中国人群中一个新的HLA-DRB4等位基因(DRB4.NC)的发现及比较分析
作者：朱乃硕 杨毅 李勇 陈诗书 于善谦
单位：朱乃硕(复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)；杨毅(复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)；李勇(复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)；陈诗书(上海第二医科大学生化及分子生物学实验室，上海200025)；于善谦(复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)
关键词：HLA；DRB4.NC；等位基因多态性；DNA序列分析
中国免疫学杂志000317 摘 要 目的：对人群进行HLA-DRB的分型及多态性研究，发现未曾报道过的HLA-DRB等位基因。方法：用HLA-DRB通用引物扩增该个体所有DRB等位基因的第二外显子，并对扩增产物进行克隆，通过双脱氧法进行DNA测序。结果：发现一个新的HLA-DRB核苷酸序列。结论：通过与已发表的序列及Genbank已收载的序列比较，显示该序列属于HLA-DRB4家族的新等位基因，我们暂时称它为DRB4.NC。该序列已被Genbank收载(登录号为AF207548)。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392.13
A new factor of HLA class Ⅱ DRB4 alleles in a Chinese individual
ZHU Nai-Shuo YANG Yi LI Yong et al.
(Laboratory of Virology & Immunology,School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433)
Abstract Objective:To study on HLA-DRB typing and polymorphism and find new HLA-DRB allele.Methods:The second exon of all the DRB alleles were amplified by using the HLA-DRB generic primers.The PCR products were cloned and sequenced by dideoxy method.Results:A new nucleotide sequence that was highly homologous with HLA-DRB4 alleles was found.Conclusion:Through sequence comparing it was sure that the sequece is a novel HLA-DRB4 allele.It was named DRB4.NC temporarily to mean the new allele was identified in a Chinese individual.The information of this sequence can be retrieved from the Genbank and its accession number is AF207548.
, 百拇医药
Key words：HLA DRB4.NC Allele polymorphism DNA sequenceing
HLA Ⅱ 类抗原具有高度多态性，在抗原递呈和免疫应答调控及个体免疫功能差异性等方面具有重要意义，尤其在调控抗原递呈细胞(APC)激活的T细胞活化的程度和特异性中起着重要作用。Ⅱ 类抗原是α/β链异二聚体构成的穿膜蛋白，这两条链由6号染色体上的HLA-D区上的基因群编码[1]。含有3个经典的亚区域，即DQ、DR、DP。在DR亚区中，现已发现有10个HLA基因座紧密连锁，其中DRA只有一个基因座，它的产物编码α链，至今只发现有两个等位基因。DRB基因座编码β链。HLA-DRB1编码DR主要型别特异性。DRB3、DRB4、DRB5各自编码超型DR52、DR53、DR51。而HLA-DRB2等其它座位是假基因。
DRB等位基因是HLA基因系统中最复杂的一类，通过序列测定，已经有超过180种等位基因被确认并在因特网上公布(其中DRB1占绝大多数)，新的基因型还在不断发现之中。HLA-DRB等位基因含有6个外显子，它们的DNA序列的多态性主要存在于第二外显子中，这一段DNA序列对应于β1结构域的氨基酸序列，HLA-DRB第二外显子具有高度的多态性[2]，DR型和亚型差异主要取决于第二外显子。因此，通常主要通过对第二外显子的序列分析来进行基因分型或鉴定一个新的等位基因。
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我们在对人群的HLA-DRB等位基因多态性及其与疾病相关性的研究中，发现了一个新的等位基因，我们对该基因进行了克隆测序，确认该基因序列与以往已发表的序列均不一致。经同源性比较认为是一个新的DRB4等位基因，我们暂时称之为DRB4*NC。
1 材料与方法
1.1 HLA-DRB等位基因扩增 抽提基因组DNA，用第11届国际组织相容性会议推荐的DRB基因的通用引物序列，扩增DRB等位基因的第二外显子。上游引物DRA：5′ATG GGA TCC CCA CAG CAC GTT TCT TG，下游引物DRB：5′ATG GAA TTC CGC TGC ACT GTG AAG CTC TC，为了方便克隆两引物中分别设计成含有EcoRI和BamHI序列。基因扩增方法参见文献[3，4]进行。
1.2 目的基因克隆 用EcoRI和BamHI酶切纯化后的PCR产物，将其与同样双酶切过的M13mp18复制型DNA载体相连接。将连接产物转入大肠杆菌JM101中，在含有IPTG和X-gal的平板上培养，筛选含插入片段的白色噬菌斑。方法参见文献[3]。
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1.3 制备单链噬菌体DNA 在37℃培养4 h，12 000 g离心后，收集上清，加入适量PEG8000，再以12 000 g离心。回收沉淀，溶于TE中，用酚-氯仿法抽提去除蛋白后，用乙醇沉淀DNA，干燥后溶解于TE备用。
1.4 用双脱氧法测序 参见文献[5]。
2 结果
2.1 测序结果 通过对PCR产物的克隆，测序，我们证实发现了一个新的核苷酸序列(图1)。
图1 8个DRB4等位基因和DRB4*NC第二外显子的核苷酸序列
Fig.1 Alignment of the second exon of novel allele DRB4*。NC nucleartide sequence and 8 DRB4 allelesNC nucleartide sequence and 8 DRB4 alleles
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Note:The genbank accession number of DRB4*NC is AF207548.In the sequence alignments,for each locus alleles have been aligned to DRB4。01011 and identity between residues is indicated by a hyphen(-).Unavailable sequence information is indicated by and asterisk(。)。Minimum gaps in the sequence,indicated by a period(.)are inserted to maintain the alignment between alleles showing variation in length.The primer sequence used to amplify DRB4*NC is indicated by comma(,).The exon intron boundaries are indicated by a pipe(｜).
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2.2 计算机同源性分析 我们把该DNA序列和网上已公布的序列进行同源性比较(使用GCG软件包)，所得到的序列大都属于HLA-DRB等位基因，且得分最高的几个序列都是DRB4基因。如和属于DRB4的M20555序列的同源性高达95%。现在因特网上已公布了8个DRB4等位基因，这8个DRB4基因第二外显子的序列极其相似。通过比较，我们发现新基因序列和DRB4类基因的外显子2的序列高度同源，并且具有DRB4基因的特征性序列，即从第9个密码子到第30个密码子，这一段序列和其它DRB基因的相应序列有很大的差异，但在我们的新基因和所有8个DRB4基因中完全一致(见图1)。因此，我们认为该新基因序列是DRB4座位上的一个新的等位基因。
2.3 数据库登录 我们向Genbank申请新发现的等位基因序列，已获接受。该序列的Genbank的登录号为AF207548。
3 讨论
有两点特殊情况应引起我们的兴趣。第一：已发现的8个DRB4基因外显子2显示了高度的一致性，只有DRB4*0102和DRB4*0104及DRB4*0105各有1个碱基的置换，而新基因从37到60密码子中，有10个不连续的碱基和已发现的DRB4基因有差异，这一段序列在DRB1*09012中存在完全对应；第二：DRB等位基因的第86位密码子具有二态性，一般是GGT或GTG，分别对应缬氨酸(Valine)和甘氨酸(Glycine)残基，这个位点被认为位于形成抗原结合部位的α-helix一头，对抗原递呈具有重要的影响[6，7]，在已发现的8个DRB4等位基因中，这个密码子都是GTG，而新基因中为GGT，从这两处序列的差异，我们认为该等位基因的起源有些特殊，可能与相似等位基因同源重组有关。
, 百拇医药
HLA系统具有高度的多态性，已确定的等位基因总数达500多个，在不同的地域和种族的人群中，HLA的分布有着差异性，这意味着还有很多HLA等位基因未被发现。现已知的HLA等位基因大多数是从白种人群(Caucasian)中发现的。我们中国人群的DNA序列资源所知甚少。我国有着广阔的地域，丰富的民族资源和众多的人口资源，蕴藏着极其丰富的遗传资源，包括HLA资源，这是我们研究的优势。加强这方面系统的开发和研究将对器官移植，免疫应答多样性的分子机制，自身免疫性疾病及HLA相关疾病研究，个体鉴定等多方面都有重要意义。随着国际上人类基因组计划(HGP)的发展，我们觉得单纯点上的发现，已不能跟上国际上发展的趋势。随着研究范围的扩展，新的基因将不断被发现，而HLA基因分型技术、测序技术、计算机数据库管理分析技术的快速发展，为HLA的研究提供了越来越多的便利和高度的可靠性。因此，我们准备组建一个HLA配型系统，通过建立一套完整的、通用的技术，能够对人群展开大规模的HLA基因分型，为进一步的科学研究和临床应用打下基础。
作者简介：朱乃硕，男，博士，免疫学及分子生物学副教授，主要研究免
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疫活化和免疫耐受诱导的分子机制
参考文献：
[1]Bodmer J G,Marsh S G E,Albert E et al.Nomenclature for factors of the HLA system 1998.Tissue Antigens,1999;53：407
[2]Marsh S G E.HLA Class Ⅱ region sequences,1998.Tissue antigens，1998;51:467
[3]朱乃硕，王亚新，陈诗书.中国正常人及类风湿关节炎病人MHC-Ⅱ类DR4亚型基因核苷酸序列初步分析.中国免疫学杂志，1994；10(2)：93
[4]朱乃硕，王亚新，王福庆 et al.中国人群HLA-DR4等位基因结构及其与类风湿关节炎相关性研究.中华医学杂志，1994；74(7)：428
, 百拇医药
[5]Sambrook J.Molecular cloning.2 nd ed.New Yark: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:13.42-13.74
[6]Ong B,Willcox N,Wordsworth P et al. Critical role for the Val/Gly86 HLA-DRB dimorphism in autoantigen presentation to human T cell.Proc Nat Acad Sci USA, 1991;88:7343
[7]Busch R,Hill C M,Hayball J D et al. Effects of natural polymorphism at residue 86 of the HLA-DRB chain on peptide binding.J Immunol,1991;147:1292
收稿日期：2000-01-06
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单位：朱乃硕(复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)；杨毅(复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)；李勇(复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)；陈诗书(上海第二医科大学生化及分子生物学实验室，上海200025)；于善谦(复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)
关键词：HLA；DRB4.NC；等位基因多态性；DNA序列分析
中国免疫学杂志000317 摘 要 目的：对人群进行HLA-DRB的分型及多态性研究，发现未曾报道过的HLA-DRB等位基因。方法：用HLA-DRB通用引物扩增该个体所有DRB等位基因的第二外显子，并对扩增产物进行克隆，通过双脱氧法进行DNA测序。结果：发现一个新的HLA-DRB核苷酸序列。结论：通过与已发表的序列及Genbank已收载的序列比较，显示该序列属于HLA-DRB4家族的新等位基因，我们暂时称它为DRB4.NC。该序列已被Genbank收载(登录号为AF207548)。
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中国图书分类号 R392.13
A new factor of HLA class Ⅱ DRB4 alleles in a Chinese individual
ZHU Nai-Shuo YANG Yi LI Yong et al.
(Laboratory of Virology & Immunology,School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433)
Abstract Objective:To study on HLA-DRB typing and polymorphism and find new HLA-DRB allele.Methods:The second exon of all the DRB alleles were amplified by using the HLA-DRB generic primers.The PCR products were cloned and sequenced by dideoxy method.Results:A new nucleotide sequence that was highly homologous with HLA-DRB4 alleles was found.Conclusion:Through sequence comparing it was sure that the sequece is a novel HLA-DRB4 allele.It was named DRB4.NC temporarily to mean the new allele was identified in a Chinese individual.The information of this sequence can be retrieved from the Genbank and its accession number is AF207548.
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Key words：HLA DRB4.NC Allele polymorphism DNA sequenceing
HLA Ⅱ 类抗原具有高度多态性，在抗原递呈和免疫应答调控及个体免疫功能差异性等方面具有重要意义，尤其在调控抗原递呈细胞(APC)激活的T细胞活化的程度和特异性中起着重要作用。Ⅱ 类抗原是α/β链异二聚体构成的穿膜蛋白，这两条链由6号染色体上的HLA-D区上的基因群编码[1]。含有3个经典的亚区域，即DQ、DR、DP。在DR亚区中，现已发现有10个HLA基因座紧密连锁，其中DRA只有一个基因座，它的产物编码α链，至今只发现有两个等位基因。DRB基因座编码β链。HLA-DRB1编码DR主要型别特异性。DRB3、DRB4、DRB5各自编码超型DR52、DR53、DR51。而HLA-DRB2等其它座位是假基因。
DRB等位基因是HLA基因系统中最复杂的一类，通过序列测定，已经有超过180种等位基因被确认并在因特网上公布(其中DRB1占绝大多数)，新的基因型还在不断发现之中。HLA-DRB等位基因含有6个外显子，它们的DNA序列的多态性主要存在于第二外显子中，这一段DNA序列对应于β1结构域的氨基酸序列，HLA-DRB第二外显子具有高度的多态性[2]，DR型和亚型差异主要取决于第二外显子。因此，通常主要通过对第二外显子的序列分析来进行基因分型或鉴定一个新的等位基因。
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我们在对人群的HLA-DRB等位基因多态性及其与疾病相关性的研究中，发现了一个新的等位基因，我们对该基因进行了克隆测序，确认该基因序列与以往已发表的序列均不一致。经同源性比较认为是一个新的DRB4等位基因，我们暂时称之为DRB4*NC。
1 材料与方法
1.1 HLA-DRB等位基因扩增 抽提基因组DNA，用第11届国际组织相容性会议推荐的DRB基因的通用引物序列，扩增DRB等位基因的第二外显子。上游引物DRA：5′ATG GGA TCC CCA CAG CAC GTT TCT TG，下游引物DRB：5′ATG GAA TTC CGC TGC ACT GTG AAG CTC TC，为了方便克隆两引物中分别设计成含有EcoRI和BamHI序列。基因扩增方法参见文献[3，4]进行。
1.2 目的基因克隆 用EcoRI和BamHI酶切纯化后的PCR产物，将其与同样双酶切过的M13mp18复制型DNA载体相连接。将连接产物转入大肠杆菌JM101中，在含有IPTG和X-gal的平板上培养，筛选含插入片段的白色噬菌斑。方法参见文献[3]。
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1.3 制备单链噬菌体DNA 在37℃培养4 h，12 000 g离心后，收集上清，加入适量PEG8000，再以12 000 g离心。回收沉淀，溶于TE中，用酚-氯仿法抽提去除蛋白后，用乙醇沉淀DNA，干燥后溶解于TE备用。
1.4 用双脱氧法测序 参见文献[5]。
2 结果
2.1 测序结果 通过对PCR产物的克隆，测序，我们证实发现了一个新的核苷酸序列(图1)。
图1 8个DRB4等位基因和DRB4*NC第二外显子的核苷酸序列
Fig.1 Alignment of the second exon of novel allele DRB4*。NC nucleartide sequence and 8 DRB4 allelesNC nucleartide sequence and 8 DRB4 alleles
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Note:The genbank accession number of DRB4*NC is AF207548.In the sequence alignments,for each locus alleles have been aligned to DRB4。01011 and identity between residues is indicated by a hyphen(-).Unavailable sequence information is indicated by and asterisk(。)。Minimum gaps in the sequence,indicated by a period(.)are inserted to maintain the alignment between alleles showing variation in length.The primer sequence used to amplify DRB4*NC is indicated by comma(,).The exon intron boundaries are indicated by a pipe(｜).
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2.2 计算机同源性分析 我们把该DNA序列和网上已公布的序列进行同源性比较(使用GCG软件包)，所得到的序列大都属于HLA-DRB等位基因，且得分最高的几个序列都是DRB4基因。如和属于DRB4的M20555序列的同源性高达95%。现在因特网上已公布了8个DRB4等位基因，这8个DRB4基因第二外显子的序列极其相似。通过比较，我们发现新基因序列和DRB4类基因的外显子2的序列高度同源，并且具有DRB4基因的特征性序列，即从第9个密码子到第30个密码子，这一段序列和其它DRB基因的相应序列有很大的差异，但在我们的新基因和所有8个DRB4基因中完全一致(见图1)。因此，我们认为该新基因序列是DRB4座位上的一个新的等位基因。
2.3 数据库登录 我们向Genbank申请新发现的等位基因序列，已获接受。该序列的Genbank的登录号为AF207548。
3 讨论
有两点特殊情况应引起我们的兴趣。第一：已发现的8个DRB4基因外显子2显示了高度的一致性，只有DRB4*0102和DRB4*0104及DRB4*0105各有1个碱基的置换，而新基因从37到60密码子中，有10个不连续的碱基和已发现的DRB4基因有差异，这一段序列在DRB1*09012中存在完全对应；第二：DRB等位基因的第86位密码子具有二态性，一般是GGT或GTG，分别对应缬氨酸(Valine)和甘氨酸(Glycine)残基，这个位点被认为位于形成抗原结合部位的α-helix一头，对抗原递呈具有重要的影响[6，7]，在已发现的8个DRB4等位基因中，这个密码子都是GTG，而新基因中为GGT，从这两处序列的差异，我们认为该等位基因的起源有些特殊，可能与相似等位基因同源重组有关。
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HLA系统具有高度的多态性，已确定的等位基因总数达500多个，在不同的地域和种族的人群中，HLA的分布有着差异性，这意味着还有很多HLA等位基因未被发现。现已知的HLA等位基因大多数是从白种人群(Caucasian)中发现的。我们中国人群的DNA序列资源所知甚少。我国有着广阔的地域，丰富的民族资源和众多的人口资源，蕴藏着极其丰富的遗传资源，包括HLA资源，这是我们研究的优势。加强这方面系统的开发和研究将对器官移植，免疫应答多样性的分子机制，自身免疫性疾病及HLA相关疾病研究，个体鉴定等多方面都有重要意义。随着国际上人类基因组计划(HGP)的发展，我们觉得单纯点上的发现，已不能跟上国际上发展的趋势。随着研究范围的扩展，新的基因将不断被发现，而HLA基因分型技术、测序技术、计算机数据库管理分析技术的快速发展，为HLA的研究提供了越来越多的便利和高度的可靠性。因此，我们准备组建一个HLA配型系统，通过建立一套完整的、通用的技术，能够对人群展开大规模的HLA基因分型，为进一步的科学研究和临床应用打下基础。
作者简介：朱乃硕，男，博士，免疫学及分子生物学副教授，主要研究免
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疫活化和免疫耐受诱导的分子机制
参考文献：
[1]Bodmer J G,Marsh S G E,Albert E et al.Nomenclature for factors of the HLA system 1998.Tissue Antigens,1999;53：407
[2]Marsh S G E.HLA Class Ⅱ region sequences,1998.Tissue antigens，1998;51:467
[3]朱乃硕，王亚新，陈诗书.中国正常人及类风湿关节炎病人MHC-Ⅱ类DR4亚型基因核苷酸序列初步分析.中国免疫学杂志，1994；10(2)：93
[4]朱乃硕，王亚新，王福庆 et al.中国人群HLA-DR4等位基因结构及其与类风湿关节炎相关性研究.中华医学杂志，1994；74(7)：428
, 百拇医药
[5]Sambrook J.Molecular cloning.2 nd ed.New Yark: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:13.42-13.74
[6]Ong B,Willcox N,Wordsworth P et al. Critical role for the Val/Gly86 HLA-DRB dimorphism in autoantigen presentation to human T cell.Proc Nat Acad Sci USA, 1991;88:7343
[7]Busch R,Hill C M,Hayball J D et al. Effects of natural polymorphism at residue 86 of the HLA-DRB chain on peptide binding.J Immunol,1991;147:1292
收稿日期：2000-01-06
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