高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量
作者：张兰珍 王晓强 贾 辉 马继忠
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：叶下珠；没食子酸；HPLC
北京中医药大学学报000618
摘要：以高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量。采用YWG-C18(1 0 μm)色谱柱， 甲醇—水—磷酸(4∶96∶0.05)为流动相，测得叶下珠中没食子酸的含量为0.114%，平 均回收率为103.1%。测定方法快速、灵敏，具有实用价值。
中图分类号：R284.1
Determination of Gallic Acid in Phyllanthus Urinaria by HPLC
, http://www.100md.com
Zhang Lanzhen (张兰珍), Wang Xiaoqiang (王晓强), Jia Hui (贾 辉), et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
A practical sensitive and fast HPLC method for the determination of ga llic acid in Phyllanthus urinaria L. was developed. To perform this method, the YWG-C18 (10 μm) column and a mobile phase composed of methanol, water an d phosp horic acid (MeOH∶H2O∶H3PO4=4∶96∶0.05) were used. The results of the de termination by this method showed that the mean content of the gallic acid in Ph yllanthus urinaria L. was 0.114%, and the average recovery was 103.1%.
, 百拇医药
KEY WORDS: Phyllanthus Urinaria; Gallic Acid; HPLC
叶下珠为大戟科叶下珠属植物叶下珠Phyllanthus urinaria L.的干燥全草。具有平肝 清热，利水解毒的功效。现代药理实验证明叶下珠具有抗 乙肝病毒(HBV) 、保肝等作用[1]。 目前从叶下珠中分离得到的化合物有正十八烷、β-谷甾醇、胡萝卜甙、没食子酸、鞣 花酸、短叶苏木酚酸甲酯、山奈素、槲皮素、去氢柯子次酸三甲酯、芸香甙、羽扇豆醇、蔗 糖、鞣云实精、老鹳草素等[2～5]，其中多酚和可水解鞣质为叶下珠主要活性成分 ,没食子酸的含量最高。没食子酸是可水解鞣质的单体，具有抗病毒的作用，叶下珠中没食子酸的含量测定方法目前 还没有报道。我们用HPLC法测定没食子酸的含量，优选出比较好的提取方法和分离条件，方 法简便、快速、准确，具有实用性。
1 材料与仪器
, http://www.100md.com
HPLC仪为美国BECKMAN 332 型液相色谱仪，进样阀100 μL； 色谱柱YWG-C18由北京 分析 仪器技术公司生产。叶下珠药材1999年采自陕西商洛地区, 由陕西中医研究所郭五保研究员 鉴定； 试剂皆为分析纯； 没食子酸标准品购自中国生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱YWG-C18(10 μm,4×250 mm),流动相：甲醇—水—磷酸(4∶96∶0.05)；流 速1 mL /min；检测波长280 nm；柱温：室温；在上述色谱条件下叶下珠中没食子酸与其他干扰峰分 离良好 ,柱效以没食子酸的理论塔板计不得低于554，见图1。
图1 叶下珠中没食子酸的HPLC图
, 百拇医药
2.2 标准曲线的制备
精称没食子酸标准品2.0 mg，用30%甲醇定容至5 mL容量瓶中，所得标准品溶液浓度为 (0.4 mg/mL)。精密吸取标准溶液50、100、150、200、250 μL用30%甲醇溶液定容至5 m L容量瓶中，分别吸取100 μL进样，测定色谱峰面积。以色谱峰面积A为纵坐标，没食子酸 对照品的 量为横坐标,求得回归方程为Y=388775X+1589.4(γ=0.9997),线性范围0.4～2.0 μg ，可用外标一点法计算含量。
2.3 精密度的测定
精密吸取对照品溶液(0.4 mg/mL)100 μL，重复进样5次， 测得色谱峰面积A平均值为461 293, RSD=2.78%。
2.4 稳定性实验
精密吸取对照品溶液100 μL每隔0.5 h进样测定1次，连续实验6 h，RSD=3.0%，没食子酸 在6 h内很稳定。
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2.5 提取方法的选择
精称叶下珠细粉(40目)0.2 g，按文献[7]分别加入30%甲醇25 mL,称重,超声提取 20、30、40 min,冷浸12、24、48 h,补足原重量，过滤，取续滤液，微孔滤膜过滤后，按色 谱条件测定样品含量，实验表明冷浸法较超声波提取法没食子酸的提取率高，24 h可基本稳 定，故样品采用冷浸24 h提取。
2.6 回收率实验
精密称取叶下珠药材粉末4份各0.1 g，精密加入没食子酸对照品0.33 mg(配制成标准溶液) ，精密 吸取30%甲醇25 mL，称重,冷浸24 h，补足原重量，过滤，取续滤液，微孔滤膜过滤后，按 色谱条件测定，求得4份平均回收率为103.1%，RSD=1.2%。
2.7 样品测定结果
精称样品4份各0.2 g，按回收率法制备样品，精密吸取样品供试液60 μL，按上述色谱条 件测定，外标一点法计算含量。结果见表1。
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2.8 重现性实验
精称样品5份各0.2 g，按样品测定法制备样品，精密吸取样品供试液60 μL，测定含 量，求得5份的RSD=2.32%。
表1 叶下珠中没食子酸的含量 份数
称样量/g
含量/%
平均含量/%
RSD/%
1
0.2003
0.113
2
, http://www.100md.com
0.2000
0.115
0.114
1.01
3
0.2002
0.113
4
0.2001
0.115
3 讨论
没食子酸为可水解鞣质的结构单元，所测含量为样品所含游离没食子酸和水解出的没食 子酸的含量总和,但不包含在放置条件下不易水解的可水解鞣质中的没食子酸。没食子酸的含量随提取条件不同差异较大,超声波提取法时间短,提取的主要为游离没食 子酸，含量较低。加热提取会使叶下珠中所含的大量可水解鞣质水解破坏，所以本实验没有 采用加热提取的方法。
, 百拇医药
张兰珍，女，36岁，医学硕士，副教授
参 考 文 献
1，窦志华.叶下珠属植物抗乙肝病毒的国内研究概况.中成药，1998，20(3)：46
2，姚庆强，左春旭.叶下珠化学成分的研究.药学学报，1993，28(11)：829
3，李瑞声，王三永，张维汉，等.叶下珠化学成分的研究.中草药，1995，26(5)：231
4，万振先，周国平，易扬华. 叶下珠化学成分的研究.中草药，1994，25(9)：455
5，万振先，喻庆禄，易扬华.叶下珠化学成分的研究Ⅱ.中草药，1997，28(3)：134
6，段天璇，王静竹，冯 鹏.山茱萸炮制前后没食子酸溶出及煎出量比较.中国中药杂志，1 999，24(4)：213
(收稿日期：2000-06-29), http://www.100md.com
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：叶下珠；没食子酸；HPLC
北京中医药大学学报000618
摘要：以高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量。采用YWG-C18(1 0 μm)色谱柱， 甲醇—水—磷酸(4∶96∶0.05)为流动相，测得叶下珠中没食子酸的含量为0.114%，平 均回收率为103.1%。测定方法快速、灵敏，具有实用价值。
中图分类号：R284.1
Determination of Gallic Acid in Phyllanthus Urinaria by HPLC
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Zhang Lanzhen (张兰珍), Wang Xiaoqiang (王晓强), Jia Hui (贾 辉), et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
A practical sensitive and fast HPLC method for the determination of ga llic acid in Phyllanthus urinaria L. was developed. To perform this method, the YWG-C18 (10 μm) column and a mobile phase composed of methanol, water an d phosp horic acid (MeOH∶H2O∶H3PO4=4∶96∶0.05) were used. The results of the de termination by this method showed that the mean content of the gallic acid in Ph yllanthus urinaria L. was 0.114%, and the average recovery was 103.1%.
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KEY WORDS: Phyllanthus Urinaria; Gallic Acid; HPLC
叶下珠为大戟科叶下珠属植物叶下珠Phyllanthus urinaria L.的干燥全草。具有平肝 清热，利水解毒的功效。现代药理实验证明叶下珠具有抗 乙肝病毒(HBV) 、保肝等作用[1]。 目前从叶下珠中分离得到的化合物有正十八烷、β-谷甾醇、胡萝卜甙、没食子酸、鞣 花酸、短叶苏木酚酸甲酯、山奈素、槲皮素、去氢柯子次酸三甲酯、芸香甙、羽扇豆醇、蔗 糖、鞣云实精、老鹳草素等[2～5]，其中多酚和可水解鞣质为叶下珠主要活性成分 ,没食子酸的含量最高。没食子酸是可水解鞣质的单体，具有抗病毒的作用，叶下珠中没食子酸的含量测定方法目前 还没有报道。我们用HPLC法测定没食子酸的含量，优选出比较好的提取方法和分离条件，方 法简便、快速、准确，具有实用性。
1 材料与仪器
, http://www.100md.com
HPLC仪为美国BECKMAN 332 型液相色谱仪，进样阀100 μL； 色谱柱YWG-C18由北京 分析 仪器技术公司生产。叶下珠药材1999年采自陕西商洛地区, 由陕西中医研究所郭五保研究员 鉴定； 试剂皆为分析纯； 没食子酸标准品购自中国生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱YWG-C18(10 μm,4×250 mm),流动相：甲醇—水—磷酸(4∶96∶0.05)；流 速1 mL /min；检测波长280 nm；柱温：室温；在上述色谱条件下叶下珠中没食子酸与其他干扰峰分 离良好 ,柱效以没食子酸的理论塔板计不得低于554，见图1。
图1 叶下珠中没食子酸的HPLC图
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2.2 标准曲线的制备
精称没食子酸标准品2.0 mg，用30%甲醇定容至5 mL容量瓶中，所得标准品溶液浓度为 (0.4 mg/mL)。精密吸取标准溶液50、100、150、200、250 μL用30%甲醇溶液定容至5 m L容量瓶中，分别吸取100 μL进样，测定色谱峰面积。以色谱峰面积A为纵坐标，没食子酸 对照品的 量为横坐标,求得回归方程为Y=388775X+1589.4(γ=0.9997),线性范围0.4～2.0 μg ，可用外标一点法计算含量。
2.3 精密度的测定
精密吸取对照品溶液(0.4 mg/mL)100 μL，重复进样5次， 测得色谱峰面积A平均值为461 293, RSD=2.78%。
2.4 稳定性实验
精密吸取对照品溶液100 μL每隔0.5 h进样测定1次，连续实验6 h，RSD=3.0%，没食子酸 在6 h内很稳定。
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2.5 提取方法的选择
精称叶下珠细粉(40目)0.2 g，按文献[7]分别加入30%甲醇25 mL,称重,超声提取 20、30、40 min,冷浸12、24、48 h,补足原重量，过滤，取续滤液，微孔滤膜过滤后，按色 谱条件测定样品含量，实验表明冷浸法较超声波提取法没食子酸的提取率高，24 h可基本稳 定，故样品采用冷浸24 h提取。
2.6 回收率实验
精密称取叶下珠药材粉末4份各0.1 g，精密加入没食子酸对照品0.33 mg(配制成标准溶液) ，精密 吸取30%甲醇25 mL，称重,冷浸24 h，补足原重量，过滤，取续滤液，微孔滤膜过滤后，按 色谱条件测定，求得4份平均回收率为103.1%，RSD=1.2%。
2.7 样品测定结果
精称样品4份各0.2 g，按回收率法制备样品，精密吸取样品供试液60 μL，按上述色谱条 件测定，外标一点法计算含量。结果见表1。
, http://www.100md.com
2.8 重现性实验
精称样品5份各0.2 g，按样品测定法制备样品，精密吸取样品供试液60 μL，测定含 量，求得5份的RSD=2.32%。
表1 叶下珠中没食子酸的含量 份数
称样量/g
含量/%
平均含量/%
RSD/%
1
0.2003
0.113
2
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0.2000
0.115
0.114
1.01
3
0.2002
0.113
4
0.2001
0.115
3 讨论
没食子酸为可水解鞣质的结构单元，所测含量为样品所含游离没食子酸和水解出的没食 子酸的含量总和,但不包含在放置条件下不易水解的可水解鞣质中的没食子酸。没食子酸的含量随提取条件不同差异较大,超声波提取法时间短,提取的主要为游离没食 子酸，含量较低。加热提取会使叶下珠中所含的大量可水解鞣质水解破坏，所以本实验没有 采用加热提取的方法。
, 百拇医药
张兰珍，女，36岁，医学硕士，副教授
参 考 文 献
1，窦志华.叶下珠属植物抗乙肝病毒的国内研究概况.中成药，1998，20(3)：46
2，姚庆强，左春旭.叶下珠化学成分的研究.药学学报，1993，28(11)：829
3，李瑞声，王三永，张维汉，等.叶下珠化学成分的研究.中草药，1995，26(5)：231
4，万振先，周国平，易扬华. 叶下珠化学成分的研究.中草药，1994，25(9)：455
5，万振先，喻庆禄，易扬华.叶下珠化学成分的研究Ⅱ.中草药，1997，28(3)：134
6，段天璇，王静竹，冯 鹏.山茱萸炮制前后没食子酸溶出及煎出量比较.中国中药杂志，1 999，24(4)：213
(收稿日期：2000-06-29), http://www.100md.com