解毒通络方抗大鼠脑缺血再灌后脂质过氧化损伤的实验研究
作者：冀宏 李澎涛 黄启福
单位：北京中医药大学病理教研室 北京100029
关键词：解毒通络方；血管性痴呆；脂质过氧化
北京中医药大学学报000609
摘要：为了探讨解毒通络方防治大鼠脑缺血再灌后DND的机理，采用大鼠双侧颈总动 脉结扎合用腹腔注射硝 普钠为模型，实验分为正常、模型、解毒通络方、尼莫地平4组，用光化学方法检测造模后 脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。发现模型组较正常组大鼠脑组织SOD 降低 ，MDA升高，用解毒通络方、尼莫地平后可以明显提高SOD活性，降低MDA含量，前者较后者 效果更明显。说明解毒通络方与尼莫地平均具有抗脂质过氧化损伤的能力，解毒通络方的作 用更显著。
中图分类号：R285.5
, http://www.100md.com
Experimental Study of the Effects of Jiedutongluo Decoction
on the Lesions Caused by the Lipid Peroxidation after
Cerebral Ischemia Reperfusion in Rats
Ji Hong (冀 宏), Li Pengtao (李澎涛), Huang Qifu (黄启福)
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
This experiment is designed to study the preventive and treating e ffects of Jiedutongluo Decoction (JD) on delayed neuronal death caused by cerebr al ischemia reperfusion in the rats which underwent bilateral common carotid blo ckage and intraperitoneal injection of sodium nitroprusside. The rats in the exp eriment were divided into control group, model group, JD treating group and nimo dipine treating group. The cerebral SOD activity and MDA level were determined b y photochemical method. The results showed that compared to that in the rats in the control group, the SOD activity was lower and the MDA level was higher in th e rats in the model group; and both JD and nimodipine could increase the SOD act ivity and decrease the MDA level, but the effects of JD was stronger than those of nimodipine, which implies that the two drugs have anti-lipid-peroxidating eff ects, and JD is more effective than nimodipine.
, http://www.100md.com
KEY WORDS: Jiedutongluo Decoction; Vascular Dementia; Anti-Lipid-Peroxidat ion
研究已证实， 脑缺血再灌的病理生理是一个多环节、 多因素、 多途径损伤 级联反应。其中自由基参与脑缺血再灌注损伤的发生， 既是神经元损伤的致命生化因素， 又是损伤级联反 应的关键环节。脑缺血再灌注引起自由基的代谢紊乱，导致神经细胞损伤和功能障碍。清除 自由基可减少急性脑梗塞的缺血损伤、 改善神经功能。因此， 我们应用中医中药对脑缺血 再灌进行多靶点的干预， 通过动物实验观察了脑缺血再灌后脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)含量的变化， 探讨解毒通络方抗脑缺血再灌后脂质过氧化损伤的作用效果及 作用机制。
1 材料
1.1 动物
雄性Wistar大鼠12月龄，体重(300±10)g，由中国医学科学院动物中心提供。
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1.2 药品试剂与仪器
解毒通络方:由栀子、丹参、黄芪、天麻组成，北京中医药大学药学院中药 制剂室制备成口服液。硝普钠(北京制药工业研究所实验药厂)。MDA和SOD试剂盒(南京建成 生物工程研究所)。主要仪器：721型分光光度计(上海光学仪器厂)。
2 方法
2.1 脑缺血再灌模型
在环境温度为25～30 ℃下，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉。仰卧 固定于解剖板上，剪去颈前部术区的毛，消毒皮肤，颈部正中切口，分离出双侧颈总动脉( 注意勿损伤迷走神经)，将双股丝线从颈总动脉下穿过。牵拉时丝线中断颈总动脉血流，同 时迅速腹腔注射硝普钠0.25 mg/kg，10 min后松开丝线恢复颈总动脉供血，需10 min后 再次牵拉丝线阻断血流，持续10 min松开，撤去丝线，术区撒青霉素粉适量，逐层缝合切口 。
, 百拇医药
2.2 动物分组及处理
造模成功的大鼠,随机分4组：假手术组、模型组、解毒通络方组、尼莫地平组。假手 术组手术过程同模型组，但不结扎血管，术后每日灌胃自来水；解毒通络方组每日灌胃解毒 通络方5.3 mL/kg(含生药量1.88 g/mL)；尼莫地平组每日灌胃尼莫地平5 mg/kg。 解毒通络方组与尼莫地平组在动物造模前3 d每日1次，造模后第2天开始给药，每日1次 ，末次给药2～3 h后，动物杀检，取脑组织进行检测。
2.3 脑组织SOD、MDA含量的测定
①样品制备：取皮层脑组织，用预冷的生理盐水按重量(mg)体积(mL)比制备脑组织匀浆 。②按考马斯亮蓝法测定蛋白含量。③SOD测定：参照试剂盒说明书, 取1%的脑组织匀浆， 在550 nm波长下比色测定。 计算公式： SOD活力(U/mg)=[(对照管吸光度-测定管吸光度 )/对 照管吸光度]/50%×3.85/0.05/脑组织蛋白含量。④MDA测定：按试剂盒说明书， 取10 %脑组织匀浆在532 nm波长下比色测定其光密度(OD值)。MDA含量(U/mg)=(测定管吸 光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×10×样品稀释倍数/脑 组织蛋白含量。
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3 结果
结果见表1。
表1 解毒通络方对大鼠脑缺血再灌后脑组织SOD活力的影响 (U/mg;
±s) 组别
n
1 d
3 d
7 d
15 d
SOD
MDA
SOD
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MDA
SOD
MDA
SOD
MDA
假手术组
10
7.44±1.17
4.14±0.44
7.44±1.17
4.14±0.44
7.44±1.17
4.14±0.44
, http://www.100md.com
7.44± 1.17
4.14±0.44
模型组
8
4.59±0.49
6.84±0.95
2.26±0.71
7.17±0.85
4.26±1.2 8
7.79±1.18
6.77±0.42
4.66±0.71
, 百拇医药
解毒通络方组
8
5.43±0.57
5.10±0.84*
4.53±0.86**
5.80± 0.96[ 〗6.17±0.84*
5.18±1.04**
7.16±0.62
3.20±1.22**
尼莫地平组
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8
5.05±0.50*
5.42±0.42
4.33±0.19*
5.35±1.14*
5.22±1.17
4.91±0.84**
6.93±0.30
4.51±1.04
注：与同期模型组比较*P<0.05 **P<0.01 本实验通过动态观察脑内脂质过氧化产物MDA含量和自由基清除剂SOD活性的变化，发现模型 组脑缺血再灌注后1 d MDA含量开始增加，3 d MDA含量显著增加，7 d脑组织MDA持续高于假 手术组，15 d MDA含量有所下降但仍高于假手术组。解毒通络方组与尼莫地平组脑组织MDA 含 量在各时间点(1、3、7、15 d)升高程度较模型组减轻，均具有统计学意义(P<0.01或 P<0.05)。模型组脑组织SOD活性在各时间点(1、3、7、15 d)均低于假手术组，以7 d 最严重，15 d时也仍低于假手术组。解毒通络方组与尼莫地平组SOD活性均高于模型组(P<0.01，P<0.05)。
, 百拇医药
4 讨论
在通常情况下，机体自由基的生成与清除能力保持着动态平衡。脑缺血再灌可触发脑组织中 自由基的大量产生。自由基具有异常活泼的反应性，它可以与生物大分子、尤其是生物膜上 的不饱和脂肪酸反应，形成脂质过氧化物，破坏生物膜系统。而且，自由基一旦产生，便启 动自我催化的链式反应，使得在其自身不被消耗的情况下，脂质过氧化物不断积累，导致膜 结构受损、功能障碍，其程度逐步加重。同时，自由基介导的膜损害可以涉及膜受体。M- 受体、肾上腺素能受体、组织胺能受体、5羟色胺能受体、生长激素受体均含有巯基，巯基 参与受体与G蛋白的偶联，巯基的烷化阻断了这种偶联，改变了受体的功能和结合特性，干 扰了递质的释放和摄取，在不同环节上影响了缺血后神经元损伤和修复的过程[1～3] 。MDA是 脂质过氧化物的分解产物，为一种重要的生物大分子交联剂，它能交联蛋白质与核酸，使DN A发生突变，影响信息传递、转录和复制，从而导致蛋白质合成能力下降或合成蛋白质功能 紊乱。同时使自由基清除剂的关键酶——超氧化物歧化酶(SOD)生成减少、活性降低。
, 百拇医药
本实验结果说明了脑缺血再灌注后脑内自由基大量产生以及抗脂质过氧化功能的降低、自由 基清除能力下降参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制，是导致该模型动物神经细胞发生迟发 性神经元死亡的一个重要原因。解毒通络方与尼莫地平均可以降低脑组织中MDA含量，提高S OD活性。尼莫地平是钙通道阻滞剂，能扩张脑血管，增加脑缺血再灌后的脑血流量，从而清 除组织中过多的MDA，使SOD活性提高；而且，尼莫地平可以直接作用于神经细胞，降低脑缺 血区神经细胞内游离钙离子浓度，减轻缺血性脑损伤。解毒通络方是否与尼莫地平有类似的 作用可以降低神经细胞内钙离子浓度，扩张脑血管，增加脑血流量，有待今后进一步研究。
氧自由基在脑缺血再灌后迟发性神经元死亡中的作用与中医学“毒损脑络”的机制有其相似 之处。中医认为中风后产生瘀毒、热毒、痰毒互结，毒邪可败坏形体，损失脑络，使脑神失 用。因此，在治疗与用药方面以解毒为大法，及时清除与抑制这些有毒物质的产生，可有效 提高中风治愈率[4]。我们根据中风病本虚(脏腑虚损)、标实(瘀、痰、毒)病 理特点 ，以清热解毒、养血活血通络为治法，组成栀子、丹参、黄芪、天麻的解毒通络方。方中栀 子善入血分解血络壅塞之热毒；丹参活血化瘀、解毒和络，辅助栀子以祛血络热毒之邪；黄 芪既益气升阳，又具有托毒生肌、利水消肿、活血化瘀等作用。天麻熄风柔络， 其主 要成分天麻素可以对抗小鼠脑缺血再灌后脑内脂质过氧化损伤、抑制兴奋性氨基酸的升高 [5]。四药合用使毒祛络通，气血充润，脑神得养，神机可复。根据以往的实验结果 可知， 本方可以明显改善脑缺血再灌后损伤了的海马结构。本实验进一步证明解毒通络方不仅可以 降低自由基，而且可以提高机体抗氧化能力，从而，在缺血再灌早期阻断了脑缺血再灌后神 经系统的损伤级联反应，保护神经元。
, 百拇医药
国家自然科学基金课题(No.39970937)
冀宏，女，36岁，医学博士，主治医师
参 考 文 献
1，陈光辉，饶明俐.脑缺血再灌流与生物膜损伤. 国外医学。脑血管疾病分册， 1 996，4(4)：209～211
2，Patel M, Day Bj, Crapo JD, et al. Requirement for superoxide in excitotoxic c ell death. Neuron， 1996，16:345～355
3，Chan PH, Epstein CJ, Kinouchi H, et al. Role of superoxide dismut ase in ischemic brain injury: reduction of edema and infarction in transgenic mi ce following focal cerebral ischemia. Prog Brain Res，1993，96:97～104
4，王永炎. 关于提高脑血管疾病疗效难点的思考.中国中西医结合杂志，1997，17(2)：1 95～196
5，唐一鹏，赵树民，孙丽萍，等.抗呆合剂对小鼠脑缺血再灌注脑内氨基酸、乙酰胆碱酯酶 活力的影响.北京中医药大学学报， 1999，22(4)：16～18
(收稿日期：2000-05-28), 百拇医药
单位：北京中医药大学病理教研室 北京100029
关键词：解毒通络方；血管性痴呆；脂质过氧化
北京中医药大学学报000609
摘要：为了探讨解毒通络方防治大鼠脑缺血再灌后DND的机理，采用大鼠双侧颈总动 脉结扎合用腹腔注射硝 普钠为模型，实验分为正常、模型、解毒通络方、尼莫地平4组，用光化学方法检测造模后 脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。发现模型组较正常组大鼠脑组织SOD 降低 ，MDA升高，用解毒通络方、尼莫地平后可以明显提高SOD活性，降低MDA含量，前者较后者 效果更明显。说明解毒通络方与尼莫地平均具有抗脂质过氧化损伤的能力，解毒通络方的作 用更显著。
中图分类号：R285.5
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Experimental Study of the Effects of Jiedutongluo Decoction
on the Lesions Caused by the Lipid Peroxidation after
Cerebral Ischemia Reperfusion in Rats
Ji Hong (冀 宏), Li Pengtao (李澎涛), Huang Qifu (黄启福)
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
This experiment is designed to study the preventive and treating e ffects of Jiedutongluo Decoction (JD) on delayed neuronal death caused by cerebr al ischemia reperfusion in the rats which underwent bilateral common carotid blo ckage and intraperitoneal injection of sodium nitroprusside. The rats in the exp eriment were divided into control group, model group, JD treating group and nimo dipine treating group. The cerebral SOD activity and MDA level were determined b y photochemical method. The results showed that compared to that in the rats in the control group, the SOD activity was lower and the MDA level was higher in th e rats in the model group; and both JD and nimodipine could increase the SOD act ivity and decrease the MDA level, but the effects of JD was stronger than those of nimodipine, which implies that the two drugs have anti-lipid-peroxidating eff ects, and JD is more effective than nimodipine.
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KEY WORDS: Jiedutongluo Decoction; Vascular Dementia; Anti-Lipid-Peroxidat ion
研究已证实， 脑缺血再灌的病理生理是一个多环节、 多因素、 多途径损伤 级联反应。其中自由基参与脑缺血再灌注损伤的发生， 既是神经元损伤的致命生化因素， 又是损伤级联反 应的关键环节。脑缺血再灌注引起自由基的代谢紊乱，导致神经细胞损伤和功能障碍。清除 自由基可减少急性脑梗塞的缺血损伤、 改善神经功能。因此， 我们应用中医中药对脑缺血 再灌进行多靶点的干预， 通过动物实验观察了脑缺血再灌后脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)含量的变化， 探讨解毒通络方抗脑缺血再灌后脂质过氧化损伤的作用效果及 作用机制。
1 材料
1.1 动物
雄性Wistar大鼠12月龄，体重(300±10)g，由中国医学科学院动物中心提供。
, http://www.100md.com
1.2 药品试剂与仪器
解毒通络方:由栀子、丹参、黄芪、天麻组成，北京中医药大学药学院中药 制剂室制备成口服液。硝普钠(北京制药工业研究所实验药厂)。MDA和SOD试剂盒(南京建成 生物工程研究所)。主要仪器：721型分光光度计(上海光学仪器厂)。
2 方法
2.1 脑缺血再灌模型
在环境温度为25～30 ℃下，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉。仰卧 固定于解剖板上，剪去颈前部术区的毛，消毒皮肤，颈部正中切口，分离出双侧颈总动脉( 注意勿损伤迷走神经)，将双股丝线从颈总动脉下穿过。牵拉时丝线中断颈总动脉血流，同 时迅速腹腔注射硝普钠0.25 mg/kg，10 min后松开丝线恢复颈总动脉供血，需10 min后 再次牵拉丝线阻断血流，持续10 min松开，撤去丝线，术区撒青霉素粉适量，逐层缝合切口 。
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2.2 动物分组及处理
造模成功的大鼠,随机分4组：假手术组、模型组、解毒通络方组、尼莫地平组。假手 术组手术过程同模型组，但不结扎血管，术后每日灌胃自来水；解毒通络方组每日灌胃解毒 通络方5.3 mL/kg(含生药量1.88 g/mL)；尼莫地平组每日灌胃尼莫地平5 mg/kg。 解毒通络方组与尼莫地平组在动物造模前3 d每日1次，造模后第2天开始给药，每日1次 ，末次给药2～3 h后，动物杀检，取脑组织进行检测。
2.3 脑组织SOD、MDA含量的测定
①样品制备：取皮层脑组织，用预冷的生理盐水按重量(mg)体积(mL)比制备脑组织匀浆 。②按考马斯亮蓝法测定蛋白含量。③SOD测定：参照试剂盒说明书, 取1%的脑组织匀浆， 在550 nm波长下比色测定。 计算公式： SOD活力(U/mg)=[(对照管吸光度-测定管吸光度 )/对 照管吸光度]/50%×3.85/0.05/脑组织蛋白含量。④MDA测定：按试剂盒说明书， 取10 %脑组织匀浆在532 nm波长下比色测定其光密度(OD值)。MDA含量(U/mg)=(测定管吸 光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×10×样品稀释倍数/脑 组织蛋白含量。
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3 结果
结果见表1。
表1 解毒通络方对大鼠脑缺血再灌后脑组织SOD活力的影响 (U/mg;
±s) 组别n
1 d
3 d
7 d
15 d
SOD
MDA
SOD
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MDA
SOD
MDA
SOD
MDA
假手术组
10
7.44±1.17
4.14±0.44
7.44±1.17
4.14±0.44
7.44±1.17
4.14±0.44
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7.44± 1.17
4.14±0.44
模型组
8
4.59±0.49
6.84±0.95
2.26±0.71
7.17±0.85
4.26±1.2 8
7.79±1.18
6.77±0.42
4.66±0.71
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解毒通络方组
8
5.43±0.57
5.10±0.84*
4.53±0.86**
5.80± 0.96[ 〗6.17±0.84*
5.18±1.04**
7.16±0.62
3.20±1.22**
尼莫地平组
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8
5.05±0.50*
5.42±0.42
4.33±0.19*
5.35±1.14*
5.22±1.17
4.91±0.84**
6.93±0.30
4.51±1.04
注：与同期模型组比较*P<0.05 **P<0.01 本实验通过动态观察脑内脂质过氧化产物MDA含量和自由基清除剂SOD活性的变化，发现模型 组脑缺血再灌注后1 d MDA含量开始增加，3 d MDA含量显著增加，7 d脑组织MDA持续高于假 手术组，15 d MDA含量有所下降但仍高于假手术组。解毒通络方组与尼莫地平组脑组织MDA 含 量在各时间点(1、3、7、15 d)升高程度较模型组减轻，均具有统计学意义(P<0.01或 P<0.05)。模型组脑组织SOD活性在各时间点(1、3、7、15 d)均低于假手术组，以7 d 最严重，15 d时也仍低于假手术组。解毒通络方组与尼莫地平组SOD活性均高于模型组(P<0.01，P<0.05)。
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4 讨论
在通常情况下，机体自由基的生成与清除能力保持着动态平衡。脑缺血再灌可触发脑组织中 自由基的大量产生。自由基具有异常活泼的反应性，它可以与生物大分子、尤其是生物膜上 的不饱和脂肪酸反应，形成脂质过氧化物，破坏生物膜系统。而且，自由基一旦产生，便启 动自我催化的链式反应，使得在其自身不被消耗的情况下，脂质过氧化物不断积累，导致膜 结构受损、功能障碍，其程度逐步加重。同时，自由基介导的膜损害可以涉及膜受体。M- 受体、肾上腺素能受体、组织胺能受体、5羟色胺能受体、生长激素受体均含有巯基，巯基 参与受体与G蛋白的偶联，巯基的烷化阻断了这种偶联，改变了受体的功能和结合特性，干 扰了递质的释放和摄取，在不同环节上影响了缺血后神经元损伤和修复的过程[1～3] 。MDA是 脂质过氧化物的分解产物，为一种重要的生物大分子交联剂，它能交联蛋白质与核酸，使DN A发生突变，影响信息传递、转录和复制，从而导致蛋白质合成能力下降或合成蛋白质功能 紊乱。同时使自由基清除剂的关键酶——超氧化物歧化酶(SOD)生成减少、活性降低。
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本实验结果说明了脑缺血再灌注后脑内自由基大量产生以及抗脂质过氧化功能的降低、自由 基清除能力下降参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制，是导致该模型动物神经细胞发生迟发 性神经元死亡的一个重要原因。解毒通络方与尼莫地平均可以降低脑组织中MDA含量，提高S OD活性。尼莫地平是钙通道阻滞剂，能扩张脑血管，增加脑缺血再灌后的脑血流量，从而清 除组织中过多的MDA，使SOD活性提高；而且，尼莫地平可以直接作用于神经细胞，降低脑缺 血区神经细胞内游离钙离子浓度，减轻缺血性脑损伤。解毒通络方是否与尼莫地平有类似的 作用可以降低神经细胞内钙离子浓度，扩张脑血管，增加脑血流量，有待今后进一步研究。
氧自由基在脑缺血再灌后迟发性神经元死亡中的作用与中医学“毒损脑络”的机制有其相似 之处。中医认为中风后产生瘀毒、热毒、痰毒互结，毒邪可败坏形体，损失脑络，使脑神失 用。因此，在治疗与用药方面以解毒为大法，及时清除与抑制这些有毒物质的产生，可有效 提高中风治愈率[4]。我们根据中风病本虚(脏腑虚损)、标实(瘀、痰、毒)病 理特点 ，以清热解毒、养血活血通络为治法，组成栀子、丹参、黄芪、天麻的解毒通络方。方中栀 子善入血分解血络壅塞之热毒；丹参活血化瘀、解毒和络，辅助栀子以祛血络热毒之邪；黄 芪既益气升阳，又具有托毒生肌、利水消肿、活血化瘀等作用。天麻熄风柔络， 其主 要成分天麻素可以对抗小鼠脑缺血再灌后脑内脂质过氧化损伤、抑制兴奋性氨基酸的升高 [5]。四药合用使毒祛络通，气血充润，脑神得养，神机可复。根据以往的实验结果 可知， 本方可以明显改善脑缺血再灌后损伤了的海马结构。本实验进一步证明解毒通络方不仅可以 降低自由基，而且可以提高机体抗氧化能力，从而，在缺血再灌早期阻断了脑缺血再灌后神 经系统的损伤级联反应，保护神经元。
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国家自然科学基金课题(No.39970937)
冀宏，女，36岁，医学博士，主治医师
参 考 文 献
1，陈光辉，饶明俐.脑缺血再灌流与生物膜损伤. 国外医学。脑血管疾病分册， 1 996，4(4)：209～211
2，Patel M, Day Bj, Crapo JD, et al. Requirement for superoxide in excitotoxic c ell death. Neuron， 1996，16:345～355
3，Chan PH, Epstein CJ, Kinouchi H, et al. Role of superoxide dismut ase in ischemic brain injury: reduction of edema and infarction in transgenic mi ce following focal cerebral ischemia. Prog Brain Res，1993，96:97～104
4，王永炎. 关于提高脑血管疾病疗效难点的思考.中国中西医结合杂志，1997，17(2)：1 95～196
5，唐一鹏，赵树民，孙丽萍，等.抗呆合剂对小鼠脑缺血再灌注脑内氨基酸、乙酰胆碱酯酶 活力的影响.北京中医药大学学报， 1999，22(4)：16～18
(收稿日期：2000-05-28), 百拇医药