肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗接种组和对照组定群血清流行病学研究
作者：阮玉华 柳炜 徐校平 翁寿清 周卫群 邓新清 顾惠心 朱智勇 徐志一
单位：阮玉华(中国预防医学科学院，北京 100050)；柳炜 徐校平 翁寿清 周卫群(建德市卫生防疫站，浙江 建德 311600)；邓新清 顾惠心 徐志一(复旦大学医学院流行病学教研室，上海 200032)；朱智勇(浙江省卫生防疫站，杭州 310009)
关键词：肾综合征出血热；灭活疫苗；隐性感染；免疫增强反应
中国计划免疫000406 摘要：为比较肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗接种组和对照组免疫后4年的抗体水平，1997年11月～1998年7月在浙江省建德市肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗随机对照试验现场，分别采集接种组和对照组双份血清295人和268人，检测血清中间接荧光抗体。按血清间接荧光抗体阳性或阴性来比较接种组和对照组的抗体水平，均未见接种组和对照组有显著差异。接种组同对照组免疫后4年抗体水平无显著性差异，未见肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗增强接种人群发生隐性感染。
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中图分类号：R512.8 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)04-0208-03
A Comparative Study on Antibody Levels of Vaccinated Group with Controlled Group Immunized with Type I Inactivated Vaccine against Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome
RUAN Yu-hua LIU Wei XU Xiao-ping et al.
(Chinese Academy of Preventive Medicine, Center of EPI, Beijing 100050, China)
, 百拇医药
Abstract: A comparative study on antibody levels of the vaccinated group with the controlled group was carried out in a randomized controlled field trial using type I inactivated vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Jiande county and the enhancement of subclinical infection by the vaccine was also surveyed. The paired sera from 295 vaccinated persons and 268 controlled persons who joined the field trial (Aug. 1994) in Jiande county were collected before immunization and four years later (Nov. 1997～July 1998). The anti-HFRS antibody was detected by indirect immuno-fluorescent assay(IFA). The results showed that by comparing HFRS antibody positive rates of the first sera of vaccinated group with that of the controlled group, there was no significant difference, the negative seroconversion rates were found the same in the two groups 4 years after immunization. There was no enhancement of subclinical infection found in vaccinated group.
, 百拇医药
Key words: Hemorrhagic fever with renal syndrome; Inactivated vaccine; Subclinical infection; Antibody dependence enhancement
我国研制生产的肾综合征出血热(HFRS)Ⅰ型和Ⅱ型灭活疫苗已进行了大规模现场效果评价，在疫苗的安全性、近期和中期免疫学和保护发病效果方面均获得较为满意的结果，尤其是免疫后中和抗体(PRNT)水平高于国外同类疫苗[1～3]。但疫苗免疫后其抗体变化情况及保护感染效果如何仍不甚清楚。同时，资料表明，在实验动物和细胞培养研究中，HFRS病毒具有抗体依赖的免疫增强反应，即免疫病理反应(Antibody dependence-enhancement，ADE)[4～6]。为此，本研究在HFRSⅠ型灭活疫苗效果评价现场，采用定群血清流行病学研究方法对接种组和对照组抗体变化情况进行比较，试图对该疫苗保护感染效果进行研究，并探讨HFRSⅠ型灭活疫苗是否具有抗体依赖免疫增强反应。
, 百拇医药
材料与方法
1 疫苗 上海生物制品研究所提供的沙鼠肾细胞HFRSⅠ型灭活疫苗(Z10株)，由β-丙内脂灭活，疫苗批号931001。
2 研究对象与接种方式 以建德市39个历年本病高发村15～60岁常住人口为观察对象，接种前将试点村的全部家庭随机编号，以单号家庭为接种组，双号为对照组。第1针于1994年8月上旬接种，基础3针按0、7、28天接种，1年后加强免疫1针。在建德市列入试验的自然村中，随机抽取12个村，按每个村人口数的比例，在15～60周岁的人群内，分别于1997年11月和1998年7月，随机采集双份血清563人(接种组295人和对照组268人)。
3 血清抗体检测方法 间接免疫荧光试验(IFA)用于检测血清中HFRS IgG抗体，抗原片(Z10)和抗人IgG荧光抗体由浙江省卫生防疫站提供，于日本Nikon公司生产的落射式荧光显微镜下观察，以血清稀释度1∶20为阳性。1997年和1998年系列血清为同批检测。
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4 统计分析 采用Foxbase+建立数据库，统计分析采用SPSS 7.5和EPI info软件包。
结 果
1 1997年11月～1998年7月接种组和对照组年龄、性别构成
对1997年11月～1998年7月接种组和对照组采集双份血清的563人进行分析。接种组和对照组男女性别构成无显著性差异(χ2＝0.04，P＝0.8399)。接种组和对照组年龄构成无显著性差异(χ2＝6.00，P＝0.115)。接种组295份免疫前血清抗体阳性38人，对照组268份血清免疫前抗体阳性24人，两组抗体阳性率无显著性差异(χ2＝2.20，P＝0.1376)(附表)。
附表 接种组和对照组年龄、性别构成(1997.11～1998.7) 年龄组
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(岁)
对照组
接种组
男
女
合计
男
女
合计
15～
14
9
23
9
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12
21
25～
30
53
83
44
49
93
35～
42
66
108
35
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63
98
45～
28
26
54
35
48
83
合计
114
154
268
123
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172
295
2 1997年11月～1998年7月接种组和对照组血清抗体阳性情况
接种组与对照组1998年血清抗体阴转率与阳转率均无差别(χ2＝0.08，P＝0.7748；χ2＝0.26，P＝0.6090)(附图)。
附图 接种组与对照组1997年、1998年系列血清IFA检测结果
讨 论
建德市HFRS发病率在70年代基本稳定于20/10万左右，自1981年起逐年上升，至1987年达140/10万，为历史高峰，然后又逐渐下降，至1994年降为25/10万左右。HFRS病例主要集中于20～59岁成人，平均发病年龄主要稳定于32～36岁，男性发病高于女性，疫区型别Ⅰ∶Ⅱ长期稳定于2.4∶1。
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隐性感染后抗体阴转较快，阴转率较高。在人群HFRS隐性感染后抗体变化研究中，阴转率达40%左右，隐性感染后可见部分抗体水平上升，隐性感染者均未出现过明显的HFRS临床症状[7，8]。李永良[9，10]也发现，157名隐性感染者经过1年的随访，22人抗体转阴，而随访的20名EHF病人无一人抗体转阴。虽然隐性感染后存在较高的抗体阴转率，但迄今未见有隐性感染后发生HFRS临床病例的报道，推测隐性感染后可能已获得较强的免疫力，能够保护发病。
在大规模疫苗效果现场考核中，我们证实了该疫苗安全、具有较好的免疫原性与保护发病效果。但该疫苗能否保护感染，本文对接种组与对照组的血清抗体阳性率及阴转率进行了分析。为了剔除IFA的系统误差和观察者的经验对结果判断的偏移，对1997年、1998年系列血清进行了同批检测，均未见接种组和对照组抗体阳转率及阴转率有明显差异。该疫苗保护隐性感染效果似乎不理想。
研究表明，某些灭活疫苗可能存在的潜在危险就是抗体依赖的免疫增强反应即ADE，灭活疫苗免疫个体后，由于其抗体水平较低，在其再次接触野病毒攻击时，会产生更强的ADE。登革热病毒抗体的ADE在1977年发现，由病毒颗粒和相应的IgG抗体形成病毒-抗体复合物，通过IgG Fc段吸附到细胞上导致感染增强作用，在血清抗体稀释度高时观察到增强作用，此时血清已不表现中和作用，登革病毒的ADE现象在体外和体内均可见[11，12]。有关HFRS病毒ADE现象在实验室似乎存在，姚楚铮等[4]证实，小鼠在HFRS病毒感染前，注入抗病毒血清，实验组小鼠其发病和死亡时间均早于对照组小鼠。且姚楚铮等[5]进一步研究发现同一种免疫血清，在低浓度时导致感染小鼠的早死和病死率增加，而输入较高浓度的免疫血清却出现保护作用。Yao等[6]用人或鼠的巨噬细胞系，无论是对HTN或SEO病毒，无论是用HFRS的单克隆或多克隆抗体，均可产生ADE。在我们大规模现场效果考核中，经过4年对观察对象随访，未发现接种组发生临床病例[3]。
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本研究表明：HFRSⅠ型灭活疫苗接种组和对照组抗体阳转率及阴转率无显著性差异，也未见HFRSⅠ型灭活疫苗增强隐性感染发生。
作者简介：阮玉华(1965-)，男，江苏省丹阳市人，中国预防医学科学院流行病学与卫生统计学博士后研究人员，流行病学博士，从事疫苗及相关生物制品临床试验和卫生经济学评价、传染病预防和控制策略研究。
参考文献：
[1]金洛济，俞春爱，金永门，等.朝鲜人民民主主义共和国对肾综合征出血热的特异性预防[J].中华实验和临床病毒学杂志，1991，5(4)：487-492.
[2]陈化新，罗兆庄，张家驹，等.肾综合征出血热疫苗预防效果和免疫策略研究[J].中国公共卫生杂志，1999，15(7)：561-568.
[3]阮玉华，徐校平，翁寿清，等.建德市肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗随机对照现场试验[J].中国公共卫生杂志，1999，15(7)：574-576.
, 百拇医药
[4]姚楚铮，黄莉莉，张满新，等.肾综合征出血热病毒感染小鼠的抗体介导早死现象[J].中华微生物学和免疫学杂志，1994，14(1)：16-18.
[5]姚楚铮，黄莉莉.肾综合征出血热病毒感染小鼠的抗体介导早死的进一步研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1995，15(5)：301-303.
[6]Yao JS, kariwa H, Takashima I, et al. Antibody-dependent enhancement of hantavirus infection in macrophage cell lines. Arch Virol, 1992, 122: 107-118.
[7]王庆奎，吴杨生，单良中，等.人群肾综合征出血热隐性感染后抗体维持时间研究[J].中国媒介生物学及控制杂志，1997，8(6)：457-458.
, 百拇医药
[8]阮玉华，徐校平，邵守坤，等.建德市肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗试验现场对照组人群隐性感染定群研究[J].中国公共卫生学报，1999，18(4)：193-195.
[9]李永良，徐志一，叶克龙，等.肾综合征出血热血清流行病学定群研究[J].中华预防医学杂志，1991，5(6)：329-331.
[10]Li YL, Ruo SY, Tong Z, et al. Serotypic study of hemorrhagic fever with renal syndrome in rural China[J]. Am J Trop Med Hyg, 1995, 52(3): 247-251.
[11]Halstead SB. Pathogenesis of dengue:Challenges to molecular biology[J]. Science, 1988, 239: 476-481.
[12]Kliks S C, Nisalak A, Brandt W E, et al. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever[J]. Am J Trop Med Hyg, 1989, 40: 444-451.
收稿日期：1999-11-15, 百拇医药
单位：阮玉华(中国预防医学科学院，北京 100050)；柳炜 徐校平 翁寿清 周卫群(建德市卫生防疫站，浙江 建德 311600)；邓新清 顾惠心 徐志一(复旦大学医学院流行病学教研室，上海 200032)；朱智勇(浙江省卫生防疫站，杭州 310009)
关键词：肾综合征出血热；灭活疫苗；隐性感染；免疫增强反应
中国计划免疫000406 摘要：为比较肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗接种组和对照组免疫后4年的抗体水平，1997年11月～1998年7月在浙江省建德市肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗随机对照试验现场，分别采集接种组和对照组双份血清295人和268人，检测血清中间接荧光抗体。按血清间接荧光抗体阳性或阴性来比较接种组和对照组的抗体水平，均未见接种组和对照组有显著差异。接种组同对照组免疫后4年抗体水平无显著性差异，未见肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗增强接种人群发生隐性感染。
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中图分类号：R512.8 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)04-0208-03
A Comparative Study on Antibody Levels of Vaccinated Group with Controlled Group Immunized with Type I Inactivated Vaccine against Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome
RUAN Yu-hua LIU Wei XU Xiao-ping et al.
(Chinese Academy of Preventive Medicine, Center of EPI, Beijing 100050, China)
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Abstract: A comparative study on antibody levels of the vaccinated group with the controlled group was carried out in a randomized controlled field trial using type I inactivated vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Jiande county and the enhancement of subclinical infection by the vaccine was also surveyed. The paired sera from 295 vaccinated persons and 268 controlled persons who joined the field trial (Aug. 1994) in Jiande county were collected before immunization and four years later (Nov. 1997～July 1998). The anti-HFRS antibody was detected by indirect immuno-fluorescent assay(IFA). The results showed that by comparing HFRS antibody positive rates of the first sera of vaccinated group with that of the controlled group, there was no significant difference, the negative seroconversion rates were found the same in the two groups 4 years after immunization. There was no enhancement of subclinical infection found in vaccinated group.
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Key words: Hemorrhagic fever with renal syndrome; Inactivated vaccine; Subclinical infection; Antibody dependence enhancement
我国研制生产的肾综合征出血热(HFRS)Ⅰ型和Ⅱ型灭活疫苗已进行了大规模现场效果评价，在疫苗的安全性、近期和中期免疫学和保护发病效果方面均获得较为满意的结果，尤其是免疫后中和抗体(PRNT)水平高于国外同类疫苗[1～3]。但疫苗免疫后其抗体变化情况及保护感染效果如何仍不甚清楚。同时，资料表明，在实验动物和细胞培养研究中，HFRS病毒具有抗体依赖的免疫增强反应，即免疫病理反应(Antibody dependence-enhancement，ADE)[4～6]。为此，本研究在HFRSⅠ型灭活疫苗效果评价现场，采用定群血清流行病学研究方法对接种组和对照组抗体变化情况进行比较，试图对该疫苗保护感染效果进行研究，并探讨HFRSⅠ型灭活疫苗是否具有抗体依赖免疫增强反应。
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材料与方法
1 疫苗 上海生物制品研究所提供的沙鼠肾细胞HFRSⅠ型灭活疫苗(Z10株)，由β-丙内脂灭活，疫苗批号931001。
2 研究对象与接种方式 以建德市39个历年本病高发村15～60岁常住人口为观察对象，接种前将试点村的全部家庭随机编号，以单号家庭为接种组，双号为对照组。第1针于1994年8月上旬接种，基础3针按0、7、28天接种，1年后加强免疫1针。在建德市列入试验的自然村中，随机抽取12个村，按每个村人口数的比例，在15～60周岁的人群内，分别于1997年11月和1998年7月，随机采集双份血清563人(接种组295人和对照组268人)。
3 血清抗体检测方法 间接免疫荧光试验(IFA)用于检测血清中HFRS IgG抗体，抗原片(Z10)和抗人IgG荧光抗体由浙江省卫生防疫站提供，于日本Nikon公司生产的落射式荧光显微镜下观察，以血清稀释度1∶20为阳性。1997年和1998年系列血清为同批检测。
, 百拇医药
4 统计分析 采用Foxbase+建立数据库，统计分析采用SPSS 7.5和EPI info软件包。
结 果
1 1997年11月～1998年7月接种组和对照组年龄、性别构成
对1997年11月～1998年7月接种组和对照组采集双份血清的563人进行分析。接种组和对照组男女性别构成无显著性差异(χ2＝0.04，P＝0.8399)。接种组和对照组年龄构成无显著性差异(χ2＝6.00，P＝0.115)。接种组295份免疫前血清抗体阳性38人，对照组268份血清免疫前抗体阳性24人，两组抗体阳性率无显著性差异(χ2＝2.20，P＝0.1376)(附表)。
附表 接种组和对照组年龄、性别构成(1997.11～1998.7) 年龄组
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(岁)
对照组
接种组
男
女
合计
男
女
合计
15～
14
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23
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12
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25～
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合计
114
154
268
123
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172
295
2 1997年11月～1998年7月接种组和对照组血清抗体阳性情况
接种组与对照组1998年血清抗体阴转率与阳转率均无差别(χ2＝0.08，P＝0.7748；χ2＝0.26，P＝0.6090)(附图)。
附图 接种组与对照组1997年、1998年系列血清IFA检测结果
讨 论
建德市HFRS发病率在70年代基本稳定于20/10万左右，自1981年起逐年上升，至1987年达140/10万，为历史高峰，然后又逐渐下降，至1994年降为25/10万左右。HFRS病例主要集中于20～59岁成人，平均发病年龄主要稳定于32～36岁，男性发病高于女性，疫区型别Ⅰ∶Ⅱ长期稳定于2.4∶1。
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隐性感染后抗体阴转较快，阴转率较高。在人群HFRS隐性感染后抗体变化研究中，阴转率达40%左右，隐性感染后可见部分抗体水平上升，隐性感染者均未出现过明显的HFRS临床症状[7，8]。李永良[9，10]也发现，157名隐性感染者经过1年的随访，22人抗体转阴，而随访的20名EHF病人无一人抗体转阴。虽然隐性感染后存在较高的抗体阴转率，但迄今未见有隐性感染后发生HFRS临床病例的报道，推测隐性感染后可能已获得较强的免疫力，能够保护发病。
在大规模疫苗效果现场考核中，我们证实了该疫苗安全、具有较好的免疫原性与保护发病效果。但该疫苗能否保护感染，本文对接种组与对照组的血清抗体阳性率及阴转率进行了分析。为了剔除IFA的系统误差和观察者的经验对结果判断的偏移，对1997年、1998年系列血清进行了同批检测，均未见接种组和对照组抗体阳转率及阴转率有明显差异。该疫苗保护隐性感染效果似乎不理想。
研究表明，某些灭活疫苗可能存在的潜在危险就是抗体依赖的免疫增强反应即ADE，灭活疫苗免疫个体后，由于其抗体水平较低，在其再次接触野病毒攻击时，会产生更强的ADE。登革热病毒抗体的ADE在1977年发现，由病毒颗粒和相应的IgG抗体形成病毒-抗体复合物，通过IgG Fc段吸附到细胞上导致感染增强作用，在血清抗体稀释度高时观察到增强作用，此时血清已不表现中和作用，登革病毒的ADE现象在体外和体内均可见[11，12]。有关HFRS病毒ADE现象在实验室似乎存在，姚楚铮等[4]证实，小鼠在HFRS病毒感染前，注入抗病毒血清，实验组小鼠其发病和死亡时间均早于对照组小鼠。且姚楚铮等[5]进一步研究发现同一种免疫血清，在低浓度时导致感染小鼠的早死和病死率增加，而输入较高浓度的免疫血清却出现保护作用。Yao等[6]用人或鼠的巨噬细胞系，无论是对HTN或SEO病毒，无论是用HFRS的单克隆或多克隆抗体，均可产生ADE。在我们大规模现场效果考核中，经过4年对观察对象随访，未发现接种组发生临床病例[3]。
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本研究表明：HFRSⅠ型灭活疫苗接种组和对照组抗体阳转率及阴转率无显著性差异，也未见HFRSⅠ型灭活疫苗增强隐性感染发生。
作者简介：阮玉华(1965-)，男，江苏省丹阳市人，中国预防医学科学院流行病学与卫生统计学博士后研究人员，流行病学博士，从事疫苗及相关生物制品临床试验和卫生经济学评价、传染病预防和控制策略研究。
参考文献：
[1]金洛济，俞春爱，金永门，等.朝鲜人民民主主义共和国对肾综合征出血热的特异性预防[J].中华实验和临床病毒学杂志，1991，5(4)：487-492.
[2]陈化新，罗兆庄，张家驹，等.肾综合征出血热疫苗预防效果和免疫策略研究[J].中国公共卫生杂志，1999，15(7)：561-568.
[3]阮玉华，徐校平，翁寿清，等.建德市肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗随机对照现场试验[J].中国公共卫生杂志，1999，15(7)：574-576.
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[4]姚楚铮，黄莉莉，张满新，等.肾综合征出血热病毒感染小鼠的抗体介导早死现象[J].中华微生物学和免疫学杂志，1994，14(1)：16-18.
[5]姚楚铮，黄莉莉.肾综合征出血热病毒感染小鼠的抗体介导早死的进一步研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1995，15(5)：301-303.
[6]Yao JS, kariwa H, Takashima I, et al. Antibody-dependent enhancement of hantavirus infection in macrophage cell lines. Arch Virol, 1992, 122: 107-118.
[7]王庆奎，吴杨生，单良中，等.人群肾综合征出血热隐性感染后抗体维持时间研究[J].中国媒介生物学及控制杂志，1997，8(6)：457-458.
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[8]阮玉华，徐校平，邵守坤，等.建德市肾综合征出血热Ⅰ型灭活疫苗试验现场对照组人群隐性感染定群研究[J].中国公共卫生学报，1999，18(4)：193-195.
[9]李永良，徐志一，叶克龙，等.肾综合征出血热血清流行病学定群研究[J].中华预防医学杂志，1991，5(6)：329-331.
[10]Li YL, Ruo SY, Tong Z, et al. Serotypic study of hemorrhagic fever with renal syndrome in rural China[J]. Am J Trop Med Hyg, 1995, 52(3): 247-251.
[11]Halstead SB. Pathogenesis of dengue:Challenges to molecular biology[J]. Science, 1988, 239: 476-481.
[12]Kliks S C, Nisalak A, Brandt W E, et al. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever[J]. Am J Trop Med Hyg, 1989, 40: 444-451.
收稿日期：1999-11-15, 百拇医药