人IL-11特异性引物RT-PCR产物分析*
作者：常雅萍 于永利k*wm, 百拇医药
单位：白求恩医科大学免疫学教研室 长春 130021k*wm, 百拇医药
关键词：IL-11 RT-PCR DNA序列分析k*wm, 百拇医药
免疫学杂志990207摘 要 提取人骨髓细胞mRNA，应用人IL-11特异性引物进行RT-PCR。将全部RT-PCR产物以TA克隆的方式克隆人pCRTMⅡ质粒。转化INV αF′细菌后得到了多个区带。DNA序列分析的结果表明，插入片段是IL-11特异性引物的不同形式的连接物；其产生的机理有待进一步阐明。k*wm, 百拇医药
中图号 R392.11k*wm, 百拇医药
ANALYSIS OF RT-PCR PRODUCTS PRIMED BYk*wm, 百拇医药
HUMAN IL-11 SPECIFIC PRIMERSk*wm, 百拇医药
Chang Yaping，Yu Yonglik*wm, 百拇医药
(Department of Immunology，Norman Bethune University ofk*wm, 百拇医药
Medical Sciences，Changchun 130021)k*wm, 百拇医药
Abstract cDNAs copied from human bone marrow cell′s total mRNAs were amplified in a RT-PCR primed with human IL-11 specific primers.RT-PCR products were cloned into pCRTMⅡ plasmids ，and then transformed into INVαF host bacteria.The mechnism remains to be elucidated .The sequencing results indicated that the inserts in different kinds of clones were the various products of connected human IL-11 specific primers.
Key words Interleukin-11，RT-PCR，DNA sequencingtf[u, 百拇医药
IL-11具有广泛的生物活性[1]。它与IL-1，IL-6，G-CSF及SCF具有相似的功能，尤其与IL-3，IL-4，SCF等协同对造血细胞增殖具有促进作用。我们在以RT-PCR分离人IL-11 cDNA过程中，观察到了少见的特异性引物相互联结的现象。tf[u, 百拇医药
1 材料与方法tf[u, 百拇医药
1.1 RT-PCR法钓取人IL-11基因片段tf[u, 百拇医药
1.1.1 骨髓细胞mRNA提取：取人骨髓细胞(白求恩医科大学一院提供)1m1，用DEPC处理水配置的PBS洗涤细胞一次，每3×106个细胞中加入裂解液800μl，混匀后加酚-氯仿-异丙醇(25∶24∶1)800μl，pH7.0乙酸钠70μl，混匀，置冰水中15min，于4°C离心10 000r/min 15min。移出水相加入等体积异丙醇，室温放10min，离心同上。重悬RNA于裂解液中，溶解后加等体积异丙醇，离心同上，沉淀用75%乙醇洗一遍，自然干燥约30min，每管加8μl DEPC处理水溶解。tf[u, 百拇医药
1.1.2 RT-PCR[2]：采用AMV-RT(10u/ml)，Sigma产品，将mRNA逆转录成cDNA，取逆转录后的cDNA进行PCR，人IL-11特异性引物：(上游-5′TGCGTCGACATGAACTGTGTTTGCCGC-3′，下游-5′ATGAAGCTTTGGAAGGACGGTGGTGGC-3′)由美国旧金山医学院合成。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，取分子量与理想片段相应之PCR产物，回收后采用GENE clean试剂盒(美国BI0101公司)纯化。tf[u, 百拇医药
1.2 TA克隆[3]tf[u, 百拇医药
1.2.1 连接反应：取纯化后PCR产物5μl加入2μl pCRTMⅡ(美国Invitrogen公司出品，25mg/μl)质粒，10×连接酶缓冲液1μl，T4连接酶1μl(4u/μl)，置0.5ml Eppendorf管中，室温放12～16h。tf[u, 百拇医药
1.2.2 转化：将连接产物转化宿主菌INVαF′(Invitrogen)，取数个白色菌落扩大培养，以碱裂解法分别提取质料DNA。EcoRI酶切后可见分子量不同的片段，选择近20个分子量相当的克隆进行双链DNA测序。
1.3 双链DNA测序[3]5q9e, 百拇医药
以重组质粒为模板，采用sp6引物(5′GATTTAGGTGACACTATAG3′)和T7引物(5′TAATACGACTCACTATAGGG3′)进行双链DNA测序。5q9e, 百拇医药
2 结果5q9e, 百拇医药
对建立的20余个克隆的插入片段进行DNA测序分析，结果表明：这些插入片段均非要分离的IL-11编码的cDNA，而是IL-11特异性引物以不同形式连接而成的产物，在有的引物连接部位，尚有一些无关序列的出现。现列举几种引物的连接形式，见图1。
5q9e, 百拇医药
图 1 克隆PCR产物的双链DNA测序5q9e, 百拇医药
Fig 1 Double stranded DNA sequencing of cloned PCR products5q9e, 百拇医药
图1-A中可见上游引物5′-3′与下游引物5′-3′互补序列的重复。序列为：GAATTCGGCTTTGCGTCGACATGAACTGTGCTTTGCCGCCACCACCGTCCTTCCAAAGCTTCATATCGACATGAACTGTGTTTGC5q9e, 百拇医药
CGCCACCACCGTCCTTCCAAAGTGCGTCGACATGAACTGTGT……图1-B中可见上游引物5′-3′互补序列与下5q9e, 百拇医药
游引物5′-3′的重复。序列为GAATTCGGCTTCAAACACAGTTCATGTCGACGCATTGGAAGGACGGTGGTGGCGGCAAACACAGTTCATGTCGATATGAAGCTT5q9e, 百拇医药
TGGAAGGACGGTGGTGGCGGCAAACAC……图1C中可见下游引物5′-3′与上游引物5′-3′互补序列的重复。序列为：GAATTCGGCTTGACTATGAAGCCTTTGGAAGGACGGTGGCGGCAAACACAGTTCATGTCGACGCAAAGGACGGTGGTGGCGGCAA
ACACAGTTC……图1D中可见下游引物5′-3′互补序列与上游引物5′-3′序列的重复。序列为：GAATTCGGCTTGCACCACCGTCCTTCCAAAGCTTCATAGTCGACATGAACTGTGTTTGCCGCCACCGTCCTTCCAATGCGTCGACk^#4, 百拇医药
ATGAACTGTG……在所测结果中，除上述例举的几种有规律性的结果外，尚可见引物序列后出现一些非特异的无关序列。图略。k^#4, 百拇医药
3 讨论k^#4, 百拇医药
上述列举的DNA测序结果可以看出，所测的插入片段是由IL-11特异性引物以不同形式连接而成的。此种现象的形成机制可能很复杂。我们分析认为，是否与引物序列中有首尾相似的碱基有关。如图1-A与-D的结果显示，上游5′-3′末端的GC又是下游引物5′-3′互补序列的起始，导致两引物的连接；而图1-B与C的结果显示，下游引物5′-3′末端的GGC又是上游引物5′-3′互补序列的起始，而导致了两引物的连接。当然产生这种现象的更深入的机理还有待进一步探讨。k^#4, 百拇医药
近年来PCR法为建立基因克隆提供了便捷手段，然而PCR可能出现各种意想不到的结果，我室前期工作亦发现了类似问题。故对PCR产物进行DNA序列分析十分关键。尤其在以PCR作为疾病诊断时，更应重视假阳性问题的出现。即使扩增产物与预想片断大小相符时，亦不能忽视假阳性结果存在的可能性。k^#4, 百拇医药
* 受国家教委跨世纪优秀人才基金及香港求是基金资助(教技厅1995 4号)k^#4, 百拇医药
作者简介 第一作者：女，49岁，硕士，副教授k^#4, 百拇医药
参考文献k^#4, 百拇医药
1 金伯泉.细胞和分子免疫学，西安：世界图书出版公司，1995.115k^#4, 百拇医药
2 于永利，杨贵贞.以cRNA为内在参照物测定人支气管肺泡洗出液细胞TNFRNA的含量.中国免疫学杂志，1992，8(2)：100k^#4, 百拇医药
3 于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)：5k^#4, 百拇医药
(1998-06-23收稿；1998-09-29修回)(常雅萍 于永利)
单位：白求恩医科大学免疫学教研室 长春 130021k*wm, 百拇医药
关键词：IL-11 RT-PCR DNA序列分析k*wm, 百拇医药
免疫学杂志990207摘 要 提取人骨髓细胞mRNA，应用人IL-11特异性引物进行RT-PCR。将全部RT-PCR产物以TA克隆的方式克隆人pCRTMⅡ质粒。转化INV αF′细菌后得到了多个区带。DNA序列分析的结果表明，插入片段是IL-11特异性引物的不同形式的连接物；其产生的机理有待进一步阐明。k*wm, 百拇医药
中图号 R392.11k*wm, 百拇医药
ANALYSIS OF RT-PCR PRODUCTS PRIMED BYk*wm, 百拇医药
HUMAN IL-11 SPECIFIC PRIMERSk*wm, 百拇医药
Chang Yaping，Yu Yonglik*wm, 百拇医药
(Department of Immunology，Norman Bethune University ofk*wm, 百拇医药
Medical Sciences，Changchun 130021)k*wm, 百拇医药
Abstract cDNAs copied from human bone marrow cell′s total mRNAs were amplified in a RT-PCR primed with human IL-11 specific primers.RT-PCR products were cloned into pCRTMⅡ plasmids ，and then transformed into INVαF host bacteria.The mechnism remains to be elucidated .The sequencing results indicated that the inserts in different kinds of clones were the various products of connected human IL-11 specific primers.
Key words Interleukin-11，RT-PCR，DNA sequencingtf[u, 百拇医药
IL-11具有广泛的生物活性[1]。它与IL-1，IL-6，G-CSF及SCF具有相似的功能，尤其与IL-3，IL-4，SCF等协同对造血细胞增殖具有促进作用。我们在以RT-PCR分离人IL-11 cDNA过程中，观察到了少见的特异性引物相互联结的现象。tf[u, 百拇医药
1 材料与方法tf[u, 百拇医药
1.1 RT-PCR法钓取人IL-11基因片段tf[u, 百拇医药
1.1.1 骨髓细胞mRNA提取：取人骨髓细胞(白求恩医科大学一院提供)1m1，用DEPC处理水配置的PBS洗涤细胞一次，每3×106个细胞中加入裂解液800μl，混匀后加酚-氯仿-异丙醇(25∶24∶1)800μl，pH7.0乙酸钠70μl，混匀，置冰水中15min，于4°C离心10 000r/min 15min。移出水相加入等体积异丙醇，室温放10min，离心同上。重悬RNA于裂解液中，溶解后加等体积异丙醇，离心同上，沉淀用75%乙醇洗一遍，自然干燥约30min，每管加8μl DEPC处理水溶解。tf[u, 百拇医药
1.1.2 RT-PCR[2]：采用AMV-RT(10u/ml)，Sigma产品，将mRNA逆转录成cDNA，取逆转录后的cDNA进行PCR，人IL-11特异性引物：(上游-5′TGCGTCGACATGAACTGTGTTTGCCGC-3′，下游-5′ATGAAGCTTTGGAAGGACGGTGGTGGC-3′)由美国旧金山医学院合成。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，取分子量与理想片段相应之PCR产物，回收后采用GENE clean试剂盒(美国BI0101公司)纯化。tf[u, 百拇医药
1.2 TA克隆[3]tf[u, 百拇医药
1.2.1 连接反应：取纯化后PCR产物5μl加入2μl pCRTMⅡ(美国Invitrogen公司出品，25mg/μl)质粒，10×连接酶缓冲液1μl，T4连接酶1μl(4u/μl)，置0.5ml Eppendorf管中，室温放12～16h。tf[u, 百拇医药
1.2.2 转化：将连接产物转化宿主菌INVαF′(Invitrogen)，取数个白色菌落扩大培养，以碱裂解法分别提取质料DNA。EcoRI酶切后可见分子量不同的片段，选择近20个分子量相当的克隆进行双链DNA测序。
1.3 双链DNA测序[3]5q9e, 百拇医药
以重组质粒为模板，采用sp6引物(5′GATTTAGGTGACACTATAG3′)和T7引物(5′TAATACGACTCACTATAGGG3′)进行双链DNA测序。5q9e, 百拇医药
2 结果5q9e, 百拇医药
对建立的20余个克隆的插入片段进行DNA测序分析，结果表明：这些插入片段均非要分离的IL-11编码的cDNA，而是IL-11特异性引物以不同形式连接而成的产物，在有的引物连接部位，尚有一些无关序列的出现。现列举几种引物的连接形式，见图1。
5q9e, 百拇医药图 1 克隆PCR产物的双链DNA测序5q9e, 百拇医药
Fig 1 Double stranded DNA sequencing of cloned PCR products5q9e, 百拇医药
图1-A中可见上游引物5′-3′与下游引物5′-3′互补序列的重复。序列为：GAATTCGGCTTTGCGTCGACATGAACTGTGCTTTGCCGCCACCACCGTCCTTCCAAAGCTTCATATCGACATGAACTGTGTTTGC5q9e, 百拇医药
CGCCACCACCGTCCTTCCAAAGTGCGTCGACATGAACTGTGT……图1-B中可见上游引物5′-3′互补序列与下5q9e, 百拇医药
游引物5′-3′的重复。序列为GAATTCGGCTTCAAACACAGTTCATGTCGACGCATTGGAAGGACGGTGGTGGCGGCAAACACAGTTCATGTCGATATGAAGCTT5q9e, 百拇医药
TGGAAGGACGGTGGTGGCGGCAAACAC……图1C中可见下游引物5′-3′与上游引物5′-3′互补序列的重复。序列为：GAATTCGGCTTGACTATGAAGCCTTTGGAAGGACGGTGGCGGCAAACACAGTTCATGTCGACGCAAAGGACGGTGGTGGCGGCAA
ACACAGTTC……图1D中可见下游引物5′-3′互补序列与上游引物5′-3′序列的重复。序列为：GAATTCGGCTTGCACCACCGTCCTTCCAAAGCTTCATAGTCGACATGAACTGTGTTTGCCGCCACCGTCCTTCCAATGCGTCGACk^#4, 百拇医药
ATGAACTGTG……在所测结果中，除上述例举的几种有规律性的结果外，尚可见引物序列后出现一些非特异的无关序列。图略。k^#4, 百拇医药
3 讨论k^#4, 百拇医药
上述列举的DNA测序结果可以看出，所测的插入片段是由IL-11特异性引物以不同形式连接而成的。此种现象的形成机制可能很复杂。我们分析认为，是否与引物序列中有首尾相似的碱基有关。如图1-A与-D的结果显示，上游5′-3′末端的GC又是下游引物5′-3′互补序列的起始，导致两引物的连接；而图1-B与C的结果显示，下游引物5′-3′末端的GGC又是上游引物5′-3′互补序列的起始，而导致了两引物的连接。当然产生这种现象的更深入的机理还有待进一步探讨。k^#4, 百拇医药
近年来PCR法为建立基因克隆提供了便捷手段，然而PCR可能出现各种意想不到的结果，我室前期工作亦发现了类似问题。故对PCR产物进行DNA序列分析十分关键。尤其在以PCR作为疾病诊断时，更应重视假阳性问题的出现。即使扩增产物与预想片断大小相符时，亦不能忽视假阳性结果存在的可能性。k^#4, 百拇医药
* 受国家教委跨世纪优秀人才基金及香港求是基金资助(教技厅1995 4号)k^#4, 百拇医药
作者简介 第一作者：女，49岁，硕士，副教授k^#4, 百拇医药
参考文献k^#4, 百拇医药
1 金伯泉.细胞和分子免疫学，西安：世界图书出版公司，1995.115k^#4, 百拇医药
2 于永利，杨贵贞.以cRNA为内在参照物测定人支气管肺泡洗出液细胞TNFRNA的含量.中国免疫学杂志，1992，8(2)：100k^#4, 百拇医药
3 于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)：5k^#4, 百拇医药
(1998-06-23收稿；1998-09-29修回)(常雅萍 于永利)