DAB法显示脊髓微血管的实验研究
作者：张锡流 陈锋 何燕玲 叶星江
单位：张锡流 何燕玲 叶星江(广西中医学院第一附属医院病理科 南宁市园湖路2号 530023)；陈锋(上海中医药大学博士生 200032)
关键词：脊髓；DAB染色法；微血管染色
广西中医学院学报990445
摘 要 该文运用DAB染色法显示大白兔脊髓微血管形态，发现用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定的标本血管显色好，并在4℃下经过7～10天后仍能正常显色，标本直接冰冻切片显色效果差；切片后直接贴在载玻片上进行滴染显色不易产生皱折，节省染色剂。本实验操作简单易行，可用于脊髓组织微血管形态学研究
中图分类号 R361.2
Experimental Research of Micrangium in Spinal Cords Shown
, http://www.100md.com
by DAB Method
Zhang Xiliu Chen Feng He Yanling Ye Xingjiang
(The 1st Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530023)
Abstract DAB straining method was used to show the appearance of micrangium.We found that good straining result was obtained when the tissue specimens were fixed in 10% formol-phosphate buffer for 6～12hs,even they were placed at the temperature of 4℃ for 7～10 days.When the specimen frozen sections were done directly,we got bad staining result.The sections were stuck on the slides directly then DAB was used. The experiment is easy to operate.It can be used in the research on microvascular morphology of the tissues of the spinal cord.When staining they could not be presented folding easily
, 百拇医药
Key words spinal cord DAB staining of micrangium
近年来，利用DAB染色法显示微血管及判断血液循环的方法已用于脊髓损伤后不同时期血液循环变化规律及血管形态、分布、行走等实验研究，我们在应用此法研究兔颈脊髓慢性受压微血管形态学变化的实验过程中总结出比传统DAB显示法[1]更加简便、易行的操作方法，现介绍如下：
1 材料和方法
1.1 选用新西兰大白兔14只，体重2.5kg左右，雌雄不分，随机分成实验组和对照组，每组7只，实验组经C4、5椎体前置入螺钉造成颈脊髓慢性受压，对照组假手术处理。动物处死后取出C4、5脊髓段切成1.2cm×0.6cm×0.5cm组织块，分别作以下三种方法处理：①用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定8～12小时。(固定液配法：称取Na2HPO4.12H2O 29g加双蒸馏水405ml溶解配成A液；称NaH2PO4.2H2O 2.6g加双蒸馏水95ml溶解配成B液，A液+B液后再加500ml双馏水即成1000ml 0.1M磷酸盐缓冲液。在A液+B液中量出100ml去除，加浓甲醛100ml即配成10%甲醛磷酸盐缓冲固定液)。②用10%甲醛磷酸盐缓冲液置冰箱4℃固定7～10天。③新鲜组织直接恒冷切片。
, 百拇医药
1.2 用英国产AS620恒冷切片机将以上三种标本分别切成10μm、20μm、30μm及50μm数张(标本冷冻台温度为-50℃，切片操作室温度为-20℃，直接贴片于涂有防脱白胶的载玻片上，用PBS液洗三次，每次5分钟)。
1.3 用联苯胺液即DAB液(配法：购买武汉博士德生物工程有限公司生产的DAB显色试剂盒A、B、C三种显色剂，按试剂盒说明书要求在1ml蒸馏水中加显色剂A、B、C各1滴混匀，即可使用)滴在切片上显示血管，常温下25℃显色15分钟，光镜下控制到血管不再显色时用自来水终止显色。
1.4 PBS液洗3×5分钟，蒸馏水洗2～3次。
1.5 用Harris苏木素溶液复染1分钟(配法：甲液：苏木精1g，无水酒精10ml；乙液：硫酸铝钾20g，蒸馏水20ml，甲、乙两液分别溶解后混合，加热煮沸，煮沸后徐徐加入氧化汞0.5g，此时有大量气泡生成，故容器宜大，以防液体溢出，然后使染液迅速冷却，过滤后可用，使用时每100ml加冰醋酸4ml)。
, 百拇医药
1.6 常规脱水、二甲苯透明、封片观察。
2 结果
2.1 用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定8～12小时与固定7～10天后脊髓微血管显色时间10分钟，显色效果基本相同(见图1-正常对照及图2-脊髓受压后血管数量减少及不连续性)。
图1
图2
2.2 新鲜组织不经任何固定直接冰冻切片后进行染色时，DAB显色10分钟到40分钟均未见血管显色，并观察到有许多气泡，1小时后有少许血管显示，以后2小时也未见显色量增加。
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3 讨论
血液中存在着大量的由红细胞产生并释放入血浆中的内源性过氧化物酶，它能与过氧化氢反应，形成初级复合物，过氧化物酶催化过氧化氢形成的中间产物迅速生成水，酶被还原同时产生新生态氧使无色联苯胺氧化、聚合、环化，最后形成吲哚胺多聚体沉淀于血管腔内，将血管显示出来。在上述反应中，过氧化氢是特异的，而作为电子供体的DAB是非特异的，所以可在底物中加入不同的电子供体，将血管显示成不同的颜色，而且组织器官内血液量多，酶丰富，反应产物就多、颜色深，所以根据血管数量及颜色深浅可以在组织学水平定量判定组织器官活体时血液循环[2，3]。
利用DAB法显示脊髓微血管及判断血液循环准确与否，关键在于取材固定处理及恒冷切片温度是否适当，能否最大限度保存酶的活性，同时也不能忽视染色过程中一些细微环节，我们在实验过程中总结出一些与传统的DAB显示微血管方法不完全一致的地方，并有以下体会：
, http://www.100md.com 3.1 固定：①现代免疫组化实验观点是提倡新鲜组织直接恒冷切片后染色，这样可以减少组织酶的破坏，提高组织显色效果，但本实验研究发现，不经固定的新鲜脊髓组织切片后用DAB显示微血管的效果极差(重复实验三次结果相近)。这是因为免疫组化显色原理与DAB显示血管原理不完全一致，作者认为不经固定的脊髓标本血液不凝固、在冰冻切片后的染色过程中由于组织切片的解冻而致血液流动、红细胞外溢、酶扩散造成显色准确度不高。因此，我们认为还是用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定为佳。②我们也发现：用10%甲醛磷酸盐缓冲液在4℃冰箱中固定标本8～12小时与固定7～10天才做恒冷切片的脊髓微血管显色效果基本一致。说明过氧化物酶是一种比较稳定的酶，在低温条件下，经过较长时间固定仍损失不多。因此，固定时间不拘泥于8～12小时，对于取材后未能及时制片染色的实验者来说，这种固定方法值得采纳。
3.2 切片：①冷冻台温度-50℃，切片室温度-20℃切片厚度为50μm显色效果最佳，切片厚度小于10μm显色效果很差，因为切片过薄血管显示较短，不连续、不能观察血管走向、分布等。②用恒冷切片后直接贴在载玻片进行滴染显色方法，克服传统方法所带来的组织片容易皱折和显色剂耗量多的缺点，在操作过程中应注意使玻片与组织片紧贴，防止气泡形成影响观察。
, 百拇医药
3.3 复染：用苏木素溶液浅染、紫兰色背景与棕色微血管显色对比度强，颜色鲜艳、清晰。
本实验结果提示运用DAB染色法显示大白兔脊髓微血管形态的方法是可行的，能显示正常脊髓及受压脊髓血管形态改变，为研究中枢神经系统血液循环提供好方法。
参考文献
[1] 熊正文.一种微血管显示方法及其应用.中华病理学杂志.1992，21：313
[2] 杨景山.医用细胞化学与细胞生物化学.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990.38～40
[3] HSU, SM,et al. Color modification of diaminobenzidine (DAB) Percipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. J Histochem Cytochem. 1982，30:107
收稿日期：1999-11-01, http://www.100md.com
单位：张锡流 何燕玲 叶星江(广西中医学院第一附属医院病理科 南宁市园湖路2号 530023)；陈锋(上海中医药大学博士生 200032)
关键词：脊髓；DAB染色法；微血管染色
广西中医学院学报990445
摘 要 该文运用DAB染色法显示大白兔脊髓微血管形态，发现用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定的标本血管显色好，并在4℃下经过7～10天后仍能正常显色，标本直接冰冻切片显色效果差；切片后直接贴在载玻片上进行滴染显色不易产生皱折，节省染色剂。本实验操作简单易行，可用于脊髓组织微血管形态学研究
中图分类号 R361.2
Experimental Research of Micrangium in Spinal Cords Shown
, http://www.100md.com
by DAB Method
Zhang Xiliu Chen Feng He Yanling Ye Xingjiang
(The 1st Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530023)
Abstract DAB straining method was used to show the appearance of micrangium.We found that good straining result was obtained when the tissue specimens were fixed in 10% formol-phosphate buffer for 6～12hs,even they were placed at the temperature of 4℃ for 7～10 days.When the specimen frozen sections were done directly,we got bad staining result.The sections were stuck on the slides directly then DAB was used. The experiment is easy to operate.It can be used in the research on microvascular morphology of the tissues of the spinal cord.When staining they could not be presented folding easily
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Key words spinal cord DAB staining of micrangium
近年来，利用DAB染色法显示微血管及判断血液循环的方法已用于脊髓损伤后不同时期血液循环变化规律及血管形态、分布、行走等实验研究，我们在应用此法研究兔颈脊髓慢性受压微血管形态学变化的实验过程中总结出比传统DAB显示法[1]更加简便、易行的操作方法，现介绍如下：
1 材料和方法
1.1 选用新西兰大白兔14只，体重2.5kg左右，雌雄不分，随机分成实验组和对照组，每组7只，实验组经C4、5椎体前置入螺钉造成颈脊髓慢性受压，对照组假手术处理。动物处死后取出C4、5脊髓段切成1.2cm×0.6cm×0.5cm组织块，分别作以下三种方法处理：①用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定8～12小时。(固定液配法：称取Na2HPO4.12H2O 29g加双蒸馏水405ml溶解配成A液；称NaH2PO4.2H2O 2.6g加双蒸馏水95ml溶解配成B液，A液+B液后再加500ml双馏水即成1000ml 0.1M磷酸盐缓冲液。在A液+B液中量出100ml去除，加浓甲醛100ml即配成10%甲醛磷酸盐缓冲固定液)。②用10%甲醛磷酸盐缓冲液置冰箱4℃固定7～10天。③新鲜组织直接恒冷切片。
, 百拇医药
1.2 用英国产AS620恒冷切片机将以上三种标本分别切成10μm、20μm、30μm及50μm数张(标本冷冻台温度为-50℃，切片操作室温度为-20℃，直接贴片于涂有防脱白胶的载玻片上，用PBS液洗三次，每次5分钟)。
1.3 用联苯胺液即DAB液(配法：购买武汉博士德生物工程有限公司生产的DAB显色试剂盒A、B、C三种显色剂，按试剂盒说明书要求在1ml蒸馏水中加显色剂A、B、C各1滴混匀，即可使用)滴在切片上显示血管，常温下25℃显色15分钟，光镜下控制到血管不再显色时用自来水终止显色。
1.4 PBS液洗3×5分钟，蒸馏水洗2～3次。
1.5 用Harris苏木素溶液复染1分钟(配法：甲液：苏木精1g，无水酒精10ml；乙液：硫酸铝钾20g，蒸馏水20ml，甲、乙两液分别溶解后混合，加热煮沸，煮沸后徐徐加入氧化汞0.5g，此时有大量气泡生成，故容器宜大，以防液体溢出，然后使染液迅速冷却，过滤后可用，使用时每100ml加冰醋酸4ml)。
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1.6 常规脱水、二甲苯透明、封片观察。
2 结果
2.1 用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定8～12小时与固定7～10天后脊髓微血管显色时间10分钟，显色效果基本相同(见图1-正常对照及图2-脊髓受压后血管数量减少及不连续性)。
图1
图2
2.2 新鲜组织不经任何固定直接冰冻切片后进行染色时，DAB显色10分钟到40分钟均未见血管显色，并观察到有许多气泡，1小时后有少许血管显示，以后2小时也未见显色量增加。
, http://www.100md.com
3 讨论
血液中存在着大量的由红细胞产生并释放入血浆中的内源性过氧化物酶，它能与过氧化氢反应，形成初级复合物，过氧化物酶催化过氧化氢形成的中间产物迅速生成水，酶被还原同时产生新生态氧使无色联苯胺氧化、聚合、环化，最后形成吲哚胺多聚体沉淀于血管腔内，将血管显示出来。在上述反应中，过氧化氢是特异的，而作为电子供体的DAB是非特异的，所以可在底物中加入不同的电子供体，将血管显示成不同的颜色，而且组织器官内血液量多，酶丰富，反应产物就多、颜色深，所以根据血管数量及颜色深浅可以在组织学水平定量判定组织器官活体时血液循环[2，3]。
利用DAB法显示脊髓微血管及判断血液循环准确与否，关键在于取材固定处理及恒冷切片温度是否适当，能否最大限度保存酶的活性，同时也不能忽视染色过程中一些细微环节，我们在实验过程中总结出一些与传统的DAB显示微血管方法不完全一致的地方，并有以下体会：
, http://www.100md.com 3.1 固定：①现代免疫组化实验观点是提倡新鲜组织直接恒冷切片后染色，这样可以减少组织酶的破坏，提高组织显色效果，但本实验研究发现，不经固定的新鲜脊髓组织切片后用DAB显示微血管的效果极差(重复实验三次结果相近)。这是因为免疫组化显色原理与DAB显示血管原理不完全一致，作者认为不经固定的脊髓标本血液不凝固、在冰冻切片后的染色过程中由于组织切片的解冻而致血液流动、红细胞外溢、酶扩散造成显色准确度不高。因此，我们认为还是用10%甲醛磷酸盐缓冲液固定为佳。②我们也发现：用10%甲醛磷酸盐缓冲液在4℃冰箱中固定标本8～12小时与固定7～10天才做恒冷切片的脊髓微血管显色效果基本一致。说明过氧化物酶是一种比较稳定的酶，在低温条件下，经过较长时间固定仍损失不多。因此，固定时间不拘泥于8～12小时，对于取材后未能及时制片染色的实验者来说，这种固定方法值得采纳。
3.2 切片：①冷冻台温度-50℃，切片室温度-20℃切片厚度为50μm显色效果最佳，切片厚度小于10μm显色效果很差，因为切片过薄血管显示较短，不连续、不能观察血管走向、分布等。②用恒冷切片后直接贴在载玻片进行滴染显色方法，克服传统方法所带来的组织片容易皱折和显色剂耗量多的缺点，在操作过程中应注意使玻片与组织片紧贴，防止气泡形成影响观察。
, 百拇医药
3.3 复染：用苏木素溶液浅染、紫兰色背景与棕色微血管显色对比度强，颜色鲜艳、清晰。
本实验结果提示运用DAB染色法显示大白兔脊髓微血管形态的方法是可行的，能显示正常脊髓及受压脊髓血管形态改变，为研究中枢神经系统血液循环提供好方法。
参考文献
[1] 熊正文.一种微血管显示方法及其应用.中华病理学杂志.1992，21：313
[2] 杨景山.医用细胞化学与细胞生物化学.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990.38～40
[3] HSU, SM,et al. Color modification of diaminobenzidine (DAB) Percipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. J Histochem Cytochem. 1982，30:107
收稿日期：1999-11-01, http://www.100md.com