人脑肿瘤端粒酶活性的研究
作者：张岩松 傅震
单位：张岩松(南京医科大学附属脑科医院神经外科 210029)；傅震(南京医科大学第一附属医 院神经外科)
关键词：
临床神经病学杂志000534 端粒是真核染色体末端的特殊结构，人端粒由6个碱基重复序列(TTAGGG)和结合蛋白组成 [1]。端粒有重要的生物学功能，能够稳定染色体，防止其末端融合；保护染色体 结构基因；调节正常细胞生长[2]。正常细胞在进行DNA复制时，5’端出现8～12对 的碱基缺失，随着细胞不断增殖，端粒逐渐缩短；当端粒缩短到一定程度，细胞停止分裂并 出现衰亡，故端粒也被称为正常细胞的“分裂钟”[3]。端粒酶是一种特殊的逆转 录DNA合成酶，由RNA和蛋白质组成的核糖核酸—蛋白复合体，能以自身的RNA组分为模板 合成端粒，以补偿细胞分裂时染色体末端(端粒)的缩短。正常人体细胞一般检测不到端粒 酶活性，而恶性肿瘤细胞中端粒酶阳性率将近90%[4]。大量资料表明，端粒和端粒 酶与正常细胞生长调控及恶性肿瘤形成机理有关[5]。Kim等[6]最早检测 了脑肿瘤中的端粒酶活性，在8例标本中有6例阳性。自此以后，又有不少学者对脑肿瘤中的 端粒酶的表达情况进行了研究。现将1994～1998年间国外有关研究资料综述如下。
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1 端粒酶活性的测定方法
1.1 端粒重复序列扩增方法 Kim等[6]1994年创立此方法，它将端粒重复序列 延伸与PCR技术巧妙结合，检测敏感性大大提高，可检出10个以下细胞中的端粒酶。其主要 步骤：(1)制备含有端粒酶的细胞提取液。(2)取微量细胞提取液，加入TS引物(18 bp 的寡核苷酸)，端粒酶即可与之结合，并在其3’端合成及延伸TTAGGG重复序列；在延伸反 应中，TS引物作为端粒酶的底物，而在扩增端粒重复序列的PCR反应时，TS为上游引物。(3 )加入CX引物和Taq酶进行PCR反应，CX引物是24 bp寡核苷酸，能与端粒重复序列互补结合 ，为PCR反应中的下游引物；在PCR反应中掺入α-32PdCTP，相差6 bp的不同长度的端粒重 复序列片断被大量扩增，放射自显影后，端粒酶阳性者出现6 bp间隔的多个条带，排列呈阶 梯状。
1.2 加内对照TRAP法 由于标本中Taq酶的抑制因素会影响PCR结果，容易导致假阴性，199 5年Wright报道了加内对照TRAP[7]：以150 bp大鼠肌浆蛋白基因片断为内对照，设 计出TS、CX与肌浆蛋白基因的复合引物，用它的扩增产物作为内对照模板；在TRAP检测时加 入上述模板，结果可见186 bp内对照条带；如果内对照条带不出现，提示PCR反应存在问题 ，应该排除假阴性结果。这种方法在脑肿瘤的端粒酶研究中已被普遍使用[8，11，13 ，14]。
, 百拇医药
1.3 相对端粒酶活性的测定 一般TRAP法的明显弱点是无法对端粒酶活性进行定量测定， 人们只能通过条带颜色的深浅大概估计酶活性的高低[11]。为此，Sano等 [8]将人脑胶质瘤细胞系T98G作为阳性参照，先得到测定其端粒酶活性的放射自显影图 像；再对条带密度进行标准化处理，由浅至深选择10个条带，输入计算机经图像分析软件处 理，作为端粒酶活性的检测标准；然后把脑肿瘤标本的自显影图像与之比较，计算出相对端 粒酶活性，用百分比值来表示，从而使端粒酶活性得以量化。
2 脑肿瘤中端粒酶活性的表达
根据近年来国外期刊发表的有关人脑肿瘤端粒酶活性的9篇研究报道[6, 8～15]，将 临床上较为常见的各种脑肿瘤中端粒酶的表达情况总结如下，见表1。
3 端粒酶和恶性脑肿瘤发生与发展
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大量资料显示，随着脑肿瘤恶性程度的增加，肿瘤细胞中端粒酶活性也随之明显提 高[15]。
表1 常见脑肿瘤中端粒酶的
表达情况(例,%) 脑肿瘤病理类型
检测
例数
端粒酶
阳性
神经上皮性肿瘤
星形细胞瘤
41
7(17.1)
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恶性星形细胞瘤
60
19(31.7)
多形性胶质母细胞瘤
186
135(72.6)
少枝胶质细胞瘤
41
38(92.7)
室管膜瘤
7
1(14.3)
脉络丛肿瘤
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1
0(0)
神经母细胞瘤
8
8(100)
原始神经上皮性肿瘤
14
13(92.9)
神经鞘瘤(雪旺氏细胞瘤)
48
0(0)
起源脑膜的肿瘤
脑膜瘤
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80
2(2.5)
非典型脑膜瘤
8
4(50)
恶性脑膜瘤
2
1(50)
血管外皮细胞瘤
6
5(83.3)
垂体腺瘤
典型垂体腺瘤
, 百拇医药
30
0(0)
侵袭性垂体腺瘤
6
0(0)
转移瘤
26
23(88.5)
1995年，Langford等[9]报告了90例人脑肿瘤端粒酶活性的测定 结果，51例多形性胶质母细胞瘤中38例测到酶活性(75%)，20例间变性(恶性)星形细胞 瘤中2例酶阳性(10%)，19例少枝胶质细胞瘤全部阳性(100%)。研究认为，端粒酶活性增 加提示肿瘤向恶性进展，端粒酶阳性的恶性星形细胞瘤，极有可能演变为恶性度更大的多形 性胶质母细胞瘤，了解端粒酶何时被激活是十分重要的；端粒酶阴性的脑肿瘤之所以能达到 永生化，可能是通过其它替代机理来维持端粒长度的；一个有利的证明是，端粒酶阴性的原 发性脑肿瘤的平均端粒长度大于其周围的非肿瘤组织的。作者指出，不是所有恶性胶质瘤中 都存在永生细胞，某些恶性肿瘤细胞在演化时不一定非要激活端粒酶；对于部分胶质瘤来说 ，增殖能力已经不是最重要的肿瘤特征，它与肿瘤恶性进展的最终结果无关，对神经母细胞 瘤的研究结果充分证明了这一点。
, 百拇医药
1998年，Le等[13]检测了65例人脑胶质瘤中的端粒酶活性，肿瘤细胞中 端粒酶阳性率分别是，多形性胶质母细胞瘤89%，恶性星形细胞瘤45%，良性和低度恶性星形 细胞瘤33%，少枝胶质细胞瘤75%。作者认为，由于在大多数恶性脑胶质瘤中均可检出端粒酶 的活性，其阳性率明显高于偏良性的脑胶质瘤，端粒酶活性的存在可作为一个独立的临床指 标，用以判断胶质瘤的恶性程度；动物实验已经证明，端粒酶是在肿瘤恶性进展的后期被激 活，但也有资料显示，在某些肿瘤中，端粒酶活性在肿瘤发生的早期即可被发现，多形性胶 质母细胞瘤的发生和恶性进展与端粒酶的激活关系密切。
4 端粒酶活性与预后的关系
相同类型脑肿瘤端粒酶活性的不同，是否会影响肿瘤患者的预后，有不少学者对这方面进行 了较深入的研究。1995年，Hiyama在一篇关于端粒酶活性与人神经母细胞瘤关系的报道中指 出[10]，有3例神经母细胞瘤不表现端粒酶活性，结果3例患者都恢复了健康，而其 余表达端粒酶活性的患者均预后不良，这一结果直接说明了端粒酶与肿瘤的密切关系。
, 百拇医药
Nakitani等[12]在对原发多形性胶质母细胞瘤的研究中发现，测出端粒酶活性的 患者中位生存期(从确诊时算起)为8个月，而未测到端粒酶活性的是13.8个月。尽管两者 之间无统计学差异，但后者的生存率比前者有所增高。作者认为，端粒酶活 性的表达与肿瘤增殖无相关性，但与细胞的永生化有关。端粒酶阳性的病人比阴性病人预后 要差，端粒酶活性的表达可成为多形性胶质母细胞瘤恶性程度的一个全新标志物，在临床上 ，对恶性胶质瘤的预后判断极为有用。
1998年， Hiraga等[14]追踪随访了15例星形细胞瘤、15例恶性星形细胞瘤和47例 多形性胶质母细胞瘤患者的预后情况，其中端粒酶阳性人数分别为3例、6例和34例。作者用 Kaplan-Meier生存曲线分别计算3种肿瘤病人的生存期，结果发现端粒酶阳性的星形细胞瘤 和恶性星形细胞瘤患者的生存期，与端粒酶阴性的病人相比明显缩短；而在多形性胶质母细 胞瘤患者中未出现此种差异。研究指出，星形细胞瘤和恶性星形细胞瘤中端粒酶活性增加， 强烈提示肿瘤细胞获得了在短时间内发展为恶性程度更高的晚期肿瘤的潜在能力，这与肿瘤 的组织学结构和外科手术的切除比例没有直接关系；对于多形性胶质母细胞瘤，由于它具有 如此大的侵袭性，可能不是端粒酶的激活，而是其它因素导致了肿瘤的快速生长。因此，作 者认为，端粒酶活性作为判断病人预后的指标，仅适用于星形细胞瘤和恶性星形细胞瘤患者 。
, 百拇医药
5 端粒酶研究的前景
目前已有大量资料表明，端粒酶与脑肿瘤， 尤其是恶性脑肿瘤的发生发展密切相关 。如果某些恶性脑肿瘤的恶性演变依赖于端粒酶的激活，即使只是几种类型肿瘤，设计出针 对端粒酶的抑制性药物将十分有意义。正常体细胞有足够的端区储备，其分裂不如肿瘤细胞 活跃，分裂代数有限，自始至终都不表达端粒酶活性；而肿瘤细胞分裂活跃，具有无限分裂 增生能力，依赖于端粒酶活性来维持端粒的相对稳定[16]。因此，端粒酶抑制剂应 该对肿瘤细胞有很强的选择性抑制作用，不会损伤正常体细胞，这正是目前大多数抗肿瘤药 物所缺乏的。有关这方面的研究已取得很大进展。有科学家用端粒酶RNA成分或端粒酶基因m RNA的反义寡核苷酸来阻断端粒酶活性[17]。在Hela细胞的离体实验中，转入反义 寡核苷酸的细胞在分裂20～24代后死亡，而空白对照组细胞仍继续分裂增殖[18]。 可以预计，在不久的将来，通过抑制端粒酶活性治疗恶性脑肿瘤的方法，会出现在临床实际 应用中[9]。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Blackburn EH.Nature,1991,350:569
2，Zakian VA.Science,1995,270:1601
3，Harley CB.Mutat Res,1991,256:271
4，Shy JW,Bacchetti S.Eur J Cancer,1997,33:787
5，Greider CW,Blackburn EH.Scientific AM,1996,274:92
6，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse Kr,et al.Science,1994,266:2011
, 百拇医药
7，Wright WE,Shay JW,Piatyszek MA.Nucleic Acids Res,1995,23:3794
8，Sano T,Asai A,Mishima K,et al.British J of Cancer,1998,77:1633
9，Langford LA,Piatyszek MA,Xu R,et al.Lancet,1995,346:1267
10，Hiyama E,Hiyana K,Yokoyama T,et al.Nature Med,1995,1:249
11，DeMasters BK,Markham N,Lillehei KO,et al.Am J Clin Pathol,1997,107:548
12，Nakatani K,Yoshimi N,Mori H,et al.Cancer,1997,80:471
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13，Le S,Zhu JJ,Anthony DC, et al.Neurosurgery,1998,42:1120
14，Hiraga S,Ohnishi T,Izumoto S,et al.Cancer Res,1998,58:2117
15，DeMasters BK,Hashizumi TL,CI Sze, et al. J Clin Pathol, 1998, 51:284
16，Nawaz S, Hashizumi TL, Markham NE, et al. Am J Clin Pathol, 1997, 107:542
17，Avilion AA, Piatyszek MA, Gupta J, et al. Cancer Res, 1996,56:645
18，Feng JL, Funk WD, Wang SS, et al. Science, 1995, 269:1236
(收稿1999-06-11), 百拇医药
单位：张岩松(南京医科大学附属脑科医院神经外科 210029)；傅震(南京医科大学第一附属医 院神经外科)
关键词：
临床神经病学杂志000534 端粒是真核染色体末端的特殊结构，人端粒由6个碱基重复序列(TTAGGG)和结合蛋白组成 [1]。端粒有重要的生物学功能，能够稳定染色体，防止其末端融合；保护染色体 结构基因；调节正常细胞生长[2]。正常细胞在进行DNA复制时，5’端出现8～12对 的碱基缺失，随着细胞不断增殖，端粒逐渐缩短；当端粒缩短到一定程度，细胞停止分裂并 出现衰亡，故端粒也被称为正常细胞的“分裂钟”[3]。端粒酶是一种特殊的逆转 录DNA合成酶，由RNA和蛋白质组成的核糖核酸—蛋白复合体，能以自身的RNA组分为模板 合成端粒，以补偿细胞分裂时染色体末端(端粒)的缩短。正常人体细胞一般检测不到端粒 酶活性，而恶性肿瘤细胞中端粒酶阳性率将近90%[4]。大量资料表明，端粒和端粒 酶与正常细胞生长调控及恶性肿瘤形成机理有关[5]。Kim等[6]最早检测 了脑肿瘤中的端粒酶活性，在8例标本中有6例阳性。自此以后，又有不少学者对脑肿瘤中的 端粒酶的表达情况进行了研究。现将1994～1998年间国外有关研究资料综述如下。
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1 端粒酶活性的测定方法
1.1 端粒重复序列扩增方法 Kim等[6]1994年创立此方法，它将端粒重复序列 延伸与PCR技术巧妙结合，检测敏感性大大提高，可检出10个以下细胞中的端粒酶。其主要 步骤：(1)制备含有端粒酶的细胞提取液。(2)取微量细胞提取液，加入TS引物(18 bp 的寡核苷酸)，端粒酶即可与之结合，并在其3’端合成及延伸TTAGGG重复序列；在延伸反 应中，TS引物作为端粒酶的底物，而在扩增端粒重复序列的PCR反应时，TS为上游引物。(3 )加入CX引物和Taq酶进行PCR反应，CX引物是24 bp寡核苷酸，能与端粒重复序列互补结合 ，为PCR反应中的下游引物；在PCR反应中掺入α-32PdCTP，相差6 bp的不同长度的端粒重 复序列片断被大量扩增，放射自显影后，端粒酶阳性者出现6 bp间隔的多个条带，排列呈阶 梯状。
1.2 加内对照TRAP法 由于标本中Taq酶的抑制因素会影响PCR结果，容易导致假阴性，199 5年Wright报道了加内对照TRAP[7]：以150 bp大鼠肌浆蛋白基因片断为内对照，设 计出TS、CX与肌浆蛋白基因的复合引物，用它的扩增产物作为内对照模板；在TRAP检测时加 入上述模板，结果可见186 bp内对照条带；如果内对照条带不出现，提示PCR反应存在问题 ，应该排除假阴性结果。这种方法在脑肿瘤的端粒酶研究中已被普遍使用[8，11，13 ，14]。
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1.3 相对端粒酶活性的测定 一般TRAP法的明显弱点是无法对端粒酶活性进行定量测定， 人们只能通过条带颜色的深浅大概估计酶活性的高低[11]。为此，Sano等 [8]将人脑胶质瘤细胞系T98G作为阳性参照，先得到测定其端粒酶活性的放射自显影图 像；再对条带密度进行标准化处理，由浅至深选择10个条带，输入计算机经图像分析软件处 理，作为端粒酶活性的检测标准；然后把脑肿瘤标本的自显影图像与之比较，计算出相对端 粒酶活性，用百分比值来表示，从而使端粒酶活性得以量化。
2 脑肿瘤中端粒酶活性的表达
根据近年来国外期刊发表的有关人脑肿瘤端粒酶活性的9篇研究报道[6, 8～15]，将 临床上较为常见的各种脑肿瘤中端粒酶的表达情况总结如下，见表1。
3 端粒酶和恶性脑肿瘤发生与发展
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大量资料显示，随着脑肿瘤恶性程度的增加，肿瘤细胞中端粒酶活性也随之明显提 高[15]。
表1 常见脑肿瘤中端粒酶的
表达情况(例,%) 脑肿瘤病理类型
检测
例数
端粒酶
阳性
神经上皮性肿瘤
星形细胞瘤
41
7(17.1)
, 百拇医药
恶性星形细胞瘤
60
19(31.7)
多形性胶质母细胞瘤
186
135(72.6)
少枝胶质细胞瘤
41
38(92.7)
室管膜瘤
7
1(14.3)
脉络丛肿瘤
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1
0(0)
神经母细胞瘤
8
8(100)
原始神经上皮性肿瘤
14
13(92.9)
神经鞘瘤(雪旺氏细胞瘤)
48
0(0)
起源脑膜的肿瘤
脑膜瘤
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80
2(2.5)
非典型脑膜瘤
8
4(50)
恶性脑膜瘤
2
1(50)
血管外皮细胞瘤
6
5(83.3)
垂体腺瘤
典型垂体腺瘤
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30
0(0)
侵袭性垂体腺瘤
6
0(0)
转移瘤
26
23(88.5)
1995年，Langford等[9]报告了90例人脑肿瘤端粒酶活性的测定 结果，51例多形性胶质母细胞瘤中38例测到酶活性(75%)，20例间变性(恶性)星形细胞 瘤中2例酶阳性(10%)，19例少枝胶质细胞瘤全部阳性(100%)。研究认为，端粒酶活性增 加提示肿瘤向恶性进展，端粒酶阳性的恶性星形细胞瘤，极有可能演变为恶性度更大的多形 性胶质母细胞瘤，了解端粒酶何时被激活是十分重要的；端粒酶阴性的脑肿瘤之所以能达到 永生化，可能是通过其它替代机理来维持端粒长度的；一个有利的证明是，端粒酶阴性的原 发性脑肿瘤的平均端粒长度大于其周围的非肿瘤组织的。作者指出，不是所有恶性胶质瘤中 都存在永生细胞，某些恶性肿瘤细胞在演化时不一定非要激活端粒酶；对于部分胶质瘤来说 ，增殖能力已经不是最重要的肿瘤特征，它与肿瘤恶性进展的最终结果无关，对神经母细胞 瘤的研究结果充分证明了这一点。
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1998年，Le等[13]检测了65例人脑胶质瘤中的端粒酶活性，肿瘤细胞中 端粒酶阳性率分别是，多形性胶质母细胞瘤89%，恶性星形细胞瘤45%，良性和低度恶性星形 细胞瘤33%，少枝胶质细胞瘤75%。作者认为，由于在大多数恶性脑胶质瘤中均可检出端粒酶 的活性，其阳性率明显高于偏良性的脑胶质瘤，端粒酶活性的存在可作为一个独立的临床指 标，用以判断胶质瘤的恶性程度；动物实验已经证明，端粒酶是在肿瘤恶性进展的后期被激 活，但也有资料显示，在某些肿瘤中，端粒酶活性在肿瘤发生的早期即可被发现，多形性胶 质母细胞瘤的发生和恶性进展与端粒酶的激活关系密切。
4 端粒酶活性与预后的关系
相同类型脑肿瘤端粒酶活性的不同，是否会影响肿瘤患者的预后，有不少学者对这方面进行 了较深入的研究。1995年，Hiyama在一篇关于端粒酶活性与人神经母细胞瘤关系的报道中指 出[10]，有3例神经母细胞瘤不表现端粒酶活性，结果3例患者都恢复了健康，而其 余表达端粒酶活性的患者均预后不良，这一结果直接说明了端粒酶与肿瘤的密切关系。
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Nakitani等[12]在对原发多形性胶质母细胞瘤的研究中发现，测出端粒酶活性的 患者中位生存期(从确诊时算起)为8个月，而未测到端粒酶活性的是13.8个月。尽管两者 之间无统计学差异，但后者的生存率比前者有所增高。作者认为，端粒酶活 性的表达与肿瘤增殖无相关性，但与细胞的永生化有关。端粒酶阳性的病人比阴性病人预后 要差，端粒酶活性的表达可成为多形性胶质母细胞瘤恶性程度的一个全新标志物，在临床上 ，对恶性胶质瘤的预后判断极为有用。
1998年， Hiraga等[14]追踪随访了15例星形细胞瘤、15例恶性星形细胞瘤和47例 多形性胶质母细胞瘤患者的预后情况，其中端粒酶阳性人数分别为3例、6例和34例。作者用 Kaplan-Meier生存曲线分别计算3种肿瘤病人的生存期，结果发现端粒酶阳性的星形细胞瘤 和恶性星形细胞瘤患者的生存期，与端粒酶阴性的病人相比明显缩短；而在多形性胶质母细 胞瘤患者中未出现此种差异。研究指出，星形细胞瘤和恶性星形细胞瘤中端粒酶活性增加， 强烈提示肿瘤细胞获得了在短时间内发展为恶性程度更高的晚期肿瘤的潜在能力，这与肿瘤 的组织学结构和外科手术的切除比例没有直接关系；对于多形性胶质母细胞瘤，由于它具有 如此大的侵袭性，可能不是端粒酶的激活，而是其它因素导致了肿瘤的快速生长。因此，作 者认为，端粒酶活性作为判断病人预后的指标，仅适用于星形细胞瘤和恶性星形细胞瘤患者 。
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5 端粒酶研究的前景
目前已有大量资料表明，端粒酶与脑肿瘤， 尤其是恶性脑肿瘤的发生发展密切相关 。如果某些恶性脑肿瘤的恶性演变依赖于端粒酶的激活，即使只是几种类型肿瘤，设计出针 对端粒酶的抑制性药物将十分有意义。正常体细胞有足够的端区储备，其分裂不如肿瘤细胞 活跃，分裂代数有限，自始至终都不表达端粒酶活性；而肿瘤细胞分裂活跃，具有无限分裂 增生能力，依赖于端粒酶活性来维持端粒的相对稳定[16]。因此，端粒酶抑制剂应 该对肿瘤细胞有很强的选择性抑制作用，不会损伤正常体细胞，这正是目前大多数抗肿瘤药 物所缺乏的。有关这方面的研究已取得很大进展。有科学家用端粒酶RNA成分或端粒酶基因m RNA的反义寡核苷酸来阻断端粒酶活性[17]。在Hela细胞的离体实验中，转入反义 寡核苷酸的细胞在分裂20～24代后死亡，而空白对照组细胞仍继续分裂增殖[18]。 可以预计，在不久的将来，通过抑制端粒酶活性治疗恶性脑肿瘤的方法，会出现在临床实际 应用中[9]。
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参 考 文 献
1，Blackburn EH.Nature,1991,350:569
2，Zakian VA.Science,1995,270:1601
3，Harley CB.Mutat Res,1991,256:271
4，Shy JW,Bacchetti S.Eur J Cancer,1997,33:787
5，Greider CW,Blackburn EH.Scientific AM,1996,274:92
6，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse Kr,et al.Science,1994,266:2011
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7，Wright WE,Shay JW,Piatyszek MA.Nucleic Acids Res,1995,23:3794
8，Sano T,Asai A,Mishima K,et al.British J of Cancer,1998,77:1633
9，Langford LA,Piatyszek MA,Xu R,et al.Lancet,1995,346:1267
10，Hiyama E,Hiyana K,Yokoyama T,et al.Nature Med,1995,1:249
11，DeMasters BK,Markham N,Lillehei KO,et al.Am J Clin Pathol,1997,107:548
12，Nakatani K,Yoshimi N,Mori H,et al.Cancer,1997,80:471
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13，Le S,Zhu JJ,Anthony DC, et al.Neurosurgery,1998,42:1120
14，Hiraga S,Ohnishi T,Izumoto S,et al.Cancer Res,1998,58:2117
15，DeMasters BK,Hashizumi TL,CI Sze, et al. J Clin Pathol, 1998, 51:284
16，Nawaz S, Hashizumi TL, Markham NE, et al. Am J Clin Pathol, 1997, 107:542
17，Avilion AA, Piatyszek MA, Gupta J, et al. Cancer Res, 1996,56:645
18，Feng JL, Funk WD, Wang SS, et al. Science, 1995, 269:1236
(收稿1999-06-11), 百拇医药