抗人DAF单克隆抗体的制备及鉴定*
作者：邹 强 谢佩蓉 郑 萍&6'(0d;, 百拇医药
单位：第三军医大学免疫学教研室，中国人民解放军免疫学研究所 重庆 400038&6'(0d;, 百拇医药
关键词：DAF；CD55；单克隆抗体；杂交瘤&6'(0d;, 百拇医药
免疫学杂志990216 摘 要 以初步纯化的人红细胞膜DAF免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，成功地获得3株(DG3、DG9和DA11)抗人DAF单克隆抗体。经间接ELISA测定，3株杂交瘤细胞培养上清及腹水的抗体效价分别为10-3～10-4及10-6～10-7；3株单抗的重链为小鼠IgG1亚类，轻链为κ型。结合还原条件下的免疫印迹实验及3株单抗对DAF促衰变活性的抑制作用，推测DG9识别的抗原表位为SCR1，而DG3和DA11为SCR2至SCR4。&6'(0d;, 百拇医药
中图号 Q510.8 R371.21&6'(0d;, 百拇医药
PREPARATION AND IDENTIFICATION OF McAbs AGAINST HUMAN DECAY-ACCELERATING FACTOR&6'(0d;, 百拇医药
Zou Qiang，Xie Peirong，Zheng Ping&6'(0d;, 百拇医药
(Department of Immunology，The Third Militray Medical&6'(0d;, 百拇医药
University，Chongqing 400038)&6'(0d;, 百拇医药
Abstract Three monoclonal antibodies(McAbs)，designate DG3、DG9 and DA11，were prepared against human decay-accelerationg factor (DAF，CD55)by fusing myeloma cell line SP2/0 and Balb/c murine spleen cells which had been immunized by partly purified human DAF.The titers of specific antibody in culture supernatants and ascites fluid were 10-3～10-4and 10-6～10-7respectively by indirect ELISA.All of three McAbs were IgG1 kappa isotypes.Results from Western Blotting using reducing agent and the effects of McAbs on the decay-accelerating activity of DAF suggest DG9 reacts to SCR1 of DAF，while the epitope recognized by DG3 and DG9 reside within SCR2～4.
Key words DAF，CD55，Monoclonal antibodies，Hybridomas?jx, 百拇医药
衰变加速因子(Decay-acceletrating factor，DAF，CD55)是一种广泛分布在除NK细胞以外所有成熟的血细胞及血管内皮细胞膜上的GPI锚固蛋白，可抑制C3、C5转化酶的组装以及促进C3、C5转化酶的衰变[1]。作为体内重要的同源限制分子，DAF对于防止同源补体对自身组织细胞的溶破有重要意义，并参与机体多种病理生理过程，如肿瘤免疫、生殖免疫、微生物感染及夜间阵发性血红蛋白尿。另一方面，表达有人DAF分子的转基因猪则为防治异种器官移植中的超急性排斥反应展示了光明前景。因而抗人DAF单克隆抗体的研制，对于分离纯化DAF、研究DAF的结构与功能、以及与DAF相关的疾病均有重要意义。本文应用B淋巴细胞杂交瘤技术，制备了3株抗人DAF单克隆抗体，并对其特性进行了鉴定。?jx, 百拇医药
1 材料与方法?jx, 百拇医药
1.1 材料 SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，由本室传代保存。1640培养液为GIBCO公司产品。8～12周龄健康Balb/c纯系小鼠由重庆医科大学动物中心提供。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，购自中山生物制品有限公司。纯化的可溶性重组DAF由英国Reading大学Goodfellow博士惠赠。抗人DAF单克隆抗体IC6培养上清由日本Fukushima医学院Fujita博士惠赠。NC膜为浙江黄岩人民化工厂产品。96孔酶联板购自美国Corning公司；豚鼠血清功能纯C2由本室制备；豚鼠血清1∶30稀释于40mM EDTA-GVB(Cgp-EDTA)并作为C3～C9的来源。?jx, 百拇医药
1.2 人红细胞膜DAF的分离纯化 参照文献[2]，从健康人红细胞膜影中分离纯化具有促衰变加速活性的人红细胞膜DAF。?jx, 百拇医药
1.3 免疫动物 初步纯化的人红细胞膜DAF与等体积福氏完全佐剂充分乳化后，经腹股沟及腋下皮下多点接种Balb/c小鼠，每只小鼠约50μg；2周后以同样剂量的DAF加等量福氏不完全佐剂如上法再次免疫，以后每周重复1次，共进行2～3次。融合前3d，以相同剂量的DAF腹腔注射加强免疫。?jx, 百拇医药
1.4 细胞融合 取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞按本室常规方法[3]进行融合。
1.5 间接ELISA筛选及克隆化 融合后8～12d，待融合细胞生长到培养孔的1/4～1/3时，取上清用间接ELISA法进行筛选。包被用抗原为可溶性重组DAF，0.1μg/ml，50μl/孔。洗涤液为含0.05%Tween-20的PBS(PBS-T)，抗体稀释液为含2%绵羊血清的PBS-T。以SP2/0上清作为阴性对照，阳性对照为IC6培养上清。选择阳性孔用有限稀释法进行克隆化3～4次，直至抗体阳性率达100%后扩大培养。w@6?\*, http://www.100md.com
1.6 腹水制备及效价测定 按本室常规进行[4]，用间接ELISA法测定效价。w@6?\*, http://www.100md.com
1.7 McAb同种型测定 按Boehringer Mannh-eim公司小鼠单克隆抗体同种型检测试剂盒(Cat.No.1493 027)操作手册进行。w@6?\*, http://www.100md.com
1.8 染色体检查 参照文献[5]方法，秋水仙素处理对数生长期的杂交瘤细胞，经低渗处理后行常规Giemsa染色，计数分析。w@6?\*, http://www.100md.com
1.9 免疫印迹实验 按文献[6]方法制备人红细胞膜影。经还原剂DTT还原及未还原的人红细胞膜影行10%SDS-PAGE分离，参照文献[7]方法，转移至NC膜，相继用腹水(1∶1000)和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG反应，最后显色，以SP2/0腹水为阴性对照；阳性对照为IC6培养上清(1∶1)。w@6?\*, http://www.100md.com
1.10 单抗对DAF促衰变活性的影响 参照文献[8]方法，150μl结合人DAF的绵羊红细胞溶血中间体EDAFAClgp4bhu(1×108/ml)与不同稀释度的3株单抗腹水及SP2/0腹水37°C共同孵育20min，以中和绵羊红细胞表面的人DAF分子，继而加入豚鼠血清功能纯C2中，30°C孵育15min生成经典途径C3转化酶，最后加入150μl Cgp-EDTA 37°C孵育1h。离心后测定上清液OD415nm，计算各株单抗对DAF促衰变活性的抑制作用。w@6?\*, http://www.100md.com
2 结果w@6?\*, http://www.100md.com
2.1 单克隆抗体的制备 应用B淋巴细胞杂交瘤技术，进行3次细胞融合，平均融合率约95%。间接ELISA筛选所得阳性克隆孔进行有限稀释克隆化3～4次，直到两次亚克隆的阳性率均达到100%。最后获得3株杂交瘤细胞，分别命名为DG3、DG9和DA11。经体外连续培养半年及液氮反复冻融多次，分泌抗体水平未见下降。说明已是稳定分泌抗人DAF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.2 McAbs效价测定 将3株杂交瘤细胞的培养上清及腹水进行10倍逐级稀释，用间接ELISA法检测。从表1中可见，3株抗体中DG9的效价最高，其上清液及腹水的效价分别为1×10-4和1×10-7。DG3和DA11的效价均低1个数量级。8!*$;{, http://www.100md.com
表1 3株杂交瘤细胞培养上清液和小鼠腹水抗体效价8!*$;{, http://www.100md.com
Tab 1 Titer of McAbs in ascites fluid and culture supernatant McAbs8!*$;{, http://www.100md.com
Ascites8!*$;{, http://www.100md.com
Culture supernatant8!*$;{, http://www.100md.com
DG38!*$;{, http://www.100md.com
1×10-68!*$;{, http://www.100md.com
1×10-38!*$;{, http://www.100md.com
DG98!*$;{, http://www.100md.com
1×10-78!*$;{, http://www.100md.com
1×10-48!*$;{, http://www.100md.com
DA118!*$;{, http://www.100md.com
1×10-68!*$;{, http://www.100md.com
1×10-38!*$;{, http://www.100md.com
2.3 单抗同种型测定 采用BM公司同种型检测试剂盒进行间接乳胶凝集反应，结果3株单克隆抗体的重链均为小鼠IgG1亚类，轻链均为κ型。8!*$;{, http://www.100md.com
2.4 染色体分析 计数结果表明，3株杂交瘤细胞的染色体数目均在90～100间，接近脾细胞与骨髓瘤细胞染色体数的总和；杂交瘤细胞大多数为端着丝点染色体，偶可见中部着丝点染色体，符合小鼠杂交瘤细胞株的特点。8!*$;{, http://www.100md.com
2.5 免疫印迹试验 取3株单抗的腹水进行免疫印迹实验以鉴定各株单抗所针对的抗原成分。结果3株单抗均能与未还原的人红细胞膜蛋白中70kD的蛋白质形成单一染色条带，与人红细胞膜上DAF的分子量相符合，且与IC6上清的染色条带位于同一位置，证明这3株单抗是针对人DAF的特异性单克隆抗体(见图1)。它们及IC6上清均不能与经还原处理的人红细胞膜影发生结合，提示它们所识别的抗原表位均需DAF的分子内二硫键维持其空间结构(结果未显示)。
图 1 免疫印迹试验确定单抗的抗原特异性\1'u|, http://www.100md.com
Fig 1 Immunoblotting analysis of McAbs\1'u|, http://www.100md.com
1：Dalton Markers；2：IC6；3：SP2/0；4：DA11；5：DG9；6：DG3\1'u|, http://www.100md.com
2.6 McAb对DAF活性的抑制作用 为观察3株单抗所结合的抗原表位是否与DAF的促衰变活性部位有关，我们以DAF促进经典途径C3转化酶衰变为模型，观察了单抗对DAF促衰变活性的阻断作用，结果见图2。单抗中DG3及DA11均表现出抗体阻断活性，而DG9无此作用。
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图 2 3株单抗对DAF DA活性的抑制作用\1'u|, http://www.100md.com
Fig 2 Inhibitory effect of McAbs on the DA activity of DAF\1'u|, http://www.100md.com
3 讨 论\1'u|, http://www.100md.com
本文以初步纯化的人红细胞膜DAF免疫Balb/c小鼠，通过B淋巴细胞杂交瘤技术，成功地获得3株分泌抗人DAF单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为DG3、DG9和DA11。经鉴定，3株杂交瘤细胞的染色体数目及类型符合小鼠杂交瘤细胞株的特点；均能稳定高效地分泌抗人DAF单克隆抗体，其培养上清及腹水的效价分别为10-3～10-4及10-6～10-7；3株单抗的重链均属于小鼠IgG1亚类，轻链均为κ型。\1'u|, http://www.100md.com
人红细胞膜DAF是一个70kD的单链糖蛋白，由381个氨基酸组成。由基因序列推断，其分子结构中包含4个相互同源的短重复序列(short consensus repeat，SCR)。每个SCR约由56～70个氨基酸组成，其中4个半胱氨酸及1个色氨酸是恒定不变的。第1个与第3个半胱氨酸以及第2个与第4个半胱氨酸分别构成两个链内二硫键，形成SCR特有的折叠结构[1]。二硫键只存在于DAF分子的4个SCRs中，其余部份无半胱氨酸。本实验获得的3株单克隆抗体均不能与经DTT还原的人红细胞膜蛋白特异性结合，表明3株单抗所识别的抗原表位存在于4个SCRs中，同时提示DAF分子中的链内二硫键对于维持DAF的B细胞表位有重要作用。
DAF分子中的4个SCRs在结构上高度同源，但又各有其功能。Coyne[8]等通过缺失突变的方法制备包含不同SCRs的DAF变异体，通过研究它们对补体经典途径介导的CHO细胞溶破的保护作用，发现SCR1对于DAF的促衰变活性是非必需的；而SCR2、3、4则是必需的。Brobdeck则在另一组实验中发现[9]：DAF对经典途径C3转化酶的调控活性部位位于SCR2、SCR3；而对替代途径的调控活性部位位于SCR2、SCR3及SCR4。两组不同实验结果的原因尚无法确定。本实验中，DG9对DAF的经典途径促衰活性无明显抑制作用，DG3和DA11则表现出抑制作用，因而推测DG9识别的抗原表位位于SCR1；而DG3和DA11所识别的表位可能位于SCR2～4。准确的定位尚有待进一步的研究。|!dnoms, http://www.100md.com
3株针对人DAF不同抗原表位以及具有不同功能活性的单克隆抗体的制备成功，为进一步研究DAF的结构和功能，以及DAF在相关疾病中的作用奠定了基础。|!dnoms, http://www.100md.com
* 国家自然科学基金(39500031)和军队“九五”医药卫生基金资肋项目|!dnoms, http://www.100md.com
作者简介 第一作者：男，28岁，博士|!dnoms, http://www.100md.com
参考文献|!dnoms, http://www.100md.com
1 Nicholson WA，Wang CE.Structure and function of decay accelerating factor CD55.J Lab Clin Med，1994，123：485|!dnoms, http://www.100md.com
2 Sugita Y，Negoro T，Matsuda T，et al.Improved method for the isolation and preliminary characterization of human DAF(decay-accelerating factor).J Biochem Tokyo，1986，100：143|!dnoms, http://www.100md.com
3 谢佩蓉，王雪峰，陈云亮，等.分泌抗人C1q单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立.免疫学杂志，1985，1(2)：1|!dnoms, http://www.100md.com
4 谢佩蓉，王雪峰，郑 萍，等.抗人B因子单克隆抗体制备及其特性的初步研究.免疫学杂志，1988，4(1)：13|!dnoms, http://www.100md.com
5 厉广坤.实用人类染色体技术与临床.重庆：西南师范大学出版社，1994.44|!dnoms, http://www.100md.com
6 Fairbanks G，Steck TL，Wallach DF.Electrophoretic Analysis of the Major Polypeptieds of the Human Erythrocyte Membrane.Biochemistry，1971，10：2606|!dnoms, http://www.100md.com
7 Bjerrum OJ，Heegaard NHH.CRC Handbook of Immunoblotting of Proteins——Technical Description.New York：CRC Press Inc，1988.1|!dnoms, http://www.100md.com
8 Coyne KE，Hall SE，Thompson S，et al.Mapping of epitopes，glycosylation sites，and complement regulatory domains in human decay accelerating factor.J Immunol，1992，149：2906|!dnoms, http://www.100md.com
9 Brodbeck WG，Liu D，Sperry J，et al.Localization of classical and alternative pathway regulatory activity within the decay-accelerating factor.J Immunol，1996，156：2528|!dnoms, http://www.100md.com
(1998-09-07收稿，1999-01-28修回)(邹 强 谢佩蓉 郑 萍)
单位：第三军医大学免疫学教研室，中国人民解放军免疫学研究所 重庆 400038&6'(0d;, 百拇医药
关键词：DAF；CD55；单克隆抗体；杂交瘤&6'(0d;, 百拇医药
免疫学杂志990216 摘 要 以初步纯化的人红细胞膜DAF免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，成功地获得3株(DG3、DG9和DA11)抗人DAF单克隆抗体。经间接ELISA测定，3株杂交瘤细胞培养上清及腹水的抗体效价分别为10-3～10-4及10-6～10-7；3株单抗的重链为小鼠IgG1亚类，轻链为κ型。结合还原条件下的免疫印迹实验及3株单抗对DAF促衰变活性的抑制作用，推测DG9识别的抗原表位为SCR1，而DG3和DA11为SCR2至SCR4。&6'(0d;, 百拇医药
中图号 Q510.8 R371.21&6'(0d;, 百拇医药
PREPARATION AND IDENTIFICATION OF McAbs AGAINST HUMAN DECAY-ACCELERATING FACTOR&6'(0d;, 百拇医药
Zou Qiang，Xie Peirong，Zheng Ping&6'(0d;, 百拇医药
(Department of Immunology，The Third Militray Medical&6'(0d;, 百拇医药
University，Chongqing 400038)&6'(0d;, 百拇医药
Abstract Three monoclonal antibodies(McAbs)，designate DG3、DG9 and DA11，were prepared against human decay-accelerationg factor (DAF，CD55)by fusing myeloma cell line SP2/0 and Balb/c murine spleen cells which had been immunized by partly purified human DAF.The titers of specific antibody in culture supernatants and ascites fluid were 10-3～10-4and 10-6～10-7respectively by indirect ELISA.All of three McAbs were IgG1 kappa isotypes.Results from Western Blotting using reducing agent and the effects of McAbs on the decay-accelerating activity of DAF suggest DG9 reacts to SCR1 of DAF，while the epitope recognized by DG3 and DG9 reside within SCR2～4.
Key words DAF，CD55，Monoclonal antibodies，Hybridomas?jx, 百拇医药
衰变加速因子(Decay-acceletrating factor，DAF，CD55)是一种广泛分布在除NK细胞以外所有成熟的血细胞及血管内皮细胞膜上的GPI锚固蛋白，可抑制C3、C5转化酶的组装以及促进C3、C5转化酶的衰变[1]。作为体内重要的同源限制分子，DAF对于防止同源补体对自身组织细胞的溶破有重要意义，并参与机体多种病理生理过程，如肿瘤免疫、生殖免疫、微生物感染及夜间阵发性血红蛋白尿。另一方面，表达有人DAF分子的转基因猪则为防治异种器官移植中的超急性排斥反应展示了光明前景。因而抗人DAF单克隆抗体的研制，对于分离纯化DAF、研究DAF的结构与功能、以及与DAF相关的疾病均有重要意义。本文应用B淋巴细胞杂交瘤技术，制备了3株抗人DAF单克隆抗体，并对其特性进行了鉴定。?jx, 百拇医药
1 材料与方法?jx, 百拇医药
1.1 材料 SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，由本室传代保存。1640培养液为GIBCO公司产品。8～12周龄健康Balb/c纯系小鼠由重庆医科大学动物中心提供。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，购自中山生物制品有限公司。纯化的可溶性重组DAF由英国Reading大学Goodfellow博士惠赠。抗人DAF单克隆抗体IC6培养上清由日本Fukushima医学院Fujita博士惠赠。NC膜为浙江黄岩人民化工厂产品。96孔酶联板购自美国Corning公司；豚鼠血清功能纯C2由本室制备；豚鼠血清1∶30稀释于40mM EDTA-GVB(Cgp-EDTA)并作为C3～C9的来源。?jx, 百拇医药
1.2 人红细胞膜DAF的分离纯化 参照文献[2]，从健康人红细胞膜影中分离纯化具有促衰变加速活性的人红细胞膜DAF。?jx, 百拇医药
1.3 免疫动物 初步纯化的人红细胞膜DAF与等体积福氏完全佐剂充分乳化后，经腹股沟及腋下皮下多点接种Balb/c小鼠，每只小鼠约50μg；2周后以同样剂量的DAF加等量福氏不完全佐剂如上法再次免疫，以后每周重复1次，共进行2～3次。融合前3d，以相同剂量的DAF腹腔注射加强免疫。?jx, 百拇医药
1.4 细胞融合 取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞按本室常规方法[3]进行融合。
1.5 间接ELISA筛选及克隆化 融合后8～12d，待融合细胞生长到培养孔的1/4～1/3时，取上清用间接ELISA法进行筛选。包被用抗原为可溶性重组DAF，0.1μg/ml，50μl/孔。洗涤液为含0.05%Tween-20的PBS(PBS-T)，抗体稀释液为含2%绵羊血清的PBS-T。以SP2/0上清作为阴性对照，阳性对照为IC6培养上清。选择阳性孔用有限稀释法进行克隆化3～4次，直至抗体阳性率达100%后扩大培养。w@6?\*, http://www.100md.com
1.6 腹水制备及效价测定 按本室常规进行[4]，用间接ELISA法测定效价。w@6?\*, http://www.100md.com
1.7 McAb同种型测定 按Boehringer Mannh-eim公司小鼠单克隆抗体同种型检测试剂盒(Cat.No.1493 027)操作手册进行。w@6?\*, http://www.100md.com
1.8 染色体检查 参照文献[5]方法，秋水仙素处理对数生长期的杂交瘤细胞，经低渗处理后行常规Giemsa染色，计数分析。w@6?\*, http://www.100md.com
1.9 免疫印迹实验 按文献[6]方法制备人红细胞膜影。经还原剂DTT还原及未还原的人红细胞膜影行10%SDS-PAGE分离，参照文献[7]方法，转移至NC膜，相继用腹水(1∶1000)和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG反应，最后显色，以SP2/0腹水为阴性对照；阳性对照为IC6培养上清(1∶1)。w@6?\*, http://www.100md.com
1.10 单抗对DAF促衰变活性的影响 参照文献[8]方法，150μl结合人DAF的绵羊红细胞溶血中间体EDAFAClgp4bhu(1×108/ml)与不同稀释度的3株单抗腹水及SP2/0腹水37°C共同孵育20min，以中和绵羊红细胞表面的人DAF分子，继而加入豚鼠血清功能纯C2中，30°C孵育15min生成经典途径C3转化酶，最后加入150μl Cgp-EDTA 37°C孵育1h。离心后测定上清液OD415nm，计算各株单抗对DAF促衰变活性的抑制作用。w@6?\*, http://www.100md.com
2 结果w@6?\*, http://www.100md.com
2.1 单克隆抗体的制备 应用B淋巴细胞杂交瘤技术，进行3次细胞融合，平均融合率约95%。间接ELISA筛选所得阳性克隆孔进行有限稀释克隆化3～4次，直到两次亚克隆的阳性率均达到100%。最后获得3株杂交瘤细胞，分别命名为DG3、DG9和DA11。经体外连续培养半年及液氮反复冻融多次，分泌抗体水平未见下降。说明已是稳定分泌抗人DAF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.2 McAbs效价测定 将3株杂交瘤细胞的培养上清及腹水进行10倍逐级稀释，用间接ELISA法检测。从表1中可见，3株抗体中DG9的效价最高，其上清液及腹水的效价分别为1×10-4和1×10-7。DG3和DA11的效价均低1个数量级。8!*$;{, http://www.100md.com
表1 3株杂交瘤细胞培养上清液和小鼠腹水抗体效价8!*$;{, http://www.100md.com
Tab 1 Titer of McAbs in ascites fluid and culture supernatant McAbs8!*$;{, http://www.100md.com
Ascites8!*$;{, http://www.100md.com
Culture supernatant8!*$;{, http://www.100md.com
DG38!*$;{, http://www.100md.com
1×10-68!*$;{, http://www.100md.com
1×10-38!*$;{, http://www.100md.com
DG98!*$;{, http://www.100md.com
1×10-78!*$;{, http://www.100md.com
1×10-48!*$;{, http://www.100md.com
DA118!*$;{, http://www.100md.com
1×10-68!*$;{, http://www.100md.com
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2.3 单抗同种型测定 采用BM公司同种型检测试剂盒进行间接乳胶凝集反应，结果3株单克隆抗体的重链均为小鼠IgG1亚类，轻链均为κ型。8!*$;{, http://www.100md.com
2.4 染色体分析 计数结果表明，3株杂交瘤细胞的染色体数目均在90～100间，接近脾细胞与骨髓瘤细胞染色体数的总和；杂交瘤细胞大多数为端着丝点染色体，偶可见中部着丝点染色体，符合小鼠杂交瘤细胞株的特点。8!*$;{, http://www.100md.com
2.5 免疫印迹试验 取3株单抗的腹水进行免疫印迹实验以鉴定各株单抗所针对的抗原成分。结果3株单抗均能与未还原的人红细胞膜蛋白中70kD的蛋白质形成单一染色条带，与人红细胞膜上DAF的分子量相符合，且与IC6上清的染色条带位于同一位置，证明这3株单抗是针对人DAF的特异性单克隆抗体(见图1)。它们及IC6上清均不能与经还原处理的人红细胞膜影发生结合，提示它们所识别的抗原表位均需DAF的分子内二硫键维持其空间结构(结果未显示)。
图 1 免疫印迹试验确定单抗的抗原特异性\1'u|, http://www.100md.com
Fig 1 Immunoblotting analysis of McAbs\1'u|, http://www.100md.com
1：Dalton Markers；2：IC6；3：SP2/0；4：DA11；5：DG9；6：DG3\1'u|, http://www.100md.com
2.6 McAb对DAF活性的抑制作用 为观察3株单抗所结合的抗原表位是否与DAF的促衰变活性部位有关，我们以DAF促进经典途径C3转化酶衰变为模型，观察了单抗对DAF促衰变活性的阻断作用，结果见图2。单抗中DG3及DA11均表现出抗体阻断活性，而DG9无此作用。
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Fig 2 Inhibitory effect of McAbs on the DA activity of DAF\1'u|, http://www.100md.com
3 讨 论\1'u|, http://www.100md.com
本文以初步纯化的人红细胞膜DAF免疫Balb/c小鼠，通过B淋巴细胞杂交瘤技术，成功地获得3株分泌抗人DAF单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为DG3、DG9和DA11。经鉴定，3株杂交瘤细胞的染色体数目及类型符合小鼠杂交瘤细胞株的特点；均能稳定高效地分泌抗人DAF单克隆抗体，其培养上清及腹水的效价分别为10-3～10-4及10-6～10-7；3株单抗的重链均属于小鼠IgG1亚类，轻链均为κ型。\1'u|, http://www.100md.com
人红细胞膜DAF是一个70kD的单链糖蛋白，由381个氨基酸组成。由基因序列推断，其分子结构中包含4个相互同源的短重复序列(short consensus repeat，SCR)。每个SCR约由56～70个氨基酸组成，其中4个半胱氨酸及1个色氨酸是恒定不变的。第1个与第3个半胱氨酸以及第2个与第4个半胱氨酸分别构成两个链内二硫键，形成SCR特有的折叠结构[1]。二硫键只存在于DAF分子的4个SCRs中，其余部份无半胱氨酸。本实验获得的3株单克隆抗体均不能与经DTT还原的人红细胞膜蛋白特异性结合，表明3株单抗所识别的抗原表位存在于4个SCRs中，同时提示DAF分子中的链内二硫键对于维持DAF的B细胞表位有重要作用。
DAF分子中的4个SCRs在结构上高度同源，但又各有其功能。Coyne[8]等通过缺失突变的方法制备包含不同SCRs的DAF变异体，通过研究它们对补体经典途径介导的CHO细胞溶破的保护作用，发现SCR1对于DAF的促衰变活性是非必需的；而SCR2、3、4则是必需的。Brobdeck则在另一组实验中发现[9]：DAF对经典途径C3转化酶的调控活性部位位于SCR2、SCR3；而对替代途径的调控活性部位位于SCR2、SCR3及SCR4。两组不同实验结果的原因尚无法确定。本实验中，DG9对DAF的经典途径促衰活性无明显抑制作用，DG3和DA11则表现出抑制作用，因而推测DG9识别的抗原表位位于SCR1；而DG3和DA11所识别的表位可能位于SCR2～4。准确的定位尚有待进一步的研究。|!dnoms, http://www.100md.com
3株针对人DAF不同抗原表位以及具有不同功能活性的单克隆抗体的制备成功，为进一步研究DAF的结构和功能，以及DAF在相关疾病中的作用奠定了基础。|!dnoms, http://www.100md.com
* 国家自然科学基金(39500031)和军队“九五”医药卫生基金资肋项目|!dnoms, http://www.100md.com
作者简介 第一作者：男，28岁，博士|!dnoms, http://www.100md.com
参考文献|!dnoms, http://www.100md.com
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8 Coyne KE，Hall SE，Thompson S，et al.Mapping of epitopes，glycosylation sites，and complement regulatory domains in human decay accelerating factor.J Immunol，1992，149：2906|!dnoms, http://www.100md.com
9 Brodbeck WG，Liu D，Sperry J，et al.Localization of classical and alternative pathway regulatory activity within the decay-accelerating factor.J Immunol，1996，156：2528|!dnoms, http://www.100md.com
(1998-09-07收稿，1999-01-28修回)(邹 强 谢佩蓉 郑 萍)