酒精性肝纤维化动物模型的建立
作者：丁 霞 蒙一纯 贲长恩 田德录
单位：丁 霞 蒙一纯 贲长恩 田德录(北京中医药大学 北京 100029)
关键词：肝纤维化；酒精；动物模型
中国中医基础医学杂志990719 摘 要 在参阅中外相关文献的基础上，结合国内实验条件成功地建立了酒精性肝纤维化动物模型，本文就造模方法进行了详细论述，并从形态学等方面进行了模型的验证，经Masson三色染色证实造模组肝组织中央静脉及汇管区周围胶原纤维明显增生。肝细胞索排列紊乱，肝细胞空泡样变性，肝血窦增宽，窦壁增厚，少数有小叶间隔形成。本模型的建立将为验证抗酒精性肝纤维化药物的疗效打下良好的实验室基础。
随着酒精消费人口及人均酒精消费量的增多，酒精对人体的损害特别是对肝脏的损伤作用日益引起人们的重视。在酒精性肝病中，由于酒精性肝纤维化是肝硬化的前期阶段且具有可逆转性，因此成为研究的焦点。国外在七十年代就已利用狒狒成功地建立了类似于人类的酒精性肝硬化的动物模型[1]，八十年代又采用胃瘘管灌注酒精性液体饲料的方法建立了比较理想的酒精性肝损伤的动物模型[2]，因此为进行基础研究创造了良好的条件。国内对酒精性肝病的研究目前还偏重于临床研究，基础研究相对薄弱。国内目前尚未见有关酒精性肝纤维化动物模型研制的报道，因此无法结合动物模型更深入地研究药物抗酒精性肝纤维化的效果，无法对药物做出更完善和更确切的评价，我们通过参考国外的造模方法并结合实际条件，通过多次模索终于成功地建立了酒精性肝纤维化动物模型，为今后广泛开展多学科研究打下了实验室基础，特别是为评价药物疗效打下了基础。
, 百拇医药
1 造模材料与方法
1.1 材料 选用纯系Wistar雄性大鼠，体重在180g～200 g之间，来源于中国医学科学院动物所。将大鼠饲养在23℃～25℃室内，自由进食、进水。二锅头白酒选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。玉米油选用美国出产的由厦门某公司经销的产品。吡唑为Sigma公司产品，由北京中山生物公司购得。
1.2 方法 造模组动物每天清早灌胃白酒—玉米油—吡唑混合液。另外间断给予高脂饲料。其中酒的摄入量为8g/kg.d～12 g/kg.d，随时间的延长而递增；玉米油的摄入量为2g/kg/d；吡唑的摄入量为24 mg/kg/d。造模时间为12周。造模过程中要不断观察动物一般状况及体重的变化。
2 造模结果
2.1 一般状况 造模组大鼠每天早晨灌酒后不久就出现四肢瘫软，酣睡的醉酒状态，且随着造模时间的延长，酣睡持续的时间亦延长，从最初的1个多小时到最后的7～8 h。而且饮食逐渐减少，大便有时松散不成形。皮毛疏松无光泽，精神不振。体重后期下降。
, 百拇医药
2.2 一般组织形态学观察 造模12周结束时取材，肉眼见肝表面凹凸不平，有的可见白色点状凸起，肝脏颜色晦暗，边缘发钝。镜下可见不同类型的变性、坏死及胶原纤维增生。肝细胞的变性主要有脂肪变，水样变性和气球样变。肝细胞变性坏死比较明显，局部可见中性粒细胞及少数淋巴细胞浸润。造模大鼠均形成肝纤维化，有窦周纤维化，肝终末静脉周围纤维化，汇管区及汇管区周围纤维化。但肝纤维化形成的程度不同，主要为轻度酒精性肝纤维化和中度酒精性肝纤维化。其中窦周纤维化比较明显，轻度者可见窦壁网状纤维增粗变直，插入肝细胞之间，甚至包绕一个或几个肝细胞，但小叶结构保留。中度者可见胶原纤维沿窦周沉积，环绕肝细胞呈网格状或龟壳样，范围多较广泛。
讨论
在西方国家，酒精中毒是80%肝硬化的原因，在我国酒精性肝病的发病率也日渐升高。酒精性肝纤维化作为转归和预后的重要阶段是治疗的契机。为了更好地研究中药对酒精性肝纤维化的疗效及治疗途径，建立可靠的动物模型是不可缺少的，国外虽已利用狒狒成功地制造了酒精性肝硬化的模型，但由于狒狒价格昂贵且造模时间长无法开展。要造成进行性酒精性肝损伤，必须给动物过量的酒精，并保持血液内持续性高酒精含量。所以有人创立了酒精性液体饲料的方法。但由于大鼠天性厌酒，所以用含酒精的液体饲料喂大鼠来造成肝损伤的动物模型就受到了很大的限制。为了克服大鼠的厌酒，也曾设计出不同的给酒方式，静脉内给酒[3]及应用持续性酒精胃瘘管[4]等等。为促进酒精对肝脏的损伤，有人在酒精液体饲料中加入乙醇脱氢酶抑制剂[5]等。但在众多的酒精中毒动物模型中，通过胃瘘管给动物饲以酒精性液体饲料是造成酒精性肝病最理想的方法。利用酒精性液体饲料持续灌注的方法虽然先进且避免了给动物灌胃的麻烦，但是胃瘘管灌注装置国内没有生产，国外的产品价格难以接受。我们在借鉴国外造模经验的基础上，结合现实条件利用给大鼠灌胃酒精、玉米油、吡唑的混悬液，并间断喂养高脂饲料的方法成功地建立了酒精性肝纤维化动物模型，在国内属于首次，本造模方法具有肝纤维化出现率高、造模方便、价格低廉特点，而且模型稳定。因此，本方法的建立为筛选有效的抗酒精性肝纤维化药物打下了良好的实验室基础。
, http://www.100md.com
作者简介：丁霞，女，28岁，北京中医药大学东直门医院博士生。1985年考入山东中医药大学少年班，分别于1993年和1996年获得山东中医药大学中医专业学士学位和中医内科心血管专业硕士学位。现为北京中医药大学东直门医院田德录教授的博士生。主编及参编了《冠心病的自我防治与调养》、《四季保健与常见病防治》、《疲劳综合征的防治与调养》。现从事的课题为中医药抗酒精性肝纤维化的临床及实验研究。
参考文献
1 Rubin E,Lieber CS.Fatty liver,alcoholic hepatitis and cirrhosis produced by alcohol in primates.N.Engl.J.Med.1974,290:128
2 Hidekaru Toukamoto.Severe and Progressive Steatosis and Focal Necrosis in Rat Liver Induced by Continuous Intragastric Infusion of Ethanol and low Fat diet.Hepatology 1985,5:224～232
, 百拇医药
3 Smith S,Davis.Intravenous self-administration in the rat.Pharmac.Res.Commun.1974,6:397
4 Erickson C,Kock K,Mehta C,et al.Sustained release of alcoholic suboutaneous silastic implants in mice.Science 1978,199:1457
5 Lieber CS,Rubin E,Decarli LM,et al.Effects of pyrazole on hepatic function and structure.Lab.Invest.1970,22:615～621
(收稿日期 1998—11—28 修回日期 1999—03—07), 百拇医药
单位：丁 霞 蒙一纯 贲长恩 田德录(北京中医药大学 北京 100029)
关键词：肝纤维化；酒精；动物模型
中国中医基础医学杂志990719 摘 要 在参阅中外相关文献的基础上，结合国内实验条件成功地建立了酒精性肝纤维化动物模型，本文就造模方法进行了详细论述，并从形态学等方面进行了模型的验证，经Masson三色染色证实造模组肝组织中央静脉及汇管区周围胶原纤维明显增生。肝细胞索排列紊乱，肝细胞空泡样变性，肝血窦增宽，窦壁增厚，少数有小叶间隔形成。本模型的建立将为验证抗酒精性肝纤维化药物的疗效打下良好的实验室基础。
随着酒精消费人口及人均酒精消费量的增多，酒精对人体的损害特别是对肝脏的损伤作用日益引起人们的重视。在酒精性肝病中，由于酒精性肝纤维化是肝硬化的前期阶段且具有可逆转性，因此成为研究的焦点。国外在七十年代就已利用狒狒成功地建立了类似于人类的酒精性肝硬化的动物模型[1]，八十年代又采用胃瘘管灌注酒精性液体饲料的方法建立了比较理想的酒精性肝损伤的动物模型[2]，因此为进行基础研究创造了良好的条件。国内对酒精性肝病的研究目前还偏重于临床研究，基础研究相对薄弱。国内目前尚未见有关酒精性肝纤维化动物模型研制的报道，因此无法结合动物模型更深入地研究药物抗酒精性肝纤维化的效果，无法对药物做出更完善和更确切的评价，我们通过参考国外的造模方法并结合实际条件，通过多次模索终于成功地建立了酒精性肝纤维化动物模型，为今后广泛开展多学科研究打下了实验室基础，特别是为评价药物疗效打下了基础。
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1 造模材料与方法
1.1 材料 选用纯系Wistar雄性大鼠，体重在180g～200 g之间，来源于中国医学科学院动物所。将大鼠饲养在23℃～25℃室内，自由进食、进水。二锅头白酒选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。玉米油选用美国出产的由厦门某公司经销的产品。吡唑为Sigma公司产品，由北京中山生物公司购得。
1.2 方法 造模组动物每天清早灌胃白酒—玉米油—吡唑混合液。另外间断给予高脂饲料。其中酒的摄入量为8g/kg.d～12 g/kg.d，随时间的延长而递增；玉米油的摄入量为2g/kg/d；吡唑的摄入量为24 mg/kg/d。造模时间为12周。造模过程中要不断观察动物一般状况及体重的变化。
2 造模结果
2.1 一般状况 造模组大鼠每天早晨灌酒后不久就出现四肢瘫软，酣睡的醉酒状态，且随着造模时间的延长，酣睡持续的时间亦延长，从最初的1个多小时到最后的7～8 h。而且饮食逐渐减少，大便有时松散不成形。皮毛疏松无光泽，精神不振。体重后期下降。
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2.2 一般组织形态学观察 造模12周结束时取材，肉眼见肝表面凹凸不平，有的可见白色点状凸起，肝脏颜色晦暗，边缘发钝。镜下可见不同类型的变性、坏死及胶原纤维增生。肝细胞的变性主要有脂肪变，水样变性和气球样变。肝细胞变性坏死比较明显，局部可见中性粒细胞及少数淋巴细胞浸润。造模大鼠均形成肝纤维化，有窦周纤维化，肝终末静脉周围纤维化，汇管区及汇管区周围纤维化。但肝纤维化形成的程度不同，主要为轻度酒精性肝纤维化和中度酒精性肝纤维化。其中窦周纤维化比较明显，轻度者可见窦壁网状纤维增粗变直，插入肝细胞之间，甚至包绕一个或几个肝细胞，但小叶结构保留。中度者可见胶原纤维沿窦周沉积，环绕肝细胞呈网格状或龟壳样，范围多较广泛。
讨论
在西方国家，酒精中毒是80%肝硬化的原因，在我国酒精性肝病的发病率也日渐升高。酒精性肝纤维化作为转归和预后的重要阶段是治疗的契机。为了更好地研究中药对酒精性肝纤维化的疗效及治疗途径，建立可靠的动物模型是不可缺少的，国外虽已利用狒狒成功地制造了酒精性肝硬化的模型，但由于狒狒价格昂贵且造模时间长无法开展。要造成进行性酒精性肝损伤，必须给动物过量的酒精，并保持血液内持续性高酒精含量。所以有人创立了酒精性液体饲料的方法。但由于大鼠天性厌酒，所以用含酒精的液体饲料喂大鼠来造成肝损伤的动物模型就受到了很大的限制。为了克服大鼠的厌酒，也曾设计出不同的给酒方式，静脉内给酒[3]及应用持续性酒精胃瘘管[4]等等。为促进酒精对肝脏的损伤，有人在酒精液体饲料中加入乙醇脱氢酶抑制剂[5]等。但在众多的酒精中毒动物模型中，通过胃瘘管给动物饲以酒精性液体饲料是造成酒精性肝病最理想的方法。利用酒精性液体饲料持续灌注的方法虽然先进且避免了给动物灌胃的麻烦，但是胃瘘管灌注装置国内没有生产，国外的产品价格难以接受。我们在借鉴国外造模经验的基础上，结合现实条件利用给大鼠灌胃酒精、玉米油、吡唑的混悬液，并间断喂养高脂饲料的方法成功地建立了酒精性肝纤维化动物模型，在国内属于首次，本造模方法具有肝纤维化出现率高、造模方便、价格低廉特点，而且模型稳定。因此，本方法的建立为筛选有效的抗酒精性肝纤维化药物打下了良好的实验室基础。
, http://www.100md.com
作者简介：丁霞，女，28岁，北京中医药大学东直门医院博士生。1985年考入山东中医药大学少年班，分别于1993年和1996年获得山东中医药大学中医专业学士学位和中医内科心血管专业硕士学位。现为北京中医药大学东直门医院田德录教授的博士生。主编及参编了《冠心病的自我防治与调养》、《四季保健与常见病防治》、《疲劳综合征的防治与调养》。现从事的课题为中医药抗酒精性肝纤维化的临床及实验研究。
参考文献
1 Rubin E,Lieber CS.Fatty liver,alcoholic hepatitis and cirrhosis produced by alcohol in primates.N.Engl.J.Med.1974,290:128
2 Hidekaru Toukamoto.Severe and Progressive Steatosis and Focal Necrosis in Rat Liver Induced by Continuous Intragastric Infusion of Ethanol and low Fat diet.Hepatology 1985,5:224～232
, 百拇医药
3 Smith S,Davis.Intravenous self-administration in the rat.Pharmac.Res.Commun.1974,6:397
4 Erickson C,Kock K,Mehta C,et al.Sustained release of alcoholic suboutaneous silastic implants in mice.Science 1978,199:1457
5 Lieber CS,Rubin E,Decarli LM,et al.Effects of pyrazole on hepatic function and structure.Lab.Invest.1970,22:615～621
(收稿日期 1998—11—28 修回日期 1999—03—07), 百拇医药