肛门生殖器区肿瘤组织中HPV的快速检测和分型
作者：徐钤 齐凤菊 黄扬中
单位：第一军医大学生化教研室，广州市 510515
关键词：反向点杂交法；人乳头瘤病毒；宫颈癌
病毒学报990408 摘要：迄今已发现的人乳头瘤病毒(HPV)型已超过77型，其中至少有30个型与泌尿生殖道肿瘤有关。所以HPV的检测与分型对于泌尿生殖道肿瘤的病因和预后将是非常重要的。HPV有很大的异质性，故用常规的诊断技术来测定未知标本中的HPV基因型有一定困难。为此，我们应用了反向点杂交法(RDB)来检测HPV分型。即用7种序列特异性寡核苷酸探针分别对应7型HPV(HPV6B、11、16、18、31、33、35)，这些探针被合成后依次固定在一条尼龙膜上形成7个点，再与样品DNA序列的PCR产物进行杂交。结果7型HPV中任一型阳性都可以在一条尼龙膜上鉴别出来。我们收集来自广州各大医院的标本，共计177例(除20例食道癌标本来自河南省外)，用RDB来检测HPV和分型。结果如下：子宫颈癌86例，其中鳞癌68例，HPV阳性59例(86.76%)；腺癌18例，HPV阳性8例(44.44%)；尖锐湿疣42例，HPV阳性39例(92.86%)；慢性宫颈炎29例，HPV阳性1例(3.45%)；食道癌20例，HPV阳性7例(35.00%)。
中图分类号：R373 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0348-06
RAPID DETECTION AND GENOTYPING OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS IN THE TUMOR TISSUE OF THE ANO-GENITAL REGION
XU Qian, QI Feng-ju, HUANG Yang-zhong
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: More than 77 types of human papillomavirus (HPV) have been found up to now, among which at least 30 types are associated with uro-genital tumors. So the detection and genotyping would be of great importance for studying the etiology and prognosis of the uro-genital tumors. However, HPV has great heterogeneity, so the detection of HPV type in an unknown specimen with routine diagnostic techniques would be somewhat difficult. Hence we used the reverse dot blot (RDB) technique to detect and genpotype the infecting HPVs. Seven sequence-specific oligonucleotide probes, corresponding respectively to 7 types of HPV(HPV6B, 11,16,18,31,33,,and 35) were used. After the synthesis of these 7 types of probes, they were fixed successively in order on a strip of nylon membrane to form 7 spots, then they were hybridized with the PCR products of the specimen DNA sequences. The result is that any one of the 7 types of HPV DNA, if positive, can be identified on one nylon strip. We collected 177 specimens from the hospitals in Guangzhou (except that 20 cases of esophageal carcinoma were from Henan Province). RDB technique was used to detect and genotype the infecting HPVs and the results were as follows: Uterine cervical carcinoma 86 cases, including 68 squamous carcinomas and 18 adenocarcinomas, the HPV positive numbers were 59/68 (86.76%) of the former (47 for type 16, 9 for type 18, 3 for type 16, 18 mixed infection) and 8/18 (44.44%) of the latter (5 for type 18, 3 for type 16); condyloma acuminatum 42 cases with 39 HPV positive ones (92.86%) of which 17 were type 6B, 20 of type 11 and 2 of mixed infection of types 6B and 11;chronic cervicitis 29 cases, with only one HPV positive (3.45%); and finally esophageal carcinoma 20 cases, with 7 HPV positive ones (35.00%).
Key words: Reverse dot blot; Human papillomavirus; Cervical carcinoma
人乳头瘤病毒(HPV)是已证明的DNA肿瘤病毒之一，属乳多空泡病毒科(Papovaviridae)。据报道，HPV DNA已在80%以上的妇女肛-生殖区(anogenital region)的良性和恶性肿瘤中检测到。迄今已发现的HPV的基因型已超过77型，其中至少有30个型与人泌尿生殖道肿瘤有关[1]。目前已证明某些型HPV(最多见的是HPV16和18)可引发子宫颈鳞状细胞癌[2]，故HPV16和18被称为高危病毒(high-risk virus)，而HPV6和11则被称为低危病毒(low-risk virus)，常见于尖锐湿疣和轻度宫颈上皮内肿瘤(CIN)中。尖锐湿疣(CA)是最常见的病毒性性传播性疾病之一。它对治疗很顽固，极易复发。据国内报道[3]，局部腐蚀治疗后，本病的复发率是7%～30%。HPV31、33、35也与癌形成有关，但发病率较低。因此我们选择了这7个型HPV(6B、11、16、18、31、33和35)，对临床标本进行了检测[4]。
所以HPV的检测和分型对于肛-生殖区肿瘤的病因和预后将是非常重要的。然而，由于HPV有很大的异质性，故用常用的诊断技术来测定肿瘤组织标本中的HPV的基因型尚有一定困难，因为只有将HPV常见基因型逐个筛选一遍，才能最后确定感染的病毒基因型。因此，在检测技术上费时，费钱，费力。为此我们改用反向点杂交法(RDB)来检测HPV和分型，获得了较好的结果。
材料与方法
1 肿瘤组织中HPV DNA的扩增和探针的制备 按我们以前的方法[5]扩增样品(新鲜肿瘤组织和石蜡包埋组织)DNA。简述如下：由中国科学院上海生物化学研究所合成3种PCR引物GP3、GP4和GP5，其核苷酸顺序如下：GP3：5＇-GCTGTTAGGCACATATTTT-3＇；GP4：5＇-AGGTACATATTGCCCTGC-3＇；GP5：5＇-ACCGTTTTCGGTAGTACCGTTTTCGTT-3＇。
GP5是7个型HPV DNA 的共用引物，其5＇端用生物素标记。如用GP5和GP4一对引物可扩增HPV6B和11两型的DNA片段；用GP5和GP3一对引物则可扩增HPV16、18、31、33和35的DNA片段。PCR的参数为94℃50秒，55℃50秒，72℃50秒；共30个循环，最后一次72℃延长至3分钟。7条探针的序列亦由上海生化所合成(表1)。
表1 对应于7型HPV DNA的7条探针(SSO)的序列
Table 1 7 sequence specific oligonucleotide (SSO) probes specifically against 7 types of HPV DNA HPV型别
探针序列
Type of HPV
Nucleotide sequence of the probe
HPV6B
5＇-TATGCACTGTAGCCAACTC-3＇
HPV11
5＇-CACAATACCCCACCAAATGAG-3＇
HPV16
5＇-CTGTGTAAAGGTTAGTCATAC-3＇
HPV18
5＇-TTTGTACAACTACTTTCATGC-3＇
HPV31
5＇-TAGATTATCTATATCCTTG-3＇
HPV33
5＇-CCAGGTGTGGACTAACCG-3＇
HPV35
5＇-CACCACCCTACACATCCT-3＇
2 反向点杂交(Reverse dot blot，RDB)法 将已合成的7种探针通过碳二亚胺的介导，固定在尼龙膜条上，形成7个点，然后与经PCR扩增的标本中HPV DNA片段进行杂交。膜条与PCR扩增产物一同浸入2×SSC液中，100℃水浴变性10分钟，立即放入52℃水浴中振摇30分钟，完成杂交。然后将膜条经洗涤后转入链霉素抗生物素蛋白辣根过氧化物酶溶液中浸泡，最后用TMB显色。杂交用的尼龙膜(Biodyne C)购自美国Pall Biosupport公司。
结果
1 聚丙烯酰胺凝胶电泳
样品从广州市各大医院采集。将上述7种质粒和标本的PCR扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳(图1)，可见这些产物的片段长度与预计的相符合。
图1 HPV DNA经PCR扩增片段的8%聚丙烯酰胺凝胶电泳图
1.HPV6B质粒(335bp)；2.尖锐湿疣患者(HPV6B+)；3.HPV11质粒(311bp)；4.尖锐湿疣患者(HPV11+)；5.DNA分子量标准(图左侧数字为其各带的数)；6.HPV18质粒(246bp)；7.子宫颈癌患者(HPV18+)；8.HPV16质粒(267bp)；9.子宫颈癌患者(HPV16+)。
Figure 1 8%SDS-PAGE of the PCR products of HPV DNAs
1.HPV 6B plasmid(335bp); 2. Patient with condyloma acuminatum(HPV 6B+); 3. HPV 11 plasmid (311bp); 4. Patient with condyloma acuminatum (HPV11+); 5.DNA marker (at the left side of the Figure is the length of DNA in bp); 6.HPV 18 plasmid(246bp); 7. Patient with cervical carcinoma (HPV 18+); 8.HPV 16 plasmid(267bp); 9. Patient with cervical carcinoma(HPV 16+).
2 RDB法的敏感性
分别以不同浓度的HPV16质粒DNA及阳性标本为模板，进行PCR-RDB法检测，实验显示，只要有1fg质粒DNA或5pg的HPV阳性细胞DNA存在即可呈现阳性结果(清晰的蓝紫色斑点)。在实际操作时一般仅取新鲜肿瘤组织1～2mm3，或用5μm厚石蜡切片一张即可。
标本经PCR扩增后进行RDB检测，获得了满意的结果。图2为其中7例患者的检测结果。
图2 用PCR-RDB法检测肛门生殖器区肿瘤患者HPV感染
1.尖锐湿疣患者(6)HPV6+；2.尖锐湿疣患者(1)HPV11+；3.宫颈癌患者(32)HPV16+；4.宫颈癌患者(12)HPV18+；5.阴性对照；6.尖锐湿疣患者(17)HPV6和11+；7.宫颈癌患者(15)HPV16和18+。 注：括号内为样品号。
Figure 2 Detection of HPV infection in patients with ano-genital tumors by PCR-RDB
1. Patient with condyloma acuminatum (Sample no.6) HPV6+; 2.Patient with condyloma acuminatum( Sample no.1) HPV11+; 3.Patient with cervical carcinoma (Sample no.32) HPV16+; 4. Patient with cervical carcinoma (Sample no. 12) HPV18+; 5. Negative control; 6. Patient with condyloma acuminatun (Sample no.17) HPV6+, HPV11+; 7. Patient with cervical carcinoma (Sample no.15) HPV16+, HPV18+.
3 临床标本检测和分型 我们收集来自广州市各大医院的标本157例和河南省食管癌标本20例，用RDB检测HPV和分型，结果列入表2。157例中子宫颈癌86例，其中鳞癌68例，HPV阳性59例(86.76%)；腺癌18例，HPV阳性8例(44.44%)；尖锐湿疣42例，阳性39例(92.86%)；慢性宫颈炎29例，阳性1例(3.45%)；食道癌20例，阳性7例(35.0%)。
表2 广州市肛门生殖器区肿瘤组织中HPV基因型的检测结果
Table 2 Genotypes of HPV detected in ano-genital tumors from patients in Guangzhou city 临床诊断
Clinical diagnosis
样品
Sample
样品数
Sample No.
HPV(+)*
HPV(-)*
HPV型别
HPV genotype
阳性Positive
Cases
%
Cases
%
Cases
%
1.子宫颈癌
Cervical carcinoma
鳞癌
Squamous carcinoma
石蜡包埋
Paraffin-embedded
58
51
87.93
7
12.07
16
41
70.69
18
7
12.07
16/18
3
5.71
新鲜组织
Fresh tissue
10
8
80.00
2
20.00
16
6
60.00
18
2
20.00
腺癌
Adenocarcinoma
石蜡包埋
Paraffin-embedded
18
8
44.44
10
55.56
16
3
16.67
18
5
27.78
2.尖锐湿疣
Condyloma acuminatum
新鲜组织
Fresh tissue
20
19
95.00
15.00
6B
8
40.00
9
45.00
11
2
10.00
6B/11
宫颈涂片
Cervical smear
22
20
90.91
2
9.09
6B
9
40.95
11
11
50.00
3.慢性宫颈炎
Chronic cervicitis
29
1
3.45
28
96.56
11
1
3.45
4.食道癌
Esophageal carcinoma
20
7
35.00
13
65.00
16
7
35.00
*(+)阳性Positive， (-)阴性Negative.
讨论
我们将Saiki等[6]首先提出的RDB技术应用在HPV不同型别的鉴别和检测上。RDB技术的主要特点是多种探针固定在一条尼龙膜上同时参与检测样品DNA而又互不干扰，能一次性筛查多种不同的序列。RDB方法简便，特异性好，应用于临床诊断，结合快速提取DNA技术，6小时之内即可得到结果。对肛-生殖区HPV感染进行准确分型是很重要的，因为特别是一些常见的HPV感染子宫颈区可以有不同的致病能力，因此受到医学界的重视。
我们测定了共68例子宫颈鳞癌，结果有59例(86.8%)为HPV阳性，这与国内外其他学者检测的结果相符。例如，伍欣星等用GP-PCR法快速检测子宫颈癌样品55例，HPV阳性占85.3%(47/55)，与我们相差不大，但伍氏未能分型。然而我们在18例子宫颈腺癌中仅发现有8例(44.6%)HPV阳性，而且仅3例为HPV16阳性。国外研究者亦多发现子宫颈腺癌的HPV感染阳性率不高。例如Leminen等[8]用原位杂交法在106例子宫颈腺癌中仅有18%为HPV阳性。但1995年Duggan等[9]检测77例腺癌，HPV阳性者高达70%(53例)，检出有HPV16、18和33三型，而仍以16型最多。Duggan认为在此之前检出HPV阳性率偏低可能是因为未用PCR技术，不够灵敏之故。我们的检出率为44%，且以HPV18居多，有异于Duggan。
用RDB法检测HPV DNA及其基因型主要的优点在于能一次性筛查多种不同的DNA序列，而其灵敏度与准确性并不亚于其他常用方法。例如，刘元林等[10]用PCR法检测HPV DNA，再用正向杂交法分型。结果子宫颈鳞癌检出阳性率为90%，生殖器疣为95%。陈乐真等[11]用原位杂交法和PCR法检测尖锐湿疣组织的HPV DNA，仅作HPV-6B和11两型，PCR法阳性率为83.9%，似较低些。赖晃文等[12]以HPV-6B、11、16、18四型的DNA为探针进行斑点杂交，检测尖锐湿疣患者皮损，总检出率为87.5%。陈嵩等[13]用巢式PCR检测HPV DNA，再根据RsaⅠ酶切扩增片段的电泳图谱来分型，避免了分子杂交。结果35例子宫颈癌的阳性检出率为85.75%，尖锐湿疣为96%。由上述结果可见，用PCR法扩增HPV DNA特异片段后，再加用其他手段进行分型检测(例如：正向斑点杂交、原位杂交、限制性核酸内切酶酶切、巢式PCR、等)均可得到可信的结果。对此，1992年11月中华皮肤科杂志编辑部曾在广州召开了尖锐湿疣专题座谈会[14]。会议认为，PCR技术为HPV感染提供了一种快速、敏感、特异的方法。而分子杂交检测法是目前检测HPV感染的一种敏感性和特异性很高的技术。但是会议又认为：分子杂交法比较繁琐，价格又贵，而且需要一定的设备和条件，目前尚不能在基层推广应用。中国医学科学院肿瘤研究所李洁等[15]在一项设计严密的大范围研究中，用经典的Southern印迹杂交法在全国14个省、市、自治区内共检测815例子宫颈癌，HPV总检出率为53.5%，其中HPV-16的检出率最高，但亦仅为31.9%；而209例子宫颈湿疣的HPV总检出率为40.8%，其中HPV-6/11型最高，达33.5%。他们的结果显然比上述学者和本文的结果低得多。我们认为，这是由于Southern印迹杂交法不够灵敏之故。该文作者也承认，如果采用敏感的PCR法，子宫颈癌组织中HPV检出率可达90%。
我们还收集了29份所谓“慢性宫颈炎”的样品，以便与肿瘤相比较。从我们的资料发现，慢性宫颈炎中HPV感染的发病率是很低的。在我们的系列中仅为3.45%。然而陈伟丽等[16]报道，在她们的系列中发病率可高达58.6%～81.8%，几乎与子宫颈癌患者中的一样。我们的整个样品系列是由有经验的病理学家诊断的，我们不能解释两者差异的原因。根据国外资料，慢性子宫颈炎中HPV的感染率亦不一致。例如，Ahn等[17]报告，13例慢性子宫颈炎中，有9例HPV阳性(69%)。而Nind1等报告[18]应用巢式PCR法检测宫颈上皮有轻度改变(包括上皮化生、子宫颈炎等)的患者HPV阳性率约为8%～15%。陈伟丽等[16]的报告中，均为有Ⅰ度～Ⅲ度子宫颈糜烂的慢性子宫颈炎患者，故可能因此而感染率较高。
我们又收集了从中国北方(河南省)来的20例食道癌作为比较，发现HPV发病率要低很多，仅为35%，虽然感染的HPV也是高危型的HPV16。日本学者Matsukura等[19]认为，下生殖道HPV感染极为复杂，异质性很大。他在235例子宫颈活检标本中检出的HPV共有24型；仅在CIN(Ⅰ级至Ⅲ级)中检测到的HPV即有17型。但他指出，HPV6和11型仅见于尖锐湿疣中，存在于其他病灶中者极少。这点与国内所见相符。
作者简介：徐钤(1924-)，男，原上海圣约翰大学医学院毕业(医学博士)。现为广州第一军医大学生物化学教研室教授，近十余年来致力于人乳头瘤病毒(HPV)的分子生物学研究。
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收稿日期：1998-11-17，修回日期：1999-06-25