用免疫滴金法检测结核病人抗LAM-B抗体的研究
作者：胡雷光 戴湘茹 叶宇冰 刘翳雯 任关仁
单位：胡雷光(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)；戴湘茹(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)；叶宇冰(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)；刘翳雯(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)；任关仁(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)
关键词：
中国免疫学杂志000316 中国图书分类号 R392-33
结核病诊断主要沿用50余年来常规方法，灵敏度低，报告缓慢，误、漏诊率高。本文参照Hunter S W的提纯方法[1]，从结核杆菌菌壁中提纯脂阿拉伯甘露糖-B(LAM-B)抗原，并与免疫滴金法(DIGFA)相结合，研制成一种方便快捷、灵敏度及准确性均可靠的结核病特殊血清学诊断方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 所有试剂除酶(RNase A & DNase I)为Sigma产品外，其余均为国产AR级试剂。
1.2 方法
1.2.1 提纯LAM-B抗原和组建测定方法 收集培养结核杆菌(H37Rv)。参照文献[1]，用氯仿/甲醇(1∶1)杀死结核菌，经氯仿/甲醇(2∶1)50℃振荡脱脂干燥重溶水后超声粉碎，再经50%乙醇回流水解，干燥后用0.02 mol/L Tris。HCl(含1mmol/L MgCl2、0.02%NaN3及RNase A和DNase I各1 mg) 37℃消化过夜，苯酚2次提纯，水相合并，经氯仿/甲醇(2∶1)洗涤，通过0.01 mol/L Tris。HCl pH7.4〔含1% TritonX-100平衡的DEAE-Sephacel(Cl-)柱〕，并取0～1 mol/L NaCl的此缓冲液梯度洗脱，收集后洗脱峰，其中的TritonX-100用氯仿/甲醇(2∶1)洗涤去除，用0.01 mol/L Tris。HCl透析后，冷冻干燥，可得到纯化的LAM-B。
, 百拇医药
将抗原定量地包被固定于NC膜上，制成反应塑料小盒。另制胶体金抗人IgG溶液、稀释液和洗涤液。将血清用稀释液1∶100稀释后，加100 μl于反应膜上，洗涤2次，加胶体金抗体100 μl，再洗涤3次，稍后即可观察结果，出现明显的紫红色的斑点为阳性，无斑点和只显痕迹则为阴性。
1.2.2 病人的选择 本院肺科病人和上海市闵行区结核病防治院(所)病人，临床诊断为结核病96例(活动性49例，非活动性47例)，非结核病48例及医院职工和血库献血员共计158例健康人员。
2 结果
2.1 重复性试验及比较试验 标本经批内、批间试验，重复性100%。用141份患者血清，进行本法与MycoDotTM(结明)试剂盒对照试验，卡方统计P=0.3965>0.05，无显著性差异。
2.2 临床对照试验 见表1。
, 百拇医药
表1 本法的临床对照结果
Tab.1 Clinical analysis result of this method
Cases
Positive
Sensitivity
Specificity
Tubercular patients
96
70
72.92%
Active
, 百拇医药
49
44
89.80%
Inactive
47
26
55.32%
AFB(+)
35
33
94.28%
AFB(-)
38
, http://www.100md.com
15
39.48%
Culture(+)
19
17
89.48%
Culture(-)
17
7
41.18%
Non-tubercular patients
48
, http://www.100md.com 6
12.50%
Healthy persons
158
0
0.00%
97.09%
3 讨论
Hunter S W等用麻风菌的糖脂作为一种新抗原用于麻风特殊血清学诊断[1]，以后发现结核杆菌菌壁也含有25%～40%与其相同的LAM，其中LAM-B为该菌主要免疫原，病人感染后可发生免疫反应[2]。本文参照Hunter S W建立了一套相对简便的LAM-B纯化方法，研制成一种快捷的结核病DIGFA诊断试剂，经临床302例标本试验，其敏感性为72.92%，特异性为97.09%，接近国内外文献报道[3，4]。本法的灵敏度标化在一定的限量，可使活动期结核病人呈阳性反应，而11例感染过结核菌但未发病的非活动期结核随访病人和16例接种过卡介苗的健康志愿者则可呈阴性反应，尽管麻风杆菌感染可呈假阳性反应，但根据患者的临床表现可以鉴别诊断。
, http://www.100md.com
作者简介：胡雷光, 男,36岁, 主管技师，主要从事临床免疫检验研究
参考文献：
[1]Hunter S W, Gaylord H, Brennan P J. Structure and antigenicity of the phosphorylated lipopolysaccharide antigens from the leprosy and tubercule bacilli. J Biol Chem， 1986;261:12345
[2]Brennan P. Structure of mycobacteria: recent developments in defining cell wall carbohydrates and proteins. Rev Infect Dis，1989;S2:420
, 百拇医药 [3]Sada E, Brennan P J, Herrera T et al. Evaluation of lipoarabinomannan for the serological diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol， 1990;28(12):2587
[4]王玉柱,顾国忠,刘熙颖 et al. 快速酶联免疫吸附法检测血清脂阿拉伯甘露糖-IgG对肺结核的诊断意义. 北京医科大学学报， 1997;29(6):533
收稿日期：1999-06-20
修改日期：1999-11-01, 百拇医药
单位：胡雷光(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)；戴湘茹(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)；叶宇冰(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)；刘翳雯(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)；任关仁(上海市第六人民医院临床免疫室,上海200233)
关键词：
中国免疫学杂志000316 中国图书分类号 R392-33
结核病诊断主要沿用50余年来常规方法，灵敏度低，报告缓慢，误、漏诊率高。本文参照Hunter S W的提纯方法[1]，从结核杆菌菌壁中提纯脂阿拉伯甘露糖-B(LAM-B)抗原，并与免疫滴金法(DIGFA)相结合，研制成一种方便快捷、灵敏度及准确性均可靠的结核病特殊血清学诊断方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 所有试剂除酶(RNase A & DNase I)为Sigma产品外，其余均为国产AR级试剂。
1.2 方法
1.2.1 提纯LAM-B抗原和组建测定方法 收集培养结核杆菌(H37Rv)。参照文献[1]，用氯仿/甲醇(1∶1)杀死结核菌，经氯仿/甲醇(2∶1)50℃振荡脱脂干燥重溶水后超声粉碎，再经50%乙醇回流水解，干燥后用0.02 mol/L Tris。HCl(含1mmol/L MgCl2、0.02%NaN3及RNase A和DNase I各1 mg) 37℃消化过夜，苯酚2次提纯，水相合并，经氯仿/甲醇(2∶1)洗涤，通过0.01 mol/L Tris。HCl pH7.4〔含1% TritonX-100平衡的DEAE-Sephacel(Cl-)柱〕，并取0～1 mol/L NaCl的此缓冲液梯度洗脱，收集后洗脱峰，其中的TritonX-100用氯仿/甲醇(2∶1)洗涤去除，用0.01 mol/L Tris。HCl透析后，冷冻干燥，可得到纯化的LAM-B。
, 百拇医药
将抗原定量地包被固定于NC膜上，制成反应塑料小盒。另制胶体金抗人IgG溶液、稀释液和洗涤液。将血清用稀释液1∶100稀释后，加100 μl于反应膜上，洗涤2次，加胶体金抗体100 μl，再洗涤3次，稍后即可观察结果，出现明显的紫红色的斑点为阳性，无斑点和只显痕迹则为阴性。
1.2.2 病人的选择 本院肺科病人和上海市闵行区结核病防治院(所)病人，临床诊断为结核病96例(活动性49例，非活动性47例)，非结核病48例及医院职工和血库献血员共计158例健康人员。
2 结果
2.1 重复性试验及比较试验 标本经批内、批间试验，重复性100%。用141份患者血清，进行本法与MycoDotTM(结明)试剂盒对照试验，卡方统计P=0.3965>0.05，无显著性差异。
2.2 临床对照试验 见表1。
, 百拇医药
表1 本法的临床对照结果
Tab.1 Clinical analysis result of this method
Cases
Positive
Sensitivity
Specificity
Tubercular patients
96
70
72.92%
Active
, 百拇医药
49
44
89.80%
Inactive
47
26
55.32%
AFB(+)
35
33
94.28%
AFB(-)
38
, http://www.100md.com
15
39.48%
Culture(+)
19
17
89.48%
Culture(-)
17
7
41.18%
Non-tubercular patients
48
, http://www.100md.com 6
12.50%
Healthy persons
158
0
0.00%
97.09%
3 讨论
Hunter S W等用麻风菌的糖脂作为一种新抗原用于麻风特殊血清学诊断[1]，以后发现结核杆菌菌壁也含有25%～40%与其相同的LAM，其中LAM-B为该菌主要免疫原，病人感染后可发生免疫反应[2]。本文参照Hunter S W建立了一套相对简便的LAM-B纯化方法，研制成一种快捷的结核病DIGFA诊断试剂，经临床302例标本试验，其敏感性为72.92%，特异性为97.09%，接近国内外文献报道[3，4]。本法的灵敏度标化在一定的限量，可使活动期结核病人呈阳性反应，而11例感染过结核菌但未发病的非活动期结核随访病人和16例接种过卡介苗的健康志愿者则可呈阴性反应，尽管麻风杆菌感染可呈假阳性反应，但根据患者的临床表现可以鉴别诊断。
, http://www.100md.com
作者简介：胡雷光, 男,36岁, 主管技师，主要从事临床免疫检验研究
参考文献：
[1]Hunter S W, Gaylord H, Brennan P J. Structure and antigenicity of the phosphorylated lipopolysaccharide antigens from the leprosy and tubercule bacilli. J Biol Chem， 1986;261:12345
[2]Brennan P. Structure of mycobacteria: recent developments in defining cell wall carbohydrates and proteins. Rev Infect Dis，1989;S2:420
, 百拇医药 [3]Sada E, Brennan P J, Herrera T et al. Evaluation of lipoarabinomannan for the serological diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol， 1990;28(12):2587
[4]王玉柱,顾国忠,刘熙颖 et al. 快速酶联免疫吸附法检测血清脂阿拉伯甘露糖-IgG对肺结核的诊断意义. 北京医科大学学报， 1997;29(6):533
收稿日期：1999-06-20
修改日期：1999-11-01, 百拇医药