复合体中，细胞器破坏明显，见图3。特
, 百拇医药
别是术后8小时，线粒体空泡变性呈“气球样”变化，内有簇状钙沉着，部分线粒体膜模糊不
清、结构消失，见图4。而脑保护组经用FDP后细胞损伤明显减轻，保护组DHCA 2小时后再灌
60分钟，细胞形态基本完整，线粒体轻度肿胀，细胞内钙颗粒较少，见图5。保护组术后8小时
细胞内钙聚积虽有所增加，但细胞器破坏不明显，见图6。
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图1 正常组神经细胞内黑色圆形物为钙颗粒，分布较少，细胞器结构正常 ×6 000
图2 对照组DHCA2小时，线粒体肿胀，嵴断裂，胞质与线粒体内见较多高密度黑色钙颗粒，呈单个沉着 ×6 000
图3 对照组DHCA2小时再灌注分钟，致密钙颗粒呈簇状聚集于线粒体，粗面内质网与高尔基
体中，细胞器破坏明显 ×10 000
图4 对照组术后8小时，线粒体空泡变性呈“气球样”变化，内有簇状钙沉着，部分线粒体膜
模糊不清，结构消失 ×10 000
图5 保护组DHCA2小时再灌注60分钟，细胞形态基本完整，线粒体轻度肿胀，细胞内钙颗粒有
, 百拇医药
所减少 ×6 000
图6 保护组术后8小时，细胞内钙聚集虽有所增加，但细胞破坏不太明显 ×6 000
二、细胞内钙颗粒的定量分析结果
应用图象处理系统对细胞内钙颗粒的数密度、体密度、颗粒平均面积及最大径和最小径
进行测量，测量结果见附表,图7。统计结果表明，对照组中DHCA结束，再灌60分钟与术后
8小时细胞内钙颗粒的数密度、体密度与正常组比较有高度显著性差异(P<0.01)，而保护组
中再灌60分钟和术后8小时组与对照组相比也有高度显著性差异(P<0.01)。说明脑保护液能
有效地阻止DHCA 2小时后细胞内Ca2+聚积并维持了细胞结构的基本正常。
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讨 论
Ca2+具有极高的生物活性，细胞内游离Ca2+是细胞间信息传递的中心环节，其浓度改变
是细胞生理功能及病理变化的重要物质基础。神经细胞的许多生理活动，如神经递质释放、膜内外信息传递，酶活性的调节等均有赖于Ca2+的参与。在脑缺血研究中，细胞内Ca2+浓度
变化正是这一领域研究的热点〔7〕。在正常生理状态下细胞外Ca2+浓度远远高于细胞内的浓
度。当脑组织缺血缺氧时，钠泵功能低下，大量钠离子进入细胞内引起细胞膜去极化，促使
Ca2+的电压依赖性通道开放，导致大量细胞外Ca2+内流，引起细胞内一些酶活性破坏而导致
, http://www.100md.com
细胞死亡。低温对减少全身，尤其是大脑的耗氧量是十分明显的，其脑保护作用长期以来亦
为人们所认识。然而依靠不断降低温度而延长脑缺血缺氧的时限则未必有效〔8〕。本实验结
果表明，尽管在18℃的低温下，DHCA 2小时后脑组织超微结构仍受到严重破坏。图象分析结
果证实：Ca2+细胞内聚积是造成脑损伤的重要原因。我们应用Ca2+细胞化学技术，能使细胞
内Ca2+原位沉淀，并在电镜下可见。焦锑酸钾对Ca2+有非常高的亲和力，几乎与100%Ca2+反
应发生原位沉淀。采用这项技术能在透射电镜下对Ca2+的分布情况进行观察分析。本实验结
, http://www.100md.com
果显示：正常组细胞内Ca2+颗粒较少，形态规则、分布均匀。而缺血缺氧时黑色Ca2+颗粒明
显增加、大小不等，有些呈丛状聚积于粗面内织网池与线粒体附近。本实验在DHCA 2小时结
束至复温8小时的脑组织样品中均观察到细胞内Ca2+的大量聚积，尤其以术后8小时更为明显。
这证实Ca2+在细胞内的不断聚积是造成术后脑损伤乃至继发性损伤的重要原因。这一研究结
果与国外学者的报道也是相符的〔9〕。
附表 各组细胞内钙颗粒形态学参数图象分析结果(
±s)
, http://www.100md.com
参 数
正常组
对 照 组
保 护 组
DHCA结果
再灌60分钟
术后8小时
再灌60分钟
术后8小时
体密度(VV)
0.43±0.08
1.47±0.52*
, 百拇医药
3.57±1.01*
4.16±0.87*
0.51±0.06**
0.60±0.12**
数密度(NV)
3.92±0.55
9.89±1.70*
22.98±2.76*
21.35±2.66*
, 百拇医药 4.93±0.39**
16.21±1.16**
平均面积(Am)
0.016±0.009
0.022±0.008
0.030±0.010
0.049±0.014
0.013±0.009
0.0021±0.0008
最大径(Dmax)
, 百拇医药
0.16±0.05
0.186±0.037
0.210±0.050
0.282±0.039
0.143±0.039
0.064±0.009
最小径(Dmin)
0.11±0.04
0.116±0.033
0.18±0.04
0.22±0.03
, http://www.100md.com
0.11±0.03
0.048±0.009
注 * 与正常组比较 P<0.01, ** 与对照组比较 P<0.01
图7 各组中钙颗粒体密度及数密度直方图
本研究在用细胞化学法成功地显示出Ca2+颗粒后，应用能谱仪对Ca2+进行了定量分析。
分析结果另文报道。虽然能谱仪可以直接对Ca2+浓度的变化进行定量分析，但由于钙的Kα
线(3.690 Kev)与锑的Lα线(3.604 Kev)太靠近，两峰重叠在一起，无法剥离，以致
, 百拇医药
于给Ca2+的定量分析带来困难，影响Ca2+浓度的精确度。但在能谱仪证实透射电镜下所见
黑色致密颗粒就是Ca2+的前提下，应用图象处理系统对Ca2+颗粒的数密度、体密度及颗粒
平均面积，最大径和最小径等参数进行定量分析，结果显示该方法较为准确地反映了DHCA
下神经细胞内Ca2+浓度的变化情况，是一种较为方便、准确的方法。
FDP是一种糖代谢的中间产物，近年来研究表明其具有改善能量代谢、降低Ca2+细胞内
聚积及减少兴奋性氨基酸释放与脂质过氧化反应、避免再灌注损伤的作用〔10〕。我们将其
, 百拇医药
用于DHCA下的脑保护中，研究结果表明：FDP有效地阻止了DHCA 2小时后细胞内Ca2+聚积，并维持了细胞结构的基本正常，是DHCA下药理性脑保护的可行方法。
(本文图1～6见插页第2页)
参 考 文 献
1 Svensson LG, Crawford ES, Hess KR, et al. Deep hypothermia with circulatory arrest: Determinants of
stroke and mortality in 656 patients. J Thorac Cardiovasc Surg, 1993, 106:19-31.
2 Joes A, Bran ET. Quantitative electron microscopic study of calcium accumulation in cerebral ischemia
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mitochondria. Surg Neural. 1985, 24:68-69.
3 Reempts JVA, Borgers M, Nollin SD. Identification of calcium in the retina by the combined use of
ultrastructural cytochemistry and laser microprobe mass analysis. J Histochem Cytochem,1984, 32:788-791.
4 郑富盛. 细胞形态立体计量学. 北京，北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990:12-153.
5 徐振兴. 定量细胞学和细胞化学技术. 吉林: 吉林科学技术出版社，1993:43-61.
, 百拇医药
6 钟慈声，丁航，俞彰,等. 血小板激活时其颗粒钙含量与颗粒数目相伴随减少. 电子显微学报，1996:15(2-4):301-306.
7 孙青芳. 兔局灶脑缺血后脑片游离钙的变化. 神经生化学通讯. 1995, 8(2):56-58.
8 Fessatidis IT, Thomas VL, Shore DF, et al. Brain damage after profoundly hypothermic circulatory arrest:
Correlation between neurophysiologic and neuropathologic findings. J Thorac Cardiovasc Surg,1993, 106:32-41.
9 Siesjo BK, Zhao Q, Pahlmark K, et al. Glutamate, calcium and free radicals as mediators of ischemic brain
damage. Ann Thorac Surg, 1995, 59:1316-1320.
10 Gregory GA, Welsh FA, Albert CH, et al. Fructose-1, 6-bisphosphate reduces ATP loss from hypoxic
astrocytes. Brain Res, 1990, 516:310-312.(收稿 1997-07-29 修回 1997-12-15), 百拇医药
单位：430072 武汉大学分析测试中心(李莉)；北京天坛医院神经外科研究所博士后；站(邵新立)；湖北医科大学实验中心(刘新春、汪艳)
关键词：细胞化学；神经生理学；钙/代谢；低温,人工；神经元/超微结构；二磷酸盐类/治疗应用；狗
摘 要 目的 用草酸 摘 要 目的 用草酸-焦锑酸钾细胞化学法显示深低温(18℃)停循环(DHCA)120分
钟后脑神经细胞内Ca2+的分布及超微结构改变。方法 利用图象处理系统同时对正常组、对照
组及保护组细胞内钙颗粒的体密度、数密度及颗粒大小等进行定量分析。结果 DHCA 120分钟
, 百拇医药
后脑神经细胞超微结构破坏严重，细胞内钙颗粒明显增加。但在DHCA期间应用1,6-二磷酸果
糖(FDP)脑保护液后，细胞内钙颗粒明显减少，超微结构破坏明显减轻。结论 在DHCA中,FDP可以有效地防止脑细胞的损伤。
中图号 R318.03;R338.25
Quantitative Study on Ca2+ Granules in Neuron after Deep Hypothermic Circulatory Arrest by
, 百拇医药 Using Image Processing System Li Li, Shao Xinli, Liu Chunxin, et al.Center of Analysis & Measurement,Wuhan University, Wuhan 430072
Abstract Objective The distribution of Ca2+ and ultrastructural changes in brain neuron after 120
minutes of deep hypothermic (18℃) circulatory arrest (DHCA) were determined by using K-pyroantimonate
, http://www.100md.com
cytochemistry method. Methods The image processing system was employed to measure the volume density,count density as well as the size of the intracellular Ca2+ granules of the normal group, contrasting group and
the protected group. Results The ultrastructure of brain neuron was damaged severely, and the intracellular
Ca2+ granules increased significantly after 120 minutes of DHCA. When fructose-1,6-diphosphate (FDP)
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cerebro-protection liquid was employed during DHCA, the number of intracellular Ca2+ granules decreased
significantly while the damage to the ultrastructure was reduced to a great degree. Conclusion FDP can
efficiently protect brain neuron in DHCA.
Key words cytochemistry;neurophysiology;calcium/metab;hypothermia,induced;neurons/ultrastruct;
, http://www.100md.com
diphosphonates/ther use;dogs
钙内流及随后的细胞内钙超载，能导致一定类型的细胞死亡，这已被认为是缺血缺氧性细
胞损伤的一个基本原因。近年来临床与实验研究表明，在15℃ ～18℃的深低温下，脑组织可以
耐受缺血缺氧的时限为45～60分钟〔1〕，然而停循环时间太短，许多复杂畸形的修复手术又不
能顺利完成。本实验采用犬DHCA模型，结合焦锑酸钾组化技术，观察DHCA 120分钟后脑神经
细胞内Ca2+分布和超微结构改变，并应用图象处理系统对细胞内钙颗粒的数密度、体密度及颗
粒大小等参数进行定量分析，试图探索钙内流在超微结构改变中的重要作用，寻求一种DHCA
, 百拇医药
120分钟下脑保护的有效方法。
材 料 和 方 法
一、DHCA脑损伤动物模型的建立
用闭胸式体外循环(CPB)方法建立犬DHCA模型，动物经血流降温至鼓膜温18℃后，停止
全身循环2小时.，期间以冰袋覆盖头部维持脑温，用α方式管理血气。停循环结束后复温至37℃，继续观察8小时后处死动物。
9只成年犬随机分成三组，正常组(n=1)、对照组(n=4)进行单纯18℃DHCA 2小时，术
中不用药物，脑保护组(n=4)于DHCA结束时经颈静脉向头部注射FDP 375 mg/kg(Sigma公司
, 百拇医药
产品)。其中对照组又分为DHCA结束、再灌60分钟和术后8小时三个小组。保护组分为再灌60
分钟和术后8小时二个小组。取右侧额顶叶皮质观察。
二、Ca2+电镜组化显示技术〔2,3〕
迅速取样后，将样品放在预冷的蜡板上并在组织表面滴预冷的3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾
溶液，切小组织后置于上液中进行0～4℃固定2小时，随后用7.5%蔗糖-90 mmol/L草酸钾溶液振
荡浸洗，继之以1%锇酸-2%焦锑酸钾做后固定，然后进行酒精梯度脱水，环氧树脂812浸透过
液，平板包埋、超薄切片后经醋酸铀与柠檬酸铅电子双重染色，日立H-600透射电镜观察、拍
, http://www.100md.com
照。
三、对细胞内钙颗粒进行定量分析〔4,5〕
细胞内钙颗粒的数密度(NV)为单位体积(1μm3)内该颗粒的数量，可按公式Nv=NA·D
计算〔6〕。NA为颗粒的面数密度，即单位截面积(A)中钙颗粒数(n)，NA＝(n)/(A)，D为颗粒
的平均直径。式中n, A及同一截面内各颗粒的直径d1, d2, …, dn都可用图象分析仪测得。体密度
VV为单位体积细胞质内的颗粒体积VV=(n)/(i=1Axi)/(n)/(i=1Ari)(Axi为第i张照片上钙颗粒的截
, 百拇医药
面面积，Ari为第i张照片上参照系的截面面积)。
二维图象上的面积通过图象处理仪很容易测得。收集资料时，在H-600透射电镜下观察，放大倍数6 000倍左右。动物共分三组：正常组、对照组和保护组。其中对照组又分为DHCA结
束、再灌60分钟和术后8小时，保护组分为再灌60分钟和术后8小时.。每组约拍6张照片，共获
40张左右。电镜照片通过摄像机输入显示屏。我们通过Ca2+细胞化学技术能使细胞内Ca2+原位
沉淀，在电镜下可见到高电子密度的Ca2+颗粒，图象处理仪很容易分辨。通过二值图分割，留
下感兴趣的钙离子颗粒，由德国产IBAS图象处理系统进行分析计算，从而获得颗粒直径、颗粒
, 百拇医药
平均面积、颗粒的最大径和最小径等参数。再通过计算求得数密度和体密度，结果见表1，并
用t检验求出各组t值，得出各组间的参数差异程度。
结 果
一、细胞的超微结构改变
在透射电镜下可见正常组神经细胞内钙颗粒分布较少, 细胞器结构正常。见图1。对照组
在经DHCA 2小时后，神经细胞破坏明显，线粒体肿胀，嵴断裂，胞质与线粒体内均可见到较
多黑色圆形钙颗粒，大小不等、分布不均，呈单个沉着，见图2。DHCA 2小时再灌注60分钟，致密颗粒呈簇状聚积于线粒体，粗面内质网与高尔基复合体中，细胞器破坏明显，见图3。特
, 百拇医药
别是术后8小时，线粒体空泡变性呈“气球样”变化，内有簇状钙沉着，部分线粒体膜模糊不
清、结构消失，见图4。而脑保护组经用FDP后细胞损伤明显减轻，保护组DHCA 2小时后再灌
60分钟，细胞形态基本完整，线粒体轻度肿胀，细胞内钙颗粒较少，见图5。保护组术后8小时
细胞内钙聚积虽有所增加，但细胞器破坏不明显，见图6。
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图1 正常组神经细胞内黑色圆形物为钙颗粒，分布较少，细胞器结构正常 ×6 000
图2 对照组DHCA2小时，线粒体肿胀，嵴断裂，胞质与线粒体内见较多高密度黑色钙颗粒，呈单个沉着 ×6 000
图3 对照组DHCA2小时再灌注分钟，致密钙颗粒呈簇状聚集于线粒体，粗面内质网与高尔基
体中，细胞器破坏明显 ×10 000
图4 对照组术后8小时，线粒体空泡变性呈“气球样”变化，内有簇状钙沉着，部分线粒体膜
模糊不清，结构消失 ×10 000
图5 保护组DHCA2小时再灌注60分钟，细胞形态基本完整，线粒体轻度肿胀，细胞内钙颗粒有
, 百拇医药
所减少 ×6 000
图6 保护组术后8小时，细胞内钙聚集虽有所增加，但细胞破坏不太明显 ×6 000
二、细胞内钙颗粒的定量分析结果
应用图象处理系统对细胞内钙颗粒的数密度、体密度、颗粒平均面积及最大径和最小径
进行测量，测量结果见附表,图7。统计结果表明，对照组中DHCA结束，再灌60分钟与术后
8小时细胞内钙颗粒的数密度、体密度与正常组比较有高度显著性差异(P<0.01)，而保护组
中再灌60分钟和术后8小时组与对照组相比也有高度显著性差异(P<0.01)。说明脑保护液能
有效地阻止DHCA 2小时后细胞内Ca2+聚积并维持了细胞结构的基本正常。
, http://www.100md.com
讨 论
Ca2+具有极高的生物活性，细胞内游离Ca2+是细胞间信息传递的中心环节，其浓度改变
是细胞生理功能及病理变化的重要物质基础。神经细胞的许多生理活动，如神经递质释放、膜内外信息传递，酶活性的调节等均有赖于Ca2+的参与。在脑缺血研究中，细胞内Ca2+浓度
变化正是这一领域研究的热点〔7〕。在正常生理状态下细胞外Ca2+浓度远远高于细胞内的浓
度。当脑组织缺血缺氧时，钠泵功能低下，大量钠离子进入细胞内引起细胞膜去极化，促使
Ca2+的电压依赖性通道开放，导致大量细胞外Ca2+内流，引起细胞内一些酶活性破坏而导致
, http://www.100md.com
细胞死亡。低温对减少全身，尤其是大脑的耗氧量是十分明显的，其脑保护作用长期以来亦
为人们所认识。然而依靠不断降低温度而延长脑缺血缺氧的时限则未必有效〔8〕。本实验结
果表明，尽管在18℃的低温下，DHCA 2小时后脑组织超微结构仍受到严重破坏。图象分析结
果证实：Ca2+细胞内聚积是造成脑损伤的重要原因。我们应用Ca2+细胞化学技术，能使细胞
内Ca2+原位沉淀，并在电镜下可见。焦锑酸钾对Ca2+有非常高的亲和力，几乎与100%Ca2+反
应发生原位沉淀。采用这项技术能在透射电镜下对Ca2+的分布情况进行观察分析。本实验结
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果显示：正常组细胞内Ca2+颗粒较少，形态规则、分布均匀。而缺血缺氧时黑色Ca2+颗粒明
显增加、大小不等，有些呈丛状聚积于粗面内织网池与线粒体附近。本实验在DHCA 2小时结
束至复温8小时的脑组织样品中均观察到细胞内Ca2+的大量聚积，尤其以术后8小时更为明显。
这证实Ca2+在细胞内的不断聚积是造成术后脑损伤乃至继发性损伤的重要原因。这一研究结
果与国外学者的报道也是相符的〔9〕。
附表 各组细胞内钙颗粒形态学参数图象分析结果(
±s), http://www.100md.com
参 数
正常组
对 照 组
保 护 组
DHCA结果
再灌60分钟
术后8小时
再灌60分钟
术后8小时
体密度(VV)
0.43±0.08
1.47±0.52*
, 百拇医药
3.57±1.01*
4.16±0.87*
0.51±0.06**
0.60±0.12**
数密度(NV)
3.92±0.55
9.89±1.70*
22.98±2.76*
21.35±2.66*
, 百拇医药 4.93±0.39**
16.21±1.16**
平均面积(Am)
0.016±0.009
0.022±0.008
0.030±0.010
0.049±0.014
0.013±0.009
0.0021±0.0008
最大径(Dmax)
, 百拇医药
0.16±0.05
0.186±0.037
0.210±0.050
0.282±0.039
0.143±0.039
0.064±0.009
最小径(Dmin)
0.11±0.04
0.116±0.033
0.18±0.04
0.22±0.03
, http://www.100md.com
0.11±0.03
0.048±0.009
注 * 与正常组比较 P<0.01, ** 与对照组比较 P<0.01
图7 各组中钙颗粒体密度及数密度直方图
本研究在用细胞化学法成功地显示出Ca2+颗粒后，应用能谱仪对Ca2+进行了定量分析。
分析结果另文报道。虽然能谱仪可以直接对Ca2+浓度的变化进行定量分析，但由于钙的Kα
线(3.690 Kev)与锑的Lα线(3.604 Kev)太靠近，两峰重叠在一起，无法剥离，以致
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于给Ca2+的定量分析带来困难，影响Ca2+浓度的精确度。但在能谱仪证实透射电镜下所见
黑色致密颗粒就是Ca2+的前提下，应用图象处理系统对Ca2+颗粒的数密度、体密度及颗粒
平均面积，最大径和最小径等参数进行定量分析，结果显示该方法较为准确地反映了DHCA
下神经细胞内Ca2+浓度的变化情况，是一种较为方便、准确的方法。
FDP是一种糖代谢的中间产物，近年来研究表明其具有改善能量代谢、降低Ca2+细胞内
聚积及减少兴奋性氨基酸释放与脂质过氧化反应、避免再灌注损伤的作用〔10〕。我们将其
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用于DHCA下的脑保护中，研究结果表明：FDP有效地阻止了DHCA 2小时后细胞内Ca2+聚积，并维持了细胞结构的基本正常，是DHCA下药理性脑保护的可行方法。
(本文图1～6见插页第2页)
参 考 文 献
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