双氢青蒿素治疗急性弓形虫感染小鼠疗效的进一步观察
作者：严笠 甘绍伯 齐志群 李爽
单位：严笠(北京热带医学研究所，北京 100050)；甘绍伯(北京热带医学研究所，北京 100050)；齐志群(北京热带医学研究所，北京 100050)；李爽(北京热带医学研究所，北京 100050)
关键词：弓形虫；双氢青蒿素；药物治疗；PCR
寄生虫与医学昆虫学报000202摘要 本实验对双氢青蒿素治疗小鼠急性弓形虫感染的疗效进行了进一步考察。小鼠腹腔内感染RH株弓形虫速殖子2×103，8h后给予单独双氢青蒿素75mg/kg.d和双氢青蒿素75mg/kg.d联合磺胺嘧啶钠100mg/kg.d灌喂小鼠治疗，每日2次，疗程15天，观察小鼠存活率，并于感染后第9、15、31天取小鼠腹水及肝脏进行虫体PCR检测。双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠组小鼠存活率达93%，与单独磺胺嘧啶钠(200 mg/kg.d)组存活率(69.3%)及单独双氢青蒿素(75 mg/kg.d)组存活率(0%)都有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。PCR检测可见小鼠腹水或腹腔冲洗液中除联合治疗组外，其余各组均可检测出虫体DNA，但只有对照组和单独双氢青蒿素组小鼠的肝脏中可检测出虫体DNA。结论(1)双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠以上述方式治疗小鼠急性弓形虫感染产生了协同作用，比两药单独治疗对小鼠的保护作用更好，能更快地清除腹腔中的弓形虫，并更有效地防止停药后的复发。(2)单独双氢青蒿素采用以上方案疗效不理想，只能延长小鼠存活时间。(3)以上各种治疗方案除单独双氢青蒿素组外，都可较好地清除小鼠肝脏中的虫体。(4)本研究为双氢青蒿素临床治疗急性弓形虫感染提供了更具体、合理、有效的用药方案。
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FURTHER EVALUATION OF THE EFFECT OF DIHYDROARTEMISININE
ON THE TREATMENT OF ACUTE TOXOPLASMA INFECTION IN MICE
Yan Li
(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing 100050)
Gan Shaobo
(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing 100050)
Qi Zhiqun
, 百拇医药
(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing 100050)
Li Shuang
(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing 100050)
Abstract Objective The efficacy of dihydroartemisinine was further evaluated in a murine model of acute toxoplasmosis. Methods Mice were challenged intraperitoneally with 2×103 RH strain tachyzoites of T. gondii. Eight hours later mice were treated with dihydroartemisinine alone (75mg/kg.d) or combined with sulfadiazine (100mg/kg.d) for 15 days,and every 12 hours drugs were administrated orally to mice. Then mice were killed at 9,15,31 days after infection, and the peritoneal fluids and livers were taken out for PCR analysis of DNA of T.gondii. Results Dihydroartemisinine in combination with sulfadiazine protected 93% mice against death. There was a significant difference between the survival rate of combination regimens and that of sulfadiazine alone (P<0.05). So did the survival rate between the combination rgimen and dihydroartemisinine alone (P<0.01). The PCR results indicated that the DNA of T.gondii was detected in peritoneal fluid of mice in all other groups except the dihydroartemisinine combined with sulfadiazine group,but PCR were positive only in livers of mice in control group and dihydroartemisnine group. Conclusion 1.The combination of dihydroartemisinine with sulfadiazine protected mice more effectively showing produced the synergistic effect. This regiment cleared the T.gondii in mice more quickly than that using each drug alone,and prevented mice from relapsing of toxoplasmosis more effectively. 2.We were not satisfied with the effectiveness of dihydroartemisnine alone in the treatment of murine toxoplasmosis,since it could only prolong the life time of mice. 3. All therapeutic protocols except the dihydroartemisinine alone cleared T.gondii in livers of mice infected. 4.This study provides a more useful and reasonable protocol with dihydroartemisinine for treatment the acute toxoplasmosis in clinic.
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Key words Toxoplasma gondii Dihydroartemisinine Drug treatment PCR
弓形虫病(Toxoplasmosis)是由专性细胞内寄生的刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种机会致病原虫病，是导致各种免疫功能低下病人死亡及造成孕妇流产、死胎、畸胎的重要原因之一，对人民的健康甚至生命造成威胁，如何更好地防治弓形虫病已成为众多学者研究的课题。
目前最常采用乙胺嘧啶和磺胺嘧啶联合治疗的方法，其毒副反应发生率高达40%，还存在着用量大、疗程长、停药后易复发等缺点(Haverkos,1987)。近年来人们发现了许多具有抗弓形虫作用的新药(Georgiev,1994)，青蒿素类药物就是其中的一种，体内外实验均证实了该类药物的抗弓形虫作用并对其机理进行了探讨(欧阳，1991)(孙志伟，1995)(李爽，1998)。双氢青蒿素在抗疟治疗中表现出高效、低毒、低复燃率、口服方便等优点，本实验选用了双氢青蒿素单独及联合磺胺嘧啶钠治疗急性弓形虫感染小鼠，进一步观察和探讨了双氢青蒿素治疗急性弓形虫病的应用价值。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 虫株：采用国际标准强毒株RH株弓形虫速殖子，虫株在本所以小鼠腹腔传代方式保存。
1.1.2 小鼠：采用远交系雌性昆明小鼠，体重18～22g。购自中国医科院动物繁育所。
1.1.3 药物：双氢青蒿素片剂(用时研磨成粉状)，由北京科泰新公司生产，批号：010498。磺胺嘧啶钠注射液由湖南制药厂生产，批号：970401-3。生理盐水由石家庄四药股份有限公司生产，批号：97081506。
1.1.4 引物：参照文献设计引物(Burg,1989)，该引物来自弓形虫B1基因，由美国CyberSyn公司合成(经RPC纯化)，扩增片段长度194bp。
, 百拇医药 引物1：5′GGAACTGCATCCGTTCATGAG3′(694～714bp)
引物2：5′TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3′(887～868bp)
1.1.5 PCR扩增系统：TaqDNA聚合酶及10×扩增缓冲液购自美国Promega公司；dNTP购自军事医学科学院(进口产品分装)；PCR扩增仪为美国PE Cetus公司生产的PE480型扩增仪。
1.1.6 分子量标准及其它试剂：PBR322/HaeⅢ酶切、琼脂糖购自华美公司；蛋白酶K由Merck公司生产。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立：取RH株弓形虫速殖子腹腔感染48h的小鼠腹水，无菌条件下以生理盐水稀释至5×103/mL，每只小鼠腹腔内注射0.4mL，相当于2×103个速殖子。
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1.2.2 药物治疗方案：
1.2.2.1 将实验小鼠随机分为4组，(1)对照组15只；(2)双氢青蒿素单独治疗组17只；(3)磺胺嘧啶钠单独治疗组13只；(4)双氢青蒿素与磺胺嘧啶钠联合治疗组15只。
1.2.2.2 药物剂量：根据预实验结果，单独双氢青蒿素组剂量选取75mg/kg.d，首剂加倍；磺胺嘧啶钠用量单独治疗组为200mg/kg.d；联合治疗组剂量分别为磺胺嘧啶钠100mg/kg.d，双氢青蒿素75mg/kg.d(首剂加倍)。
1.2.2.3 给药方法：治疗开始于感染后8h，每12h灌喂1次，定时给药，疗程15天。观察至感染后第30天。
1.2.3 PCR检测：
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1.2.3.1 取材：分别在对照组全部死亡时(感染后第9天)，疗程结束时(感染后第15天)，观察结束时(感染后第31天)，从各组小鼠中选取1只脱椎处死，取其腹水或腹腔冲洗液及肝脏进行弓形虫的PCR检测。
1.2.3.2 DNA提取：(1)腹水或腹腔冲洗液以6 000r/min离心5min，弃上清，沉淀悬浮于裂解液中(10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaCl,0.5% SDS,0.4mg/mL蛋白酶K)，55℃水浴消化3h，置100℃煮沸10min，冷却至4℃；(2)取1g肝脏组织加入少量STE缓冲液，在乳钵中制成匀浆，加上述裂解液，使蛋白酶浓度达0.8mg/mL，55℃水浴消化3h，37℃过夜；按常规酚∶氯仿∶异戊醇法提取DNA，并用少量TE溶解DNA，分装后-20℃冻存备用。
1.2.3.3 PCR扩增系统：10×扩增缓冲液(50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.01% Tritons-100) 5μL; 25mmol/L氯化镁(2.0mmol/L)4μL;dNTP(200mmol/L) 4μL;引物1，2(1μmol/L)各1μL；TaqDNA酶(1.25μ)0.25μL；模板DNA 0.5～1μL。用灭菌双蒸水补足50μL反应终体积，以50μL灭菌液体石蜡封顶，瞬时离心混匀，并设阴性对照。
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1.2.3.4 PCR反应条件：预变性94℃，3min；三温循环94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；末延伸72℃ 5min。
1.2.3.5 产物分析：采用琼脂糖凝胶电泳，制备2%含0.5μg/mL溴乙锭的凝胶，水平槽电泳，取10μL扩增产物及2μL 6×加样缓冲液点样，1×TAE缓冲液中电泳，80V，55mA约40min后紫外光(λ=254nm)下观察结果。
1.2.4 统计分析：采用χ2检验进行各组存活率显著性检验。
2 实验结果
2.1 各组小鼠存活率及存活时间见表1。
表1 各组小鼠存活率和存活天数
Tab.1 Survival rate and days of mice from each group
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平均存活天数(天)
Mean days of
survival
感染小鼠数(只)
Numbers of mice
infected
死亡数(只)
Numbers of
mortality
存活率(%)
Survival
rate(%)
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对照组
8.3
15
15
0
Control group
双氢青蒿素组
10.1
17
17
0
Group with dihydroartemisinine
, 百拇医药 磺胺嘧啶钠组
>30
13
4
69.3
Group with sulfadiazine
双氢青蒿素+磺胺嘧啶钠组
>30
15
1
93
Group with dihydroartemisinine
, 百拇医药
and sulfadiazine
注：磺胺嘧啶钠组死亡小鼠中1只死于感染后第15天，3只死于第21天；
联合治疗组小鼠死于第14天。
Note:one of the mice in the group with sulfadiazine alone died in the 15th day after infection,and three of those mice died in the 21th day;the mice of the group treated with dihydroartemisinine combined with sulfadiazine died in the 14th day.
2.2 各组小鼠存活率显著性检验结果
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2.2.1 除双氢青蒿素单独治疗组外，其余各组与对照组均有非常显著性差异(P<0.01)。
2.2.2 联合治疗组与磺胺嘧啶钠单独治疗组有显著性差异(χ2=4.04,P<0.05)，与双氢青蒿素单独治疗组有非常显著性差异(χ2=28.2,P<0.01)。
2.3 PCR检测结果
弓形虫DNA经扩增后电泳分析，可见194bp处有清晰扩增条带，各组小鼠腹水或腹腔冲洗液及肝脏在疗程不同时间的检测结果分别见图1、2。
图1 腹水弓形虫PCR检测结果
Fig.1 Results of PCR detection of T. gondii in peritoneal fluids
, 百拇医药
图2 肝脏弓形虫PCR检测结果
Fig.2 Results of PCR detection of T.gondii in livers
3 讨论
3.1 由各组存活率可以看出，以磺胺嘧啶钠与双氢青蒿素联合治疗组最高(93%)，与其它各组都有显著性差异，可见两药以这种方式联合应用产生了协同治疗作用，对小鼠的保护率高于单独治疗组。同时，通过将磺胺嘧啶钠总量减至单独用药量的一半(100mg/kg.d)，并将每日总量分两次灌喂，进一步减少了每次用药的剂量，从而起到减少毒副作用的作用。
3.2 我们以往的实验证实双氢青蒿素治疗小鼠急性弓形虫感染以大剂量、长疗程效果好，因此，在本实验中我们采用预实验中双氢青蒿素单独用药时疗效最好的剂量75mg/kg.d，并根据青蒿素类药物半衰期短的特性，将每日药物分2次，间隔12h灌喂小鼠，结果只能使小鼠存活时间延长，不能免死(见表1)，提示了单独双氢青蒿素以该种给药方式治疗急性弓形虫感染的疗效不理想；单独磺胺嘧啶钠(200mg/kg.d，每日2次)治疗组虽然取得了较好的疗效，但从小鼠死亡天数可看出，尽管延长疗程达15天，而停药7天后仍有3只小鼠死亡，从存活率上再次表明了单独应用该药停药后的复发率高。
, 百拇医药
3.3 在弓形虫的病原学检测中，常用的有直接检查法、病理学检查法和动物接种法，前两种方法可由于虫体数目少、处于不同发育时期形态不典型，或标本处理过程中虫体变形、破碎而不易辨认等原因使检出率很低(卢慎，1991)，后一种方法则费时、费力，影响了检出速度。PCR技术是一项特异性、敏感性都较高的方法，可在较短的时间内获得准确的结果，本所参照文献(Burg,1989)设计来自B1基因的两条引物，在最适条件下进行扩增，敏感性可达到0.1pgDNA，相当于半个弓形虫虫体，且特异性高，其它多种病原体无扩增带。本实验采用了上述方法对小鼠腹水在感染不同时间进行检测，结果对照组、单独双氢青蒿素组小鼠在疗程第9天均可检出虫体，其后由于两组小鼠全部死亡未再留取标本；单独磺胺嘧啶钠组小鼠在疗程第9天、疗程完成时(第15天)均可检出虫体，仅在观察结束时(第31天)存活小鼠无虫体检出；联合治疗组从疗程第9天起一直未检出虫体。(见图1)这一检测结果与各组存活率是一致的，也提示了该种给药方式的联合治疗可在治疗过程中最快地清除小鼠体内的虫体，同时通过继续观察发现，在治疗结束后大于半年的时间内，联合治疗组幸存小鼠均无发病及死亡，也进一步表明双氢青蒿素与磺胺嘧啶钠以该种方式联合治疗感染小鼠后，可彻底清除其体内虫体，达到长期稳定的疗效；而单独磺胺嘧啶钠组一直到治疗结束小鼠体内仍有弓形虫存在，该组有两只小鼠死于停药后第7天，死后其腹腔冲洗液中可见典型虫体，这提示了单独治疗清除虫体速度慢，且存在停药后复发的可能。
, 百拇医药
3.4 据文献报道，用来自B1基因的引物进行PCR，可较为灵敏、特异地检测急性弓形虫感染小鼠组织中的虫体DNA(Louis,1991)，本实验参照文献方法提取了小鼠肝脏中的DNA并进行了PCR检测，除对照组和双氢青蒿素组出现特异性扩增条带外，其余各组均为阴性(见图2)，这提示除单独双氢青蒿素外，上述其它两种治疗对清除小鼠肝脏内的虫体都有较好疗效。弓形虫感染小鼠后可侵犯全身各脏器，造成多种多样不同程度的损伤，因此，本实验中单一对肝脏的检测仅可作为考察疗效的一项参考指标。
参考文献
1，卢慎.1991.弓形虫在病理切片组织中的形态学研究.中国人兽共患病杂志，7(5)：43～44.
2，孙志伟.1995.青蒿素衍生物ME-908对弓形虫核酸代谢的影响.中国人兽共患病杂志，11(6)：78～80.
3，李爽，齐志群，甘绍伯，等.1998.双氢青蒿素对弓形虫超微结构的影响.中国人兽共患病杂志，14(5)：99～100.
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4，欧阳，Krng and E.C.Marr 1991.青蒿素抗弓形虫作用的实验研究.中国人兽共患病杂志，7(5)：63.
5，Burg,J.L.,M.Grover,P. Pouletty et al. 1989 Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan,Toxoplasma gondii by polymerase chain reaction. J.Clin.Microbiol. 27：1787～1792.
6，Georgiev,V.S. 1994 Management of toxoplasmosis. Drugs 48(2)：179～188.
7，Haverkos,H.W.1987 Assessment of therapy for toxoplasma encephalitis. Am.J.Med.82：907～914.
8，Louis,M.W.,A.U.Stephen,S.Miklos et al. 1991 Sensitive and specific detection of toxoplasma DNA in an experimental murine model:use of toxoplasma gondii-specific cDNA and the polymerase chain reaction. J.Infect.Dis. 163：180～186.
收稿日期：1999-08-03, 百拇医药
单位：严笠(北京热带医学研究所，北京 100050)；甘绍伯(北京热带医学研究所，北京 100050)；齐志群(北京热带医学研究所，北京 100050)；李爽(北京热带医学研究所，北京 100050)
关键词：弓形虫；双氢青蒿素；药物治疗；PCR
寄生虫与医学昆虫学报000202摘要 本实验对双氢青蒿素治疗小鼠急性弓形虫感染的疗效进行了进一步考察。小鼠腹腔内感染RH株弓形虫速殖子2×103，8h后给予单独双氢青蒿素75mg/kg.d和双氢青蒿素75mg/kg.d联合磺胺嘧啶钠100mg/kg.d灌喂小鼠治疗，每日2次，疗程15天，观察小鼠存活率，并于感染后第9、15、31天取小鼠腹水及肝脏进行虫体PCR检测。双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠组小鼠存活率达93%，与单独磺胺嘧啶钠(200 mg/kg.d)组存活率(69.3%)及单独双氢青蒿素(75 mg/kg.d)组存活率(0%)都有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。PCR检测可见小鼠腹水或腹腔冲洗液中除联合治疗组外，其余各组均可检测出虫体DNA，但只有对照组和单独双氢青蒿素组小鼠的肝脏中可检测出虫体DNA。结论(1)双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠以上述方式治疗小鼠急性弓形虫感染产生了协同作用，比两药单独治疗对小鼠的保护作用更好，能更快地清除腹腔中的弓形虫，并更有效地防止停药后的复发。(2)单独双氢青蒿素采用以上方案疗效不理想，只能延长小鼠存活时间。(3)以上各种治疗方案除单独双氢青蒿素组外，都可较好地清除小鼠肝脏中的虫体。(4)本研究为双氢青蒿素临床治疗急性弓形虫感染提供了更具体、合理、有效的用药方案。
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FURTHER EVALUATION OF THE EFFECT OF DIHYDROARTEMISININE
ON THE TREATMENT OF ACUTE TOXOPLASMA INFECTION IN MICE
Yan Li
(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing 100050)
Gan Shaobo
(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing 100050)
Qi Zhiqun
, 百拇医药
(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing 100050)
Li Shuang
(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing 100050)
Abstract Objective The efficacy of dihydroartemisinine was further evaluated in a murine model of acute toxoplasmosis. Methods Mice were challenged intraperitoneally with 2×103 RH strain tachyzoites of T. gondii. Eight hours later mice were treated with dihydroartemisinine alone (75mg/kg.d) or combined with sulfadiazine (100mg/kg.d) for 15 days,and every 12 hours drugs were administrated orally to mice. Then mice were killed at 9,15,31 days after infection, and the peritoneal fluids and livers were taken out for PCR analysis of DNA of T.gondii. Results Dihydroartemisinine in combination with sulfadiazine protected 93% mice against death. There was a significant difference between the survival rate of combination regimens and that of sulfadiazine alone (P<0.05). So did the survival rate between the combination rgimen and dihydroartemisinine alone (P<0.01). The PCR results indicated that the DNA of T.gondii was detected in peritoneal fluid of mice in all other groups except the dihydroartemisinine combined with sulfadiazine group,but PCR were positive only in livers of mice in control group and dihydroartemisnine group. Conclusion 1.The combination of dihydroartemisinine with sulfadiazine protected mice more effectively showing produced the synergistic effect. This regiment cleared the T.gondii in mice more quickly than that using each drug alone,and prevented mice from relapsing of toxoplasmosis more effectively. 2.We were not satisfied with the effectiveness of dihydroartemisnine alone in the treatment of murine toxoplasmosis,since it could only prolong the life time of mice. 3. All therapeutic protocols except the dihydroartemisinine alone cleared T.gondii in livers of mice infected. 4.This study provides a more useful and reasonable protocol with dihydroartemisinine for treatment the acute toxoplasmosis in clinic.
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Key words Toxoplasma gondii Dihydroartemisinine Drug treatment PCR
弓形虫病(Toxoplasmosis)是由专性细胞内寄生的刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种机会致病原虫病，是导致各种免疫功能低下病人死亡及造成孕妇流产、死胎、畸胎的重要原因之一，对人民的健康甚至生命造成威胁，如何更好地防治弓形虫病已成为众多学者研究的课题。
目前最常采用乙胺嘧啶和磺胺嘧啶联合治疗的方法，其毒副反应发生率高达40%，还存在着用量大、疗程长、停药后易复发等缺点(Haverkos,1987)。近年来人们发现了许多具有抗弓形虫作用的新药(Georgiev,1994)，青蒿素类药物就是其中的一种，体内外实验均证实了该类药物的抗弓形虫作用并对其机理进行了探讨(欧阳，1991)(孙志伟，1995)(李爽，1998)。双氢青蒿素在抗疟治疗中表现出高效、低毒、低复燃率、口服方便等优点，本实验选用了双氢青蒿素单独及联合磺胺嘧啶钠治疗急性弓形虫感染小鼠，进一步观察和探讨了双氢青蒿素治疗急性弓形虫病的应用价值。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 虫株：采用国际标准强毒株RH株弓形虫速殖子，虫株在本所以小鼠腹腔传代方式保存。
1.1.2 小鼠：采用远交系雌性昆明小鼠，体重18～22g。购自中国医科院动物繁育所。
1.1.3 药物：双氢青蒿素片剂(用时研磨成粉状)，由北京科泰新公司生产，批号：010498。磺胺嘧啶钠注射液由湖南制药厂生产，批号：970401-3。生理盐水由石家庄四药股份有限公司生产，批号：97081506。
1.1.4 引物：参照文献设计引物(Burg,1989)，该引物来自弓形虫B1基因，由美国CyberSyn公司合成(经RPC纯化)，扩增片段长度194bp。
, 百拇医药 引物1：5′GGAACTGCATCCGTTCATGAG3′(694～714bp)
引物2：5′TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3′(887～868bp)
1.1.5 PCR扩增系统：TaqDNA聚合酶及10×扩增缓冲液购自美国Promega公司；dNTP购自军事医学科学院(进口产品分装)；PCR扩增仪为美国PE Cetus公司生产的PE480型扩增仪。
1.1.6 分子量标准及其它试剂：PBR322/HaeⅢ酶切、琼脂糖购自华美公司；蛋白酶K由Merck公司生产。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立：取RH株弓形虫速殖子腹腔感染48h的小鼠腹水，无菌条件下以生理盐水稀释至5×103/mL，每只小鼠腹腔内注射0.4mL，相当于2×103个速殖子。
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1.2.2 药物治疗方案：
1.2.2.1 将实验小鼠随机分为4组，(1)对照组15只；(2)双氢青蒿素单独治疗组17只；(3)磺胺嘧啶钠单独治疗组13只；(4)双氢青蒿素与磺胺嘧啶钠联合治疗组15只。
1.2.2.2 药物剂量：根据预实验结果，单独双氢青蒿素组剂量选取75mg/kg.d，首剂加倍；磺胺嘧啶钠用量单独治疗组为200mg/kg.d；联合治疗组剂量分别为磺胺嘧啶钠100mg/kg.d，双氢青蒿素75mg/kg.d(首剂加倍)。
1.2.2.3 给药方法：治疗开始于感染后8h，每12h灌喂1次，定时给药，疗程15天。观察至感染后第30天。
1.2.3 PCR检测：
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1.2.3.1 取材：分别在对照组全部死亡时(感染后第9天)，疗程结束时(感染后第15天)，观察结束时(感染后第31天)，从各组小鼠中选取1只脱椎处死，取其腹水或腹腔冲洗液及肝脏进行弓形虫的PCR检测。
1.2.3.2 DNA提取：(1)腹水或腹腔冲洗液以6 000r/min离心5min，弃上清，沉淀悬浮于裂解液中(10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaCl,0.5% SDS,0.4mg/mL蛋白酶K)，55℃水浴消化3h，置100℃煮沸10min，冷却至4℃；(2)取1g肝脏组织加入少量STE缓冲液，在乳钵中制成匀浆，加上述裂解液，使蛋白酶浓度达0.8mg/mL，55℃水浴消化3h，37℃过夜；按常规酚∶氯仿∶异戊醇法提取DNA，并用少量TE溶解DNA，分装后-20℃冻存备用。
1.2.3.3 PCR扩增系统：10×扩增缓冲液(50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.01% Tritons-100) 5μL; 25mmol/L氯化镁(2.0mmol/L)4μL;dNTP(200mmol/L) 4μL;引物1，2(1μmol/L)各1μL；TaqDNA酶(1.25μ)0.25μL；模板DNA 0.5～1μL。用灭菌双蒸水补足50μL反应终体积，以50μL灭菌液体石蜡封顶，瞬时离心混匀，并设阴性对照。
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1.2.3.4 PCR反应条件：预变性94℃，3min；三温循环94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；末延伸72℃ 5min。
1.2.3.5 产物分析：采用琼脂糖凝胶电泳，制备2%含0.5μg/mL溴乙锭的凝胶，水平槽电泳，取10μL扩增产物及2μL 6×加样缓冲液点样，1×TAE缓冲液中电泳，80V，55mA约40min后紫外光(λ=254nm)下观察结果。
1.2.4 统计分析：采用χ2检验进行各组存活率显著性检验。
2 实验结果
2.1 各组小鼠存活率及存活时间见表1。
表1 各组小鼠存活率和存活天数
Tab.1 Survival rate and days of mice from each group
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平均存活天数(天)
Mean days of
survival
感染小鼠数(只)
Numbers of mice
infected
死亡数(只)
Numbers of
mortality
存活率(%)
Survival
rate(%)
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对照组
8.3
15
15
0
Control group
双氢青蒿素组
10.1
17
17
0
Group with dihydroartemisinine
, 百拇医药 磺胺嘧啶钠组
>30
13
4
69.3
Group with sulfadiazine
双氢青蒿素+磺胺嘧啶钠组
>30
15
1
93
Group with dihydroartemisinine
, 百拇医药
and sulfadiazine
注：磺胺嘧啶钠组死亡小鼠中1只死于感染后第15天，3只死于第21天；
联合治疗组小鼠死于第14天。
Note:one of the mice in the group with sulfadiazine alone died in the 15th day after infection,and three of those mice died in the 21th day;the mice of the group treated with dihydroartemisinine combined with sulfadiazine died in the 14th day.
2.2 各组小鼠存活率显著性检验结果
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2.2.1 除双氢青蒿素单独治疗组外，其余各组与对照组均有非常显著性差异(P<0.01)。
2.2.2 联合治疗组与磺胺嘧啶钠单独治疗组有显著性差异(χ2=4.04,P<0.05)，与双氢青蒿素单独治疗组有非常显著性差异(χ2=28.2,P<0.01)。
2.3 PCR检测结果
弓形虫DNA经扩增后电泳分析，可见194bp处有清晰扩增条带，各组小鼠腹水或腹腔冲洗液及肝脏在疗程不同时间的检测结果分别见图1、2。
图1 腹水弓形虫PCR检测结果
Fig.1 Results of PCR detection of T. gondii in peritoneal fluids
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图2 肝脏弓形虫PCR检测结果
Fig.2 Results of PCR detection of T.gondii in livers
3 讨论
3.1 由各组存活率可以看出，以磺胺嘧啶钠与双氢青蒿素联合治疗组最高(93%)，与其它各组都有显著性差异，可见两药以这种方式联合应用产生了协同治疗作用，对小鼠的保护率高于单独治疗组。同时，通过将磺胺嘧啶钠总量减至单独用药量的一半(100mg/kg.d)，并将每日总量分两次灌喂，进一步减少了每次用药的剂量，从而起到减少毒副作用的作用。
3.2 我们以往的实验证实双氢青蒿素治疗小鼠急性弓形虫感染以大剂量、长疗程效果好，因此，在本实验中我们采用预实验中双氢青蒿素单独用药时疗效最好的剂量75mg/kg.d，并根据青蒿素类药物半衰期短的特性，将每日药物分2次，间隔12h灌喂小鼠，结果只能使小鼠存活时间延长，不能免死(见表1)，提示了单独双氢青蒿素以该种给药方式治疗急性弓形虫感染的疗效不理想；单独磺胺嘧啶钠(200mg/kg.d，每日2次)治疗组虽然取得了较好的疗效，但从小鼠死亡天数可看出，尽管延长疗程达15天，而停药7天后仍有3只小鼠死亡，从存活率上再次表明了单独应用该药停药后的复发率高。
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3.3 在弓形虫的病原学检测中，常用的有直接检查法、病理学检查法和动物接种法，前两种方法可由于虫体数目少、处于不同发育时期形态不典型，或标本处理过程中虫体变形、破碎而不易辨认等原因使检出率很低(卢慎，1991)，后一种方法则费时、费力，影响了检出速度。PCR技术是一项特异性、敏感性都较高的方法，可在较短的时间内获得准确的结果，本所参照文献(Burg,1989)设计来自B1基因的两条引物，在最适条件下进行扩增，敏感性可达到0.1pgDNA，相当于半个弓形虫虫体，且特异性高，其它多种病原体无扩增带。本实验采用了上述方法对小鼠腹水在感染不同时间进行检测，结果对照组、单独双氢青蒿素组小鼠在疗程第9天均可检出虫体，其后由于两组小鼠全部死亡未再留取标本；单独磺胺嘧啶钠组小鼠在疗程第9天、疗程完成时(第15天)均可检出虫体，仅在观察结束时(第31天)存活小鼠无虫体检出；联合治疗组从疗程第9天起一直未检出虫体。(见图1)这一检测结果与各组存活率是一致的，也提示了该种给药方式的联合治疗可在治疗过程中最快地清除小鼠体内的虫体，同时通过继续观察发现，在治疗结束后大于半年的时间内，联合治疗组幸存小鼠均无发病及死亡，也进一步表明双氢青蒿素与磺胺嘧啶钠以该种方式联合治疗感染小鼠后，可彻底清除其体内虫体，达到长期稳定的疗效；而单独磺胺嘧啶钠组一直到治疗结束小鼠体内仍有弓形虫存在，该组有两只小鼠死于停药后第7天，死后其腹腔冲洗液中可见典型虫体，这提示了单独治疗清除虫体速度慢，且存在停药后复发的可能。
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3.4 据文献报道，用来自B1基因的引物进行PCR，可较为灵敏、特异地检测急性弓形虫感染小鼠组织中的虫体DNA(Louis,1991)，本实验参照文献方法提取了小鼠肝脏中的DNA并进行了PCR检测，除对照组和双氢青蒿素组出现特异性扩增条带外，其余各组均为阴性(见图2)，这提示除单独双氢青蒿素外，上述其它两种治疗对清除小鼠肝脏内的虫体都有较好疗效。弓形虫感染小鼠后可侵犯全身各脏器，造成多种多样不同程度的损伤，因此，本实验中单一对肝脏的检测仅可作为考察疗效的一项参考指标。
参考文献
1，卢慎.1991.弓形虫在病理切片组织中的形态学研究.中国人兽共患病杂志，7(5)：43～44.
2，孙志伟.1995.青蒿素衍生物ME-908对弓形虫核酸代谢的影响.中国人兽共患病杂志，11(6)：78～80.
3，李爽，齐志群，甘绍伯，等.1998.双氢青蒿素对弓形虫超微结构的影响.中国人兽共患病杂志，14(5)：99～100.
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4，欧阳，Krng and E.C.Marr 1991.青蒿素抗弓形虫作用的实验研究.中国人兽共患病杂志，7(5)：63.
5，Burg,J.L.,M.Grover,P. Pouletty et al. 1989 Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan,Toxoplasma gondii by polymerase chain reaction. J.Clin.Microbiol. 27：1787～1792.
6，Georgiev,V.S. 1994 Management of toxoplasmosis. Drugs 48(2)：179～188.
7，Haverkos,H.W.1987 Assessment of therapy for toxoplasma encephalitis. Am.J.Med.82：907～914.
8，Louis,M.W.,A.U.Stephen,S.Miklos et al. 1991 Sensitive and specific detection of toxoplasma DNA in an experimental murine model:use of toxoplasma gondii-specific cDNA and the polymerase chain reaction. J.Infect.Dis. 163：180～186.
收稿日期：1999-08-03, 百拇医药