我国北方蜱中人粒细胞埃立克体16S rRNA基因的检测
作者：高东旗 曹务春 赵秋敏 张习坦 方立群
单位：高东旗(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071；作者现在单位：北京军区军事医学研究所，石家庄 050081)；曹务春 赵秋敏 张习坦 方立群(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)
关键词：人粒细胞埃立克体；蜱；16S；rRNA基因
寄生虫与医学昆虫学报000209摘要 本文应用人粒细胞埃立克体病(HGE)的病原体的16S rRNA基因序列的特异引物对采自我国北方地区的一些蜱标本进行扩增，首次从内蒙古大兴安岭采集的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱，以及从新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱中扩增出该病原体的16S rRNA基因片段。所测出的967 bp序列与美国HGE株(GenBank U02521)的同源性为100%。
DETECTION OF HUMAN GRANULOCYTIC EHRLICHIA
, http://www.100md.com
16S rRNA GENE IN TICKS FROM NORTH CHINA
Gao Dongqi
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071；Institure of Military Medicine，Beijing Military Region，Shijiazhuang 050081)
Cao Wuchun
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071)
, http://www.100md.com
Zhao Qiumin
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071)
Zhang Xitan
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071)
Fang Liqun
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071)
, http://www.100md.com
Abstract Human granulocytic ehrlichia 16Sr RNA gene was amplified for the 1st time from Ixodes persulcatus、Dermacenter silvarum、Haemaphysalis concina and Dermacenter nutalli collected from north China.Sequence analysis of PCR products indicated that the detected 967 bp HGE 16S rRNA gene amplified from an Ixodes persulcatus collected from northeast China has 100% identical sequence with an American HGE agent isolate (GenBank U02521).
Key words Human granulocytic ehrlichia Ticks 16S rRNA gene
, 百拇医药
粒细胞埃立克体(granulocytic Ehrlichia)一直被认为是反刍动物和马的病原体，直到1994年才被确证可引起人粒细胞埃立克体病(Human granulocytic Ehrlichiosis，简写为HGE)是一种由蜱叮咬而传播的疾病，病原体称为人粒细胞埃立克体(human granulocytic Ehrlichia)，通过测定其16S rRNA基因，得知其与马埃立克体(E.equi)和吞噬细胞埃立克体(E.phagocytophila)序列相近，同源性分别为99.9%和99.8%；与人单核细胞埃立克体病的致病因子查菲埃立克体(E.chaffeensis)的同源性为92.5%(Chen et al.,1994)。我国尚无该病病例的报道，由于本病无特异病征，了解我国有该病可疑蜱媒地区是否有该病原体存在，以及蜱媒的带菌率，有助于本病的诊治。16S rRNA基因为生物进化保守序列，其全基因序列分析已成功地用于埃立克体的分类和鉴定(Walker et al.,1996)，通过这种技术已证明肩突硬蜱(Ixodes scapularis)(美国)和篦子硬蜱(Ixodes ricinus)(欧洲)为人粒细胞埃立克体病的主要传播媒介，从美国威斯康星洲捕捉的肩突硬蜱，发现有7.9%(7/89)感染HGE病原体，其中2份同时含有HGE病原体和莱姆病螺旋体，这2种蜱又是莱姆病螺旋体的主要生物媒介，人粒细胞埃立克体病的地理分布与莱姆病的分布密切相关(Dumler et al.,1997;Brouqui et al.,1995;Sumption et al.,1995)。我们利用特异引物对我国北方尤其是莱姆病高发区的一些蜱标本，进行了HGE病原体16S rRNA基因的检测。现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 蜱标本来源
蜱标本是从我国大兴安岭的内蒙古牙克石中心林管局莫尔道嘎林业局和乌尔旗汗林业局、北京地区的灵山和新疆的精河地区林子里的草丛上采集的，采集点湿度较大，多为针阔叶林交织带，适于蜱类滋生。所有蜱标本均经本所昆虫学家许荣满教授鉴定蜱种及雌雄。各组蜱标本的雌雄数基本相同。
1.2 蜱标本DNA模板的提取
先将蜱标本用70%乙醇浸泡30 min以上，再用灭菌蒸馏水清洗；清洗过的蜱经干燥后用研磨器研碎；每只蜱加美国Genaco公司DNA提取液200 μL，煮沸约2 min；冷却后冰浴1 min，10 000 r/min离心10 min;将上清移至1.5 mL离心管中，加入等量异丙醇，混匀后室温放置15 min，沉淀DNA；12 000 r/min离心10 min，弃上清；用2倍体积的70%乙醇洗涤沉淀，再次离心弃上清，自然凉干；加灭菌纯小50μL溶解DNA，放-20℃冰箱保存，备用。
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1.3 PCR扩增
根据文献报道(Anderson et al.,1991;Chen et al.,1994;Goodman et al.,1996)，选择了引物EC12、GE9f、GE10r、PER2和Ehr521；又根据OLIGO 4.0-1369引物分析软件设计了引物HG2(所有引物均由本院八所合成)。引物的位置(EC12是根据大肠杆菌16S rRNA基因的位置，其余引物的位置是根据GenBank:U02521)和核甘酸序列为：
EC12(18～37)：5’-AATCTAGAGTTTGATCCTGG-3’
HG2(431～422)：5’-CGTCATTATCTTCCCTACTG-3’
GE9f(49～73)：5’-AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT-3’
, 百拇医药
PER2(635～613)：5’-CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT-3’
Ehr521(527～550)：5’-TGTAGGCGGTTCGGTAAGTTAAAG-3’
GE10r(967～953)：5’-TTCCGTTAAGAAGGATCTTAATCTCC-3’
半巢式PCR扩增方法是以EC12和PER2作第1轮扩增，然后再以EC12和HG2对第1轮的扩增产物进行第2轮扩增；GE9f和GE10r作第1轮扩增，再以GE9f/PER2和Ehr521/GE10r 2对引物分别对第1轮的扩增产物进行第2轮扩增。扩增总体积为30μL，包括5μL DNA模板，10×PCR缓冲液3 μL，引物浓度为0.1 μmol/L,dNTPs0.08 μmol/L,Taq多聚酶0.5μL(2U/mL)。扩增条件：95℃预变性180 s；94℃ 60 s；56℃ 75 s，72℃ 70s扩增35个循环；72℃延伸7 min。以1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察PCR扩增结果。为避免标本污染引起假阳性反应，标本的制备、反应液的制备、PCR扩增试验和PCR产物的电泳观察均在不同房间进行。每次试验均设空白(水)对照和阳性对照(含HGE病原体16S rRNA基因的质粒，由美国霍普金斯大学Dumler博士惠赠)；并对典型的阳性蜱标本和阴性蜱标本的电泳结果拍照。
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1.4 PCR产物的克隆与DNA序列测定
用低熔点琼脂糖凝胶电泳法收集PCR扩增产物，纯化后连接到T载体上。将重组质粒转化感受态E.coli XL1-blue宿主菌。转化子在含IPTG和X-gal的平板上以蓝、白斑法筛选。挑选白色菌落，用相应的引物进行PCR快速鉴定。取阳性菌增菌，以试剂盒提取双链质粒DNA。再送北京六合通技术发展有限公司应用373A自动测序仪测序。
1.5 DNA序列同源性比较
通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点后，利用“BLAST Sequence Similarity Searching”工具，与GenBank中注册的微生物16S rRNA基因序列进行同源性比较。
2 结果
2.1 蜱标本中HGE的检测
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先以引物GE9f和GE10r作第1轮扩增，再以引物Ehr521和GE10r对第1轮的扩增产物进行第2轮扩增。试验最少重复2次，重复试验的结果基本一致。结果从内蒙古牙克石中心林管局莫尔道嘎林业局和乌尔旗汗林业局采集的全沟硬蜱(I.persulcatus)、森林革蜱(D.silvarum)和嗜群血蜱(H.concinna)中扩增出441 bp的特异的HGE 16S rRNA基因片段，见图1。同时检测的新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱(D.nutalli)也扩增出相应的片段。莫尔道嘎林业局采集的64只全沟硬蜱中4只阳性(其中2只是雌蜱)，70只森林革蜱中2只阳性(其中1只是雌蜱)；乌尔旗汗林业局采集的210只全沟硬蜱(分42组，其中18组为雌蜱)中有8组为阳性(其中3组是雌蜱)，50只嗜群血蜱中仅有1只雄蜱为阳性；新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱分组时未分雌雄。各组的阳性率详见表1。以单个蜱为单位进行检测的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱的带菌率虽以全沟硬蜱带菌率较高，但统计学检验表明，各蜱种之间以及雌雄蜱之间的带菌率差别不显著，这可能是检测的蜱数较少所致。以5只蜱为1组进行检测的乌尔旗汗的全沟硬蜱、新疆精河的全沟硬蜱和草原革蜱的带菌率，虽然也是以全沟硬蜱带菌率较高，但差别也不显著，也可能是检测的蜱数较少所致。
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表1 蜱标本中HGE 16S rRNA基因片段(441bp)检测结果
Tab.1 Results of the detection of HGE agent 16S rRNA gene(441bp)from ticks 采集地点
Collection sites
采集时间(年)
Collected times(year)
蜱种
Species of ticks
检测蜱数
No.of ticks tested
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阳性率(%)
Infection rate
内蒙莫尔道嘎
Moerdaoga,Inner Mongolia
1999
全沟硬蜱
(I.persulcatus)
64
6.25(4/64)
森林革蜱
(D.silvarum)
70
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2.86(2/70)
内蒙乌尔旗汗
Wuerqihan,Inner Mongolia
1999
嗜群血蜱
(H.concinna)
50
2.00(1/50)
全沟硬蜱
(I.persulcatus)
210(42*)
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3.81**(8/210)
新疆精河
Jinghe,Xinjiang
1979
全沟硬蜱
(I.persulcatus)
1990(38*)
3.16**(6/190)
草原革蜱
(D.nutalli)
60(12*)
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1.67**(1/60)
北京灵山
Lingshan,Beijing
1998
长角血蜱
(H.longicornis)
200(40*)
0.00
*这里指组数，groups;**阳性组数比蜱总数得出的最小阳性率。Positive groups/No.of detected ticks.
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图1 M,DNAmaker(依次为2 000、1 000、750、500、250和100bp)；
1、2、3和4分别是嗜群血蜱、森林革蜱、全沟硬蜱和阳性对照
(含HGE病原体16Sr RNA基因的质粒)用引物Ehr521和GE10r扩增的441bp的DNA片段；
5和6是阴性蜱标本对照和空白(水)对照。
Fig.1 M,DNA maker (2 000,1 000,750,500,250 and 100 bp);Lane1,2,3 and
4 respectively represented the 441 bp products amplified from H.concinna,D.silvarum,I.persulcatus,and HGE agent Plasmid using primer pair Ehr521/GE10r;Lane 5
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and 6 were the negative tick control and water control.
2.2 蜱标本中HGE致病因子16S rRNA基因序列分析
选择内蒙古牙克石中心林管局莫尔道嘎林业局采集的全沟硬蜱阳性标本1份，按前述的方法进行EC12/HG2、GE9f/PER2和Ehr521/GE10 三对引物扩增，扩出的片段进行重复2次以上的克隆和序列测定，以重复测定结果一致为准，否则增加测序次数。将测定的3个片段的DNA序列整合成一完整的DNA序列输入BLAST分析程序，与GenBank中注册的微生物基因序列进行同源性比较。结果这一DNA片段(全长967 bp)的序列与美国一HGE病原体分离株16S rRNA基因序列(GenBank中注册的U02521)相对应片段完全一致，无一核苷酸不同，同源性为100%。同源性较大的其它几种微生物为：吞噬细胞埃立克体(E.phagocytophila)，同源性为99.8%(959/961)；马埃立克体(E.equi)，同源性为99.7%(958/961)；血小板埃立克体(E.platys)，同源性为97.7%(941/963)。
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3 讨论
因16S rRNA基因为生物进化保守序列，对其全基因序列分析已成功地用于埃立克体的分类和鉴定，据此原理，埃立克体及近缘微生物被分为3组；第1组包括犬埃立克体(E.canis)，查菲埃立克体(E.chaffeensis),鼠埃立克体(E.muris)，尤茵埃立克体(E.ewingii)和反刍类考德里氏体(Cowdria ruminantium)；第2组包括吞噬细胞埃立克体(E.phagocytophila)，马埃立克体(E.equi)，牛埃立克体(E.bovis)，人粒细胞埃立克体(Human granulocytic ehrlichia),血小板埃立克体(E.platys)和边缘无形体(Anaplasma marginale)；第3组包括腺热埃立克体(E.sennetsu)和立氏埃立克体(E.risticii)(Pretzman et al.,1995;Walker et al.,1996)。埃立克体为专性细胞内寄生菌，在体外需应用特殊的细胞系进行分离和培养，一般的实验室较难做到。PCR和序列测定技术，对原始材料要求不高，适用于各种样本。近来的一些研究结果证明，该技术尤其适用于蜱标本(Chu,1998;Anderson et al.,1993)，使用巢式PCR又进一步提高了灵敏性(Haff，1994)。
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本实验研究中，应用HGE病原体16S rRNA基因序列的特异引物“2对外引物和3对内引物(共6段)”对采自北方地区的一些蜱标本进行半巢式PCR扩增，首次从内蒙古大兴安岭采集的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱，以及从新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱中扩增出HGE病原体16S rRNA基因序列。所测出的DNA长度为967 bp的序列与美国HGE病原体(GenBank U02521)的同源性为100%。同源性分析可见，与所测序列同源性最大的几种微生物均包括在以上按16S rRNA基因分组的第2组内。因此可以初步认为，所测序列是人粒细胞埃立克体的16S rRNA基因，在我国北方，有全沟硬蜱、森林革蜱、嗜群血蜱和草原革蜱分布的地方可能存在人粒细胞埃立克体感染的自然疫源地。本实验的结果表明，使用的半巢式PCR扩增引物可以简便快速地检测和分析蜱标本中可能存在的HGE的病原体，为人粒细胞埃立克体感染的病原学，媒介生物学，及流行病学调查研究提供了一个可行的方法。
致谢 内蒙古牙克石林管局中心防疫站的朱建华、陈山虎同志，本室的杨红、戴庆华、张泮河同志在本工作中给予了许多帮助，作者在此表示衷心感谢。
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本研究获国家自然科学基金资助，批准号：39970655
参考文献
1，Anderson,B.E.,J.E.Dawson,D.C.Jones et al.1991.Ehrlichia chaffeensis,a new species associated with human ehrlichiosis.J.Clin.Microbiol.29:2838～2842.
2，Anderson,B.E.,J.W.Sumner,J.E.Dawson et al.1993.Amblyomma americanum:a potential vector of human ehrlichiosis.Am.J.Trop.Med.Hyg.49:239～244.
3，Brouqui,P.,J.S.Dumler,R.Lienhard et al.1995.Human granulocytic ehrlichiosis in Europe. Lencet 346:782～783.
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4，Chen,S.M.,J.S.Dumler,J.S.Bakken et al.1994.Identification of a granulocytic ehrlichia species as the etiologic agent of human disease.J.Clin.Microbiol.32:589～595.
5，Chu,F.K.1998.Rapid and sensitive PCR-based detection and differentiation of aetiologic agents of human granulocytotropic and monocytotropic ehrlichiosis.Mol.Cell. Prob.2:93～99.
6，Dumler,J.S.,L.Dotevall,R.Gustafson et al.1997 A population-based seroepidemiologic study of human granulocytic ehrlichiosis and Lyme borreliosis on the west coast of Sweden. J.Infect.Dis.175:720～722.
, http://www.100md.com
7，Goodman,J.L.,C.Nelson,B.Vitale et al.1996.Direct cultiviatioon of the causative agent of human granulocytic ehrlichiosis.N.Engl.J.Med.334:209～215.
8，Haff,L.A.1994.Improved quantitative PCR using nested primers.PCR Methods Appl.3:332～337.
9，Pretzman,C.,D.Ralph,D.R.Stothard et al.1995.16S rRNA gene sequence of Neorickettsia helminthoeca and its phylogenetic alignment with members of the Genus Ehrlichia.int.J.Stst.Bacteriol.45:207.
10，Sumption,J.S.,D.J.M.Wright,S.J.Culter et al.1995.Human ehrlichiosis in the UK. Lencet 346:1487～1488.
11，Walker,D.H. and J.S.Dumler 1996.Emergence of the ehrlichiosis as human health problems.Emerg.Infect.Dis.2:18～29.
收稿日期：2000-02-23, http://www.100md.com
单位：高东旗(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071；作者现在单位：北京军区军事医学研究所，石家庄 050081)；曹务春 赵秋敏 张习坦 方立群(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)
关键词：人粒细胞埃立克体；蜱；16S；rRNA基因
寄生虫与医学昆虫学报000209摘要 本文应用人粒细胞埃立克体病(HGE)的病原体的16S rRNA基因序列的特异引物对采自我国北方地区的一些蜱标本进行扩增，首次从内蒙古大兴安岭采集的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱，以及从新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱中扩增出该病原体的16S rRNA基因片段。所测出的967 bp序列与美国HGE株(GenBank U02521)的同源性为100%。
DETECTION OF HUMAN GRANULOCYTIC EHRLICHIA
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16S rRNA GENE IN TICKS FROM NORTH CHINA
Gao Dongqi
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071；Institure of Military Medicine，Beijing Military Region，Shijiazhuang 050081)
Cao Wuchun
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071)
, http://www.100md.com
Zhao Qiumin
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071)
Zhang Xitan
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071)
Fang Liqun
(Institute of Microbiology & Epidemiology,Academy of Military Medical Sicences,Beijing 100071)
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Abstract Human granulocytic ehrlichia 16Sr RNA gene was amplified for the 1st time from Ixodes persulcatus、Dermacenter silvarum、Haemaphysalis concina and Dermacenter nutalli collected from north China.Sequence analysis of PCR products indicated that the detected 967 bp HGE 16S rRNA gene amplified from an Ixodes persulcatus collected from northeast China has 100% identical sequence with an American HGE agent isolate (GenBank U02521).
Key words Human granulocytic ehrlichia Ticks 16S rRNA gene
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粒细胞埃立克体(granulocytic Ehrlichia)一直被认为是反刍动物和马的病原体，直到1994年才被确证可引起人粒细胞埃立克体病(Human granulocytic Ehrlichiosis，简写为HGE)是一种由蜱叮咬而传播的疾病，病原体称为人粒细胞埃立克体(human granulocytic Ehrlichia)，通过测定其16S rRNA基因，得知其与马埃立克体(E.equi)和吞噬细胞埃立克体(E.phagocytophila)序列相近，同源性分别为99.9%和99.8%；与人单核细胞埃立克体病的致病因子查菲埃立克体(E.chaffeensis)的同源性为92.5%(Chen et al.,1994)。我国尚无该病病例的报道，由于本病无特异病征，了解我国有该病可疑蜱媒地区是否有该病原体存在，以及蜱媒的带菌率，有助于本病的诊治。16S rRNA基因为生物进化保守序列，其全基因序列分析已成功地用于埃立克体的分类和鉴定(Walker et al.,1996)，通过这种技术已证明肩突硬蜱(Ixodes scapularis)(美国)和篦子硬蜱(Ixodes ricinus)(欧洲)为人粒细胞埃立克体病的主要传播媒介，从美国威斯康星洲捕捉的肩突硬蜱，发现有7.9%(7/89)感染HGE病原体，其中2份同时含有HGE病原体和莱姆病螺旋体，这2种蜱又是莱姆病螺旋体的主要生物媒介，人粒细胞埃立克体病的地理分布与莱姆病的分布密切相关(Dumler et al.,1997;Brouqui et al.,1995;Sumption et al.,1995)。我们利用特异引物对我国北方尤其是莱姆病高发区的一些蜱标本，进行了HGE病原体16S rRNA基因的检测。现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 蜱标本来源
蜱标本是从我国大兴安岭的内蒙古牙克石中心林管局莫尔道嘎林业局和乌尔旗汗林业局、北京地区的灵山和新疆的精河地区林子里的草丛上采集的，采集点湿度较大，多为针阔叶林交织带，适于蜱类滋生。所有蜱标本均经本所昆虫学家许荣满教授鉴定蜱种及雌雄。各组蜱标本的雌雄数基本相同。
1.2 蜱标本DNA模板的提取
先将蜱标本用70%乙醇浸泡30 min以上，再用灭菌蒸馏水清洗；清洗过的蜱经干燥后用研磨器研碎；每只蜱加美国Genaco公司DNA提取液200 μL，煮沸约2 min；冷却后冰浴1 min，10 000 r/min离心10 min;将上清移至1.5 mL离心管中，加入等量异丙醇，混匀后室温放置15 min，沉淀DNA；12 000 r/min离心10 min，弃上清；用2倍体积的70%乙醇洗涤沉淀，再次离心弃上清，自然凉干；加灭菌纯小50μL溶解DNA，放-20℃冰箱保存，备用。
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1.3 PCR扩增
根据文献报道(Anderson et al.,1991;Chen et al.,1994;Goodman et al.,1996)，选择了引物EC12、GE9f、GE10r、PER2和Ehr521；又根据OLIGO 4.0-1369引物分析软件设计了引物HG2(所有引物均由本院八所合成)。引物的位置(EC12是根据大肠杆菌16S rRNA基因的位置，其余引物的位置是根据GenBank:U02521)和核甘酸序列为：
EC12(18～37)：5’-AATCTAGAGTTTGATCCTGG-3’
HG2(431～422)：5’-CGTCATTATCTTCCCTACTG-3’
GE9f(49～73)：5’-AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT-3’
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PER2(635～613)：5’-CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT-3’
Ehr521(527～550)：5’-TGTAGGCGGTTCGGTAAGTTAAAG-3’
GE10r(967～953)：5’-TTCCGTTAAGAAGGATCTTAATCTCC-3’
半巢式PCR扩增方法是以EC12和PER2作第1轮扩增，然后再以EC12和HG2对第1轮的扩增产物进行第2轮扩增；GE9f和GE10r作第1轮扩增，再以GE9f/PER2和Ehr521/GE10r 2对引物分别对第1轮的扩增产物进行第2轮扩增。扩增总体积为30μL，包括5μL DNA模板，10×PCR缓冲液3 μL，引物浓度为0.1 μmol/L,dNTPs0.08 μmol/L,Taq多聚酶0.5μL(2U/mL)。扩增条件：95℃预变性180 s；94℃ 60 s；56℃ 75 s，72℃ 70s扩增35个循环；72℃延伸7 min。以1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察PCR扩增结果。为避免标本污染引起假阳性反应，标本的制备、反应液的制备、PCR扩增试验和PCR产物的电泳观察均在不同房间进行。每次试验均设空白(水)对照和阳性对照(含HGE病原体16S rRNA基因的质粒，由美国霍普金斯大学Dumler博士惠赠)；并对典型的阳性蜱标本和阴性蜱标本的电泳结果拍照。
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1.4 PCR产物的克隆与DNA序列测定
用低熔点琼脂糖凝胶电泳法收集PCR扩增产物，纯化后连接到T载体上。将重组质粒转化感受态E.coli XL1-blue宿主菌。转化子在含IPTG和X-gal的平板上以蓝、白斑法筛选。挑选白色菌落，用相应的引物进行PCR快速鉴定。取阳性菌增菌，以试剂盒提取双链质粒DNA。再送北京六合通技术发展有限公司应用373A自动测序仪测序。
1.5 DNA序列同源性比较
通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点后，利用“BLAST Sequence Similarity Searching”工具，与GenBank中注册的微生物16S rRNA基因序列进行同源性比较。
2 结果
2.1 蜱标本中HGE的检测
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先以引物GE9f和GE10r作第1轮扩增，再以引物Ehr521和GE10r对第1轮的扩增产物进行第2轮扩增。试验最少重复2次，重复试验的结果基本一致。结果从内蒙古牙克石中心林管局莫尔道嘎林业局和乌尔旗汗林业局采集的全沟硬蜱(I.persulcatus)、森林革蜱(D.silvarum)和嗜群血蜱(H.concinna)中扩增出441 bp的特异的HGE 16S rRNA基因片段，见图1。同时检测的新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱(D.nutalli)也扩增出相应的片段。莫尔道嘎林业局采集的64只全沟硬蜱中4只阳性(其中2只是雌蜱)，70只森林革蜱中2只阳性(其中1只是雌蜱)；乌尔旗汗林业局采集的210只全沟硬蜱(分42组，其中18组为雌蜱)中有8组为阳性(其中3组是雌蜱)，50只嗜群血蜱中仅有1只雄蜱为阳性；新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱分组时未分雌雄。各组的阳性率详见表1。以单个蜱为单位进行检测的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱的带菌率虽以全沟硬蜱带菌率较高，但统计学检验表明，各蜱种之间以及雌雄蜱之间的带菌率差别不显著，这可能是检测的蜱数较少所致。以5只蜱为1组进行检测的乌尔旗汗的全沟硬蜱、新疆精河的全沟硬蜱和草原革蜱的带菌率，虽然也是以全沟硬蜱带菌率较高，但差别也不显著，也可能是检测的蜱数较少所致。
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表1 蜱标本中HGE 16S rRNA基因片段(441bp)检测结果
Tab.1 Results of the detection of HGE agent 16S rRNA gene(441bp)from ticks 采集地点
Collection sites
采集时间(年)
Collected times(year)
蜱种
Species of ticks
检测蜱数
No.of ticks tested
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阳性率(%)
Infection rate
内蒙莫尔道嘎
Moerdaoga,Inner Mongolia
1999
全沟硬蜱
(I.persulcatus)
64
6.25(4/64)
森林革蜱
(D.silvarum)
70
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2.86(2/70)
内蒙乌尔旗汗
Wuerqihan,Inner Mongolia
1999
嗜群血蜱
(H.concinna)
50
2.00(1/50)
全沟硬蜱
(I.persulcatus)
210(42*)
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3.81**(8/210)
新疆精河
Jinghe,Xinjiang
1979
全沟硬蜱
(I.persulcatus)
1990(38*)
3.16**(6/190)
草原革蜱
(D.nutalli)
60(12*)
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1.67**(1/60)
北京灵山
Lingshan,Beijing
1998
长角血蜱
(H.longicornis)
200(40*)
0.00
*这里指组数，groups;**阳性组数比蜱总数得出的最小阳性率。Positive groups/No.of detected ticks.
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图1 M,DNAmaker(依次为2 000、1 000、750、500、250和100bp)；
1、2、3和4分别是嗜群血蜱、森林革蜱、全沟硬蜱和阳性对照
(含HGE病原体16Sr RNA基因的质粒)用引物Ehr521和GE10r扩增的441bp的DNA片段；
5和6是阴性蜱标本对照和空白(水)对照。
Fig.1 M,DNA maker (2 000,1 000,750,500,250 and 100 bp);Lane1,2,3 and
4 respectively represented the 441 bp products amplified from H.concinna,D.silvarum,I.persulcatus,and HGE agent Plasmid using primer pair Ehr521/GE10r;Lane 5
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and 6 were the negative tick control and water control.
2.2 蜱标本中HGE致病因子16S rRNA基因序列分析
选择内蒙古牙克石中心林管局莫尔道嘎林业局采集的全沟硬蜱阳性标本1份，按前述的方法进行EC12/HG2、GE9f/PER2和Ehr521/GE10 三对引物扩增，扩出的片段进行重复2次以上的克隆和序列测定，以重复测定结果一致为准，否则增加测序次数。将测定的3个片段的DNA序列整合成一完整的DNA序列输入BLAST分析程序，与GenBank中注册的微生物基因序列进行同源性比较。结果这一DNA片段(全长967 bp)的序列与美国一HGE病原体分离株16S rRNA基因序列(GenBank中注册的U02521)相对应片段完全一致，无一核苷酸不同，同源性为100%。同源性较大的其它几种微生物为：吞噬细胞埃立克体(E.phagocytophila)，同源性为99.8%(959/961)；马埃立克体(E.equi)，同源性为99.7%(958/961)；血小板埃立克体(E.platys)，同源性为97.7%(941/963)。
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3 讨论
因16S rRNA基因为生物进化保守序列，对其全基因序列分析已成功地用于埃立克体的分类和鉴定，据此原理，埃立克体及近缘微生物被分为3组；第1组包括犬埃立克体(E.canis)，查菲埃立克体(E.chaffeensis),鼠埃立克体(E.muris)，尤茵埃立克体(E.ewingii)和反刍类考德里氏体(Cowdria ruminantium)；第2组包括吞噬细胞埃立克体(E.phagocytophila)，马埃立克体(E.equi)，牛埃立克体(E.bovis)，人粒细胞埃立克体(Human granulocytic ehrlichia),血小板埃立克体(E.platys)和边缘无形体(Anaplasma marginale)；第3组包括腺热埃立克体(E.sennetsu)和立氏埃立克体(E.risticii)(Pretzman et al.,1995;Walker et al.,1996)。埃立克体为专性细胞内寄生菌，在体外需应用特殊的细胞系进行分离和培养，一般的实验室较难做到。PCR和序列测定技术，对原始材料要求不高，适用于各种样本。近来的一些研究结果证明，该技术尤其适用于蜱标本(Chu,1998;Anderson et al.,1993)，使用巢式PCR又进一步提高了灵敏性(Haff，1994)。
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本实验研究中，应用HGE病原体16S rRNA基因序列的特异引物“2对外引物和3对内引物(共6段)”对采自北方地区的一些蜱标本进行半巢式PCR扩增，首次从内蒙古大兴安岭采集的全沟硬蜱、森林革蜱和嗜群血蜱，以及从新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱中扩增出HGE病原体16S rRNA基因序列。所测出的DNA长度为967 bp的序列与美国HGE病原体(GenBank U02521)的同源性为100%。同源性分析可见，与所测序列同源性最大的几种微生物均包括在以上按16S rRNA基因分组的第2组内。因此可以初步认为，所测序列是人粒细胞埃立克体的16S rRNA基因，在我国北方，有全沟硬蜱、森林革蜱、嗜群血蜱和草原革蜱分布的地方可能存在人粒细胞埃立克体感染的自然疫源地。本实验的结果表明，使用的半巢式PCR扩增引物可以简便快速地检测和分析蜱标本中可能存在的HGE的病原体，为人粒细胞埃立克体感染的病原学，媒介生物学，及流行病学调查研究提供了一个可行的方法。
致谢 内蒙古牙克石林管局中心防疫站的朱建华、陈山虎同志，本室的杨红、戴庆华、张泮河同志在本工作中给予了许多帮助，作者在此表示衷心感谢。
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本研究获国家自然科学基金资助，批准号：39970655
参考文献
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2，Anderson,B.E.,J.W.Sumner,J.E.Dawson et al.1993.Amblyomma americanum:a potential vector of human ehrlichiosis.Am.J.Trop.Med.Hyg.49:239～244.
3，Brouqui,P.,J.S.Dumler,R.Lienhard et al.1995.Human granulocytic ehrlichiosis in Europe. Lencet 346:782～783.
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4，Chen,S.M.,J.S.Dumler,J.S.Bakken et al.1994.Identification of a granulocytic ehrlichia species as the etiologic agent of human disease.J.Clin.Microbiol.32:589～595.
5，Chu,F.K.1998.Rapid and sensitive PCR-based detection and differentiation of aetiologic agents of human granulocytotropic and monocytotropic ehrlichiosis.Mol.Cell. Prob.2:93～99.
6，Dumler,J.S.,L.Dotevall,R.Gustafson et al.1997 A population-based seroepidemiologic study of human granulocytic ehrlichiosis and Lyme borreliosis on the west coast of Sweden. J.Infect.Dis.175:720～722.
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7，Goodman,J.L.,C.Nelson,B.Vitale et al.1996.Direct cultiviatioon of the causative agent of human granulocytic ehrlichiosis.N.Engl.J.Med.334:209～215.
8，Haff,L.A.1994.Improved quantitative PCR using nested primers.PCR Methods Appl.3:332～337.
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10，Sumption,J.S.,D.J.M.Wright,S.J.Culter et al.1995.Human ehrlichiosis in the UK. Lencet 346:1487～1488.
11，Walker,D.H. and J.S.Dumler 1996.Emergence of the ehrlichiosis as human health problems.Emerg.Infect.Dis.2:18～29.
收稿日期：2000-02-23, http://www.100md.com