非肥胖型糖尿病小鼠胰腺淋巴管分布及微细结构的酶组织化学研究
作者：纪瑞成 Kato Seiji* Usui Takeshi**
单位：山东医科大学解剖学教研室，济南 250012；**Department of Anatomy and *Human Biology,Oita Medical University, Oita 879-55, Japan
关键词：酶组织化学染色；5′-Nase；淋巴管；胰腺；NOD小鼠
解剖学报980111
摘 要 应用酶组织化学的方法对非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠胰腺
淋巴管的分布及微细结构进行了光镜及电镜观察。5′-核苷酸酶(5′-Nase)阳性小叶间
, 百拇医药
淋巴管具有明显的神经支配和丰富的瓣膜，分布于整个胰腺。小叶内毛细淋巴管虽有
典型的结构特征，如不规则的管腔、极薄的管壁和淋巴管内皮细胞的独特连接方式(端
端、重叠与指状突起连接)，但数量很少，其分布相对独立于毛细血管(碱性磷酸酶，即
ALPase阳性)。胰岛周围淋巴细胞浸润出现在生后4～5周，并开始于近血管或淋巴管一
侧。糖尿病发病后，血糖浓度在短期内急剧上升，胰岛由严重的淋巴细胞浸润转化为
β细胞脱颗粒及坏死。淋巴管内一般充满大量淋巴细胞。淋巴管内皮细胞内小泡明显
增多，并有广泛的细胞质突起。其开放性细胞间连接均匀地附着有5-Nase反应颗粒，形成了相当大的细胞间通路(500～1500nm)，可见细胞或纤维碎片从组织间隙经此进入
, 百拇医药
淋巴管腔。结果提示，糖尿病胰腺的淋巴管对浸润的淋巴细胞、坏死的细胞成分和某
些溶质等的转运具有重要的作用。
非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic, NOD)小鼠，是1974年Tochino[1]在日本发现的
一种自身免疫性糖尿病病理模型。1980年Makino[2]进一步从商业性Jcl-ICR杂交克隆分
离、纯化，以至发展成为一种胰岛素依赖型糖尿病纯系动物株。有关这种小鼠胰岛的
进行性、选择性淋巴细胞浸润和β细胞坏死的研究已有较详细的报道。近期的实验研
究表明：某些器官出现血管构筑异常，如毛细血管内皮细胞的非细胞性改变及基膜增
, http://www.100md.com
厚[3～4]。但有关糖尿病胰腺淋巴管的形态观察及其在病理过程中所起的作用报道极少。
本实验旨在用酶组织化学方法，(1) 描述糖尿病小鼠胰腺的小叶间与小叶内淋巴管的分
布及微细结构的改变；(2) 研究淋巴形成的部位和淋巴管内皮细胞对浸润的淋巴细胞及
某些溶质的转运途径；(3) 探讨淋巴管病理改变、淋巴细胞浸润(自身免疫性胰岛炎)及
高血糖之间的可能内在联系。
材料和方法
NOD雄、雌性小鼠各25只，体重25～37g。乙醚麻醉，经主动脉逆行插管，低温氯
, http://www.100md.com
化钙甲醛(含4%甲醛，1%氯化钙)固定液灌注。于生后0～35d、35～90d、90～210d和
210～400d 4个阶段分别取材观察。除采用自身对照外，还设定BALB/c正常对照组小鼠
10只。血糖高于2.5g/L,并持续出现尿糖，则定为糖尿病发病。
切取的组织块一部分进一步浸润固定后，乙二醇甲基丙烯酸树脂(JB2,Polysciences,Inc,Pa,USA)低温包埋，或OCT化合物(OCT compound，Miles,USA)-80℃冷冻包埋。OCT
切片采用-18℃恒冷切片机。电镜组织块取自胰头、体、尾。
1.一般组织学分析
, http://www.100md.com
HE染色用于检查淋巴细胞的浸润程度，组织学判定标准为：0：胰岛组织未见淋巴
细胞；1：浸润的淋巴细胞可见于胰腺导管和血管周围或仅占胰岛总面积的25%以下；
2：浸润面积为25%～50%；3：严重程度的胰岛炎(浸润面积达50%以上)，并可见明显
的β细胞坏死像。每一动物标本观察50个胰岛，最后进行综合评价。
2.酶组织化学染色
2.1 光镜观察：5′-Nase染色液含0.2mol/L Tris-maleat缓冲液(pH7.2);2.9mmol/L腺
苷-5′-单磷酸(AMP，钠盐为二酶作用物，Sigma, USA); 3.6mmol/L硫酸镁(酶激活剂)；
, 百拇医药
3.6mmol/L硝酸铅(捕捉剂)和7%葡萄糖[5]。另添加2mmol/L非特异性ALPase抑制剂-左旋
咪唑[6]。反应条件为37℃，30～90min。二甲胂酸盐缓冲液(含7%葡萄糖)冲洗后，用1%
硫化铵室温下进行1～3min的呈色反应。5′-Nase处理后的部分切片可继续进行ALPase
染色反应(4℃,30～60min)，其染色液配制方法为：先将40mg萘酚-AS-Mx-磷酸盐(钠盐，Sigma)溶于2mlN,N-Dimethylformamide，再将40mg fast blue BB salt (Sigma)溶于40ml
0.1mol/L Tris-HCl (pH8.5)缓冲液，混合过滤后使用[7]。
, 百拇医药
2.2 扫描及反射电镜：光镜检查后的冷冻切片或组织块孵育于上述5′-Nase反应液
中，乙醇脱水，丁醇冷冻干燥处理，炭喷涂标本(20～30nm)以防止电荷造成的假象。
日立S-800扫描电镜装有GW30反射电子探头，观察电压20kV，焦点距离10mm[8]。
2.3 透射电镜：采用两种5′-Nase染色液，一是腺苷酸-铅反应液(pH7.2)，含
0.2mol/LTris-maleate缓冲液20ml；腺苷-5-单磷酸25mg；0.1mol/L硫酸镁5ml葡萄糖3～
4g；蒸馏水22ml和硝酸铅1.5ml[9]。另一种为腺苷酸-铈反应液，含0.2mol/L Tris-maleate
, http://www.100md.com
缓冲液(pH7.4) 20ml；腺苷-5′-单磷酸16mg；20mmol/L氯化镁(酶激活剂)4ml；葡萄糖
2g；蒸馏水12ml和20mmol/L氯化铈4ml。于各染色液中添加左旋咪唑以获得特异性反
应[10]。ALPase反应液含0.2mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.5)7ml；0.015mol/L硫酸镁13ml;
3% β-磷酸甘油(酶作用物)10ml，葡萄糖3～4g和枸橼酸铅(捕捉剂)20ml[11]。反应条件
均为37℃，25～30min。5′-Nase-ALPse双重染色法不适应于电镜组织块。对照组采用：
(1) 省去酶作用物；(2) 将特异抑制剂50mmol/L氯化镍或5mmol/L左旋咪唑添加于标准反
, 百拇医药
应液中；(3) 反应前将酶于37℃，60min条件下灭活。厚100～120μm组织切片经酶组化
染色后，2%四氧化锇4℃，2h后固定，乙醇逐级脱水，环氧聚合树脂包埋。1μm半薄
切片经0.1%甲苯胺蓝染色以初步鉴定内、外分泌组织的淋巴管或血管的一般外形与分
布。超薄切片经乙酸双氧铀染色或无需进一步染色，在JEOL-100CX或1200EX电镜观
察。
结 果
1. 胰岛炎
本实验所观察的NOD小鼠株，60%雌性和20%雄性于生后270d出现了显性糖尿病。
, 百拇医药
发病后20只NOD小鼠血糖平均值5.4585g/L(2.98～7.48g/L)，明显高于发病前平均值
1.2656g/L(0.95～1.6g/L)和BALB/c正常小鼠的平均值1.2363g/L(1.17～1.34g/L)(P<0.001)。
淋巴细胞浸润胰岛(胰岛炎)最早发生于生后30～35d，到生后210d高达84%以上。动物
早期阶段(生后90d内)，血糖一般在正常水平，未见胰岛细胞脱颗粒(图1a)。有时可见
轻微胰岛炎，胰岛的淋巴细胞浸润始于靠血管或淋巴管一侧，淋巴细胞围绕胰岛、导
管和毛细血管。随着血糖浓度的增加，浸润扩散至胰岛外周部，β细胞出现某种程度
的脱颗粒。发病后，典型的胰腺表现为进行性胰岛炎，β细胞质内线粒体等膜性结构
, 百拇医药
的膨胀及轻度细胞核固缩(图1b)。严重程度的胰岛炎可见β细胞坏死像。发病末期胰岛
以大量β细胞成分的绝对丧失和胰岛的退行性变为特征，浸润的淋巴细胞数量已明显
减少。如未经任何处理，小鼠多在发病后3～6周死亡。30只210d未发病的小鼠中22只
出现不同程度的胰岛炎。胰岛β细胞外的其他内分泌细胞及胰外分泌部细胞未见结构
改变。
2.小叶间淋巴管
5′-Nase阳性小叶间淋巴管局限于腺小叶之间，与小叶间微动脉、微静脉及胰腺
导管等伴行(图1c,d;2a,b)。生后90d即可见突向管腔或基底面的淋巴管内皮皱褶。5′-
, http://www.100md.com
Nase反应颗粒主要分布于内皮细胞的管腔与基底面及某些细胞器的膜表面(图2a,b)。聚
集于淋巴管腔内的淋巴细胞通常具有较强的5′-Nase反应活性(图2b)。淋巴管壁附近可
见无髓神经纤维分布，但未见直接与淋巴管壁接触。小叶间淋巴管具有典型的两叶瓣
膜，阳性反应颗粒也均匀地附着于瓣膜的表面。随着显性糖尿病的发生，淋巴管壁有
时可见淋巴细胞穿过。糖尿病持续2～3周的动物，淋巴管内皮细胞明显地向管腔内突
起，突起的尖端偶尔延伸至管壁的对侧，但其接触面上仍可见明显的反应颗粒附着(图
2a)。小叶间淋巴管的基膜未发现明显改变。
, http://www.100md.com
3.小叶内淋巴管
5′-Nase阳性小叶内淋巴管光镜下染成棕褐色，位于胰腺小叶内并靠近腺细胞；
ALPase阳性小叶内毛细血管染成蓝色，很少与毛细淋巴管伴行。动物早期阶段(生后
90d内)，未见明显结构改变，淋巴管壁极薄而不规则，内皮细胞间以端端、重叠和指
状突起连接为特征。结缔组织中可见到围绕淋巴管较少的弹性纤维和胶原纤维，但无
明显基膜。胰岛炎出现后，淋巴管内皮细胞和突起明显增加。糖尿病期小鼠的显著特
征是在小叶内淋巴管出现宽大的开放性(500～1500nm)细胞间连接，大量的细胞及纤维
, http://www.100md.com
碎片通过该途径从组织间隙进入淋巴管(图2c,d)。有时可见胰腺小叶内新生的毛细淋巴
管，这些淋巴管的5′-Nase活性低，反应颗粒大多散在于内皮细胞中。细胞质富含游
离核糖体和粗面内质网，但小泡极少。新生淋巴管周围常可见成纤维细胞。
4.毛细血管
35d前无胰岛炎状态的胰腺毛细血管壁均较平滑、整齐(图2e)。35～90d胰岛炎出现
后多表现为细胞突起和内皮小泡的增加(图2f)。糖尿病发病后，血管壁部分区域增厚、内皮细胞微小突起明显增多、孔(fenestration)减少、间质组织水肿。可见大量淋巴细胞
附着于管腔外周，逐渐向胰岛实质内部浸润。另外，胰腺内分泌部毛细血管ALPase活
, http://www.100md.com
性明显降低，内皮细胞突起多见于外分泌部。糖尿病末期NOD小鼠胰岛毛细血管与发
病前或正常BALB/c小鼠的毛细血管相比，走行较僵硬，管腔粗细不一，较多的胶原纤
维围绕毛细血管。未见小动脉瘤等改变。
NOD小鼠糖尿病:胰岛炎、高血糖和淋巴管的相互关系示意图
NOD mouse;Showingthe relationship among insulitis,byperglycemia and lymphatics.
讨 论
5′-核苷酸酶(5′-Nase)已广泛用于哺乳类动物的某些器官，以研究淋巴管的分布
, http://www.100md.com
及超微结构，尤其是与碱性磷酸酶(ALPase)阳性毛细血管的相互关系[12～14]。本实验采
用此方法证明：NOD小鼠的5′-Nase阳性小叶间淋巴管分布于整个胰腺，多与血管、胰腺导管伴行；小叶内毛细淋巴管数量少分布稀疏，走行相对独立于毛细血管。5′-
Nase-ALP双重染色的OCT或JB4切片可清楚地分辩同一视野的淋巴管与血管，甚至在某
种意义上可用来分析淋巴细胞的酶活性和浸润程度。铈反应颗粒细小、电子密度高，均
匀连续地分布于淋巴管内皮细胞或某些细胞器的膜表面。酶组织化学方法可确切地在
一般分布或超微结构上定位与分析淋巴管，是研究淋巴管的重要手段之一。
, http://www.100md.com
5′-Nase阳性小叶内淋巴管作为吸收性淋巴管，以盲端起于小叶内并紧邻腺细胞。
我们认为，这些分布稀疏的小叶内淋巴管的盲端就是胰腺淋巴引流的最初部位，而具有
明显神经支配和丰富瓣膜的小叶间淋巴管在小叶内淋巴向胰外引流的过程中起重要的调
节作用[14]。随着病程发展，腺小叶内可见新生的毛细淋巴管，其内皮细胞的结构特征
提示新生期较为低下的吸收功能，但这可能有助于病理状态下淋巴管网的代偿性发育。
已有报道，NOD小鼠糖尿病的发病原因主要由于来自胸腺的T淋巴细胞(L3T4和Lyt2)
浸润胰岛[1]。炎症的进展，使某些动物产生诸如β细胞脱颗粒和坏死的结构改变，导致
, 百拇医药
内源性胰岛素分泌不足，血糖在短期内明显增高。有的研究表明：糖尿病胰岛素缺乏，细胞外血糖浓度增高，造成糖蛋白、山梨(糖)醇、糖原及脂类等的代谢异常[4]。一般来
讲，糖尿病患者或实验模型(动物)的微小血管功能异常先于其结构改变，长期增加的
血浆蛋白渗出及其在微小血管壁的沉着，是微小血管从功能异常向病理形态转化的关
键因素。所以，局部微循环障碍和代谢产物及炎性刺激物的聚积，可能是淋巴管通透
性增强、内皮细胞间连接和细胞成分改变的直接或间接原因。本实验发现，NOD小鼠
胰腺淋巴管内皮细胞最显著的特征是具有开放性细胞间连接。正常状态下，胰腺淋巴
管几乎不存在开放性连接，与肝、肾和甲状腺的非常相似。在这些器官中，小泡转运
, http://www.100md.com
途径或其他因素(膜扩散、细胞内通路)是液体和颗粒成分通过淋巴管内皮细胞的主要
方式[14,15]。糖尿病胰腺的小叶内淋巴管紧邻腺泡，其内皮细胞所形成的宽大的开放性
细胞间通道，可能对过多的组织液的吸收、浸润的淋巴细胞、坏死的细胞碎片、某些
溶质及局部组织中激素的转运起到极为重要的作用。因此，进一步探讨有关代谢产物
聚积引起淋巴管通透性与结构改变的机理以及多脏器淋巴管改变，将会促进对糖尿病
状态下微循环的再认识。
本文承蒙章静波教授的热情帮助，在此深表感谢。
收稿1996-11 修回 1997-06
, 百拇医药
本文图1a～2f见插图第9，10页
图 版 说 明
图1a 生后30dNOD小鼠，浸润的淋巴细胞(LC)仅见于胰岛外周，尚未侵入胰岛内部。
胰岛细胞(A：α细胞，B：β细胞)无脱颗粒现象。×1 500
b 生后207d NOD小鼠，高血糖持续14d。胰岛出现明显淋巴细胞(LC)浸润，β细胞可
见明显脱颗粒与空泡变性以及轻度细胞核(N)固缩和线粒体膨胀。×3 000
c 5′-Nase阳性小叶间淋巴管(LV)的反射电镜像表现为轮廓分明的强光反射区(high
, http://www.100md.com
light)，与小叶间微血管(BV)形成明显的对比。×300
d 是图1c同一视野的普通扫描电镜像，小叶间淋巴管(LV)与小叶间微血管(BV)伴行于
小叶间结缔组织内。 ×300
图2a 糖尿病发病期小鼠，5′-Nase反应颗粒均匀地分布于小叶间淋巴管(LV)内皮细胞
的管腔面及某些细胞器的表面。内皮细胞明显突向管腔内(↑)，并在多处突向周
围结缔组织(▲)。内皮细胞的小泡增多。小叶间腺导管(D)无5′-Nase反应活性。
×2 500
, http://www.100md.com
b 高血糖出现7d NOD小鼠，淋巴细胞聚集于小叶间淋巴管(LV)内，具有较强的5′-
Nase反应活性。小叶间微血管(BV)无阳性反应颗粒附着。×3 000
c 糖尿病发病期，小叶内淋巴管(LV)内皮细胞可见明显的开放性细胞间连接(*)，大量
细胞和纤维碎片从组织间隙经此进入淋巴管。2 000
d 5′-Nase阳性小叶内淋巴管(LV)显示反应颗粒分布于内皮细胞间的指状突起(↑)和
开放性连接(*)的膜表面。×10 000
e 生后30d NOD小鼠ALPase阳性毛细血管(c)显示平滑、整齐的血管壁和反应颗粒的附
, 百拇医药
着。 ×6 600
f 生后53d胰岛炎出现后，毛细血管(c)内皮细胞突起增多，ALPase铅反应颗粒粗大，散在于内皮细胞的膜表面。 ×8 300
Explanationof figures
Fig.1a 30-day-old NODmouse, infiltrated lymphocytes (LC) are only seen near the islet,but
do not invade the inside of the islet. Nodegranulation can be found in islet cells (A: α
cell, B:β cell). ×1 500
, 百拇医药
b 207-day-old NOD mouse, hyperglycemia wassustained for 14 days. The islet represents
obvious lymphocyte (LC) infiltraton. β-cellshows conspicuous damages:degranulation,vacuolated granules, slight pyknosis (N)and swollen mitochondria. ×3 000
c Backscattered electron image (BEI)photograph of 5′-Nase-positive interlobular
lymphatic (LV) shows a strong highlight,contrasting sharply with interlobular blood
, 百拇医药
vesels (BV). ×300
d Scanning electron microscopy (SEM) viewof the same field as shown in Figure 1c.
A interlobular lymphatic (LV) accompaniesblood vessels (BV) in the interlobular
connective tissue. ×300
Fig.2a In diabetic stage, 5′-Nase reaction precipitates areregularly distributed in the luminal
surface and the membrane of some organellsin the interlobular lymphatic (LV). The
, 百拇医药
endothelium of interlobular lymphaticobviously protrudes into the cavity (arrow) and
the surrounding connective tissue inseveral areas (arrow heads). Pinocytotic vesicles
increase in the lymphatic endothelium. 5′-Nasereaction activity is not seen in the
interlobular duct (D). ×2 500
b NOD mouse on the seventh day afterhyperglycemia, lymphocytes with high 5′-Nase
, http://www.100md.com
reaction activity accumulate in theinterlobular lymphatic (LV). No positive granules can
be seen in the interlobular blood vessel(BV) ×3 000
c In diabetic stage, the endothelium ofintralobular lymphatic (LV) represents obvious open
intercellular junctions (asterisks),through which much debris of cells or fibers enters the
lymphatic cavity. ×2 000
, http://www.100md.com
d 5′-Nase-positive intralobularlymphatic (LV) shows that reaction granules are distribu-
ted in the membrane of the interdigitating(arrow) and open junctions (asterisk). ×10 000
e 30-day-old NOD mouse, ALPase-positiveblood capillary (c) has a smooth and regular
wall attached with reaction precipitates. ×6 600
f 53-day-old NOD mouse with insulitis, theendothelial protrusions and pinocytotic vesicles
, http://www.100md.com
increase in the blood capillary (c).ALPase-lead-based granules are large and scattered
in the membrane of endothelium. ×8 300
参 考 文 献
[1] Tochino Y. Discoveryand breeding of the NOD mouse. Insulitis and Type I Diabetes.
Japan:Academic Press Inc, 1986:3-10
[2] Makino S, Kunimoto K, Muraoka Y, et al. Breeding of anon-obese, diabetic strain
, http://www.100md.com
of mice. Exp Anim, 1980, 29(1):1
[3] Lorenzi M, Cagliero E. Pathobiology of endothelial and othervascular cells in diabetes
mellitus. Diabetes, 1991, 40(6):653
[4] Tooke JE. Microvascular function in human diabetes. Diabetes,1995, 44(7):721
[5] Wachstein M, Meisel E. Histochemistry of hepatic phosphataseat physiologic pH.Am J
, http://www.100md.com Clin Pathol, 1957, 27(1):13
[6] Kato S, Miyauchi R. Enzyme-histochemical visualization oflymphatic capillaries in the
mouse tongue:Light and electronmicroscopic study. Okajimas Folia Anat Jpn, 1989,65(9):391
[7] Burstone MS. Phosphatase. Enzyme histochemistry and itsapplication in the study of
neoplasma. New York and London:AcademicPress, 1962:160-292
, http://www.100md.com
[8] Kato S, Gotoh M. Application of backscattered electronimaging to enzyme histochemistry
of lymphatic capillaries. J ElectronMicrosc, 1990,39(3):186
[9] Uusitalo RJ, Karnovsky MJ. Surface localization of 5′-nucleotidaseon the mouse
lymphocytes. J Histochem Cytochem, 1977,25(2):87
[10] Robinson JM, Karnovsky MJ. Ultrastructural localization of 5′-nucleotidasein guinea
, http://www.100md.com
pig neutrophils based upon the use ofcerium as capturing agent. J Histochem Cytochem,1983, 31(10):1190
[11] Mayahara H, Hirano H, Saito T, et al. The new lead citratemethod for the ultracyto-
chemical demonstration of activity ofnon-specific alkaline phosphatase (Orthophosphoric
mononuclear phosphohydrase). Histochemie,1967, 11(1):88
[12] Kato S, Itonaga I, Ji RC, et al. Enzyme triple staining fordifferentiation of lymphatics from
, 百拇医药
venous and arterial capillaries.Lymphology, 1996, 29(1);15
[13] Ji RC, Kato S, Miura M, et al. The distribution andarchitecture of lymphatic vessels in the
rat stomach as revealed by anenzyme-histochemical method. Okajimas Folia Anat Jpn,1996, 73(1):37
[14] Ji RC, Kato S. Demonstration of the intralobular lymphaticsin the guinea pig pancreas by
an enzyme-histochemical method.JAnat,1997,(in press)
, http://www.100md.com
[15] O′Morchoe PJ, Han Y, Doyle MD, et al.Lymphatic system of the thyroid gland in the
rat. Lymphology, 1987,20(1):10
FINEDISTRIBUTION AND ULTRASTRUCTURE OF LYMPHATIC
VESSELS IN THE NOD MICE PANCREAS:
AN ENZYME-HISTOCHEMICAL STUDY
JiRuicheng△,Kato Seiji*, Usui Takeshi**(Departmentof Anatomy, Shandong Medical University, Jinan; **Departmentsof Anatomy and
, 百拇医药
*Human Biolgoy, Oita MedicalUniversity, Oita 879-55, Japan)
Fine distribution and structure oflymphatics and their relationship to insulitis were
examined in the pancreas of non-obese diabetic (NOD) miceenzyme-histochemically by
combined light and electron microscopy. Interlobular 5′-nucleotidase(5′-Nase)-positive
lymphatics with active innervatoin and rich lymphatic valves werepresent throughout the
, http://www.100md.com
pancreas, but intralobular ones were relatively rare andindependent even though they had
typical structural characteristics, such as very thin andindented wall, and intercellular
junctions (end to end, overlapping and interdigitating).Lymphocyte infiltration, usually
appeared in the islet from 4-5 weeks after birth and began fromthe area adjacent to blood
vessels or lymphatics. As the infiltration become severe, theblood glucose increased and the
, 百拇医药
diabetes occurred. The degranulation and necrosis of β cellswere noted during the last stage
of the diabetes. Lymphatics were filled with a large number oflymphocytes. A lot of pinocy-
totic vesicles and extensive cytoplasmic protrusions were foundin the lymphatic endothelium.
It was noteworthy that open intercellular junctions of thelymphatic endothelium adorned with
, 百拇医药
5′-Nase reaction product, formed a widepathway (500-1500nm) for the debris of cells or
fibers. The results suggested that lymphatics may play animportant role in the transport of infil-
trated lymphocytes and destructed cell components or some solutesin the diabetic pancreas. KEY WORDS Enzyme-histochemicalstaining; 5′-nucleotidase (5′-Nase); Lympha-
tics; Pancreas; NOD mouse
_______________________
△Department of Anatomy, Oita MedicalUniversity, Oita 879-55, Japan, http://www.100md.com
单位：山东医科大学解剖学教研室，济南 250012；**Department of Anatomy and *Human Biology,Oita Medical University, Oita 879-55, Japan
关键词：酶组织化学染色；5′-Nase；淋巴管；胰腺；NOD小鼠
解剖学报980111
摘 要 应用酶组织化学的方法对非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠胰腺
淋巴管的分布及微细结构进行了光镜及电镜观察。5′-核苷酸酶(5′-Nase)阳性小叶间
, 百拇医药
淋巴管具有明显的神经支配和丰富的瓣膜，分布于整个胰腺。小叶内毛细淋巴管虽有
典型的结构特征，如不规则的管腔、极薄的管壁和淋巴管内皮细胞的独特连接方式(端
端、重叠与指状突起连接)，但数量很少，其分布相对独立于毛细血管(碱性磷酸酶，即
ALPase阳性)。胰岛周围淋巴细胞浸润出现在生后4～5周，并开始于近血管或淋巴管一
侧。糖尿病发病后，血糖浓度在短期内急剧上升，胰岛由严重的淋巴细胞浸润转化为
β细胞脱颗粒及坏死。淋巴管内一般充满大量淋巴细胞。淋巴管内皮细胞内小泡明显
增多，并有广泛的细胞质突起。其开放性细胞间连接均匀地附着有5-Nase反应颗粒，形成了相当大的细胞间通路(500～1500nm)，可见细胞或纤维碎片从组织间隙经此进入
, 百拇医药
淋巴管腔。结果提示，糖尿病胰腺的淋巴管对浸润的淋巴细胞、坏死的细胞成分和某
些溶质等的转运具有重要的作用。
非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic, NOD)小鼠，是1974年Tochino[1]在日本发现的
一种自身免疫性糖尿病病理模型。1980年Makino[2]进一步从商业性Jcl-ICR杂交克隆分
离、纯化，以至发展成为一种胰岛素依赖型糖尿病纯系动物株。有关这种小鼠胰岛的
进行性、选择性淋巴细胞浸润和β细胞坏死的研究已有较详细的报道。近期的实验研
究表明：某些器官出现血管构筑异常，如毛细血管内皮细胞的非细胞性改变及基膜增
, http://www.100md.com
厚[3～4]。但有关糖尿病胰腺淋巴管的形态观察及其在病理过程中所起的作用报道极少。
本实验旨在用酶组织化学方法，(1) 描述糖尿病小鼠胰腺的小叶间与小叶内淋巴管的分
布及微细结构的改变；(2) 研究淋巴形成的部位和淋巴管内皮细胞对浸润的淋巴细胞及
某些溶质的转运途径；(3) 探讨淋巴管病理改变、淋巴细胞浸润(自身免疫性胰岛炎)及
高血糖之间的可能内在联系。
材料和方法
NOD雄、雌性小鼠各25只，体重25～37g。乙醚麻醉，经主动脉逆行插管，低温氯
, http://www.100md.com
化钙甲醛(含4%甲醛，1%氯化钙)固定液灌注。于生后0～35d、35～90d、90～210d和
210～400d 4个阶段分别取材观察。除采用自身对照外，还设定BALB/c正常对照组小鼠
10只。血糖高于2.5g/L,并持续出现尿糖，则定为糖尿病发病。
切取的组织块一部分进一步浸润固定后，乙二醇甲基丙烯酸树脂(JB2,Polysciences,Inc,Pa,USA)低温包埋，或OCT化合物(OCT compound，Miles,USA)-80℃冷冻包埋。OCT
切片采用-18℃恒冷切片机。电镜组织块取自胰头、体、尾。
1.一般组织学分析
, http://www.100md.com
HE染色用于检查淋巴细胞的浸润程度，组织学判定标准为：0：胰岛组织未见淋巴
细胞；1：浸润的淋巴细胞可见于胰腺导管和血管周围或仅占胰岛总面积的25%以下；
2：浸润面积为25%～50%；3：严重程度的胰岛炎(浸润面积达50%以上)，并可见明显
的β细胞坏死像。每一动物标本观察50个胰岛，最后进行综合评价。
2.酶组织化学染色
2.1 光镜观察：5′-Nase染色液含0.2mol/L Tris-maleat缓冲液(pH7.2);2.9mmol/L腺
苷-5′-单磷酸(AMP，钠盐为二酶作用物，Sigma, USA); 3.6mmol/L硫酸镁(酶激活剂)；
, 百拇医药
3.6mmol/L硝酸铅(捕捉剂)和7%葡萄糖[5]。另添加2mmol/L非特异性ALPase抑制剂-左旋
咪唑[6]。反应条件为37℃，30～90min。二甲胂酸盐缓冲液(含7%葡萄糖)冲洗后，用1%
硫化铵室温下进行1～3min的呈色反应。5′-Nase处理后的部分切片可继续进行ALPase
染色反应(4℃,30～60min)，其染色液配制方法为：先将40mg萘酚-AS-Mx-磷酸盐(钠盐，Sigma)溶于2mlN,N-Dimethylformamide，再将40mg fast blue BB salt (Sigma)溶于40ml
0.1mol/L Tris-HCl (pH8.5)缓冲液，混合过滤后使用[7]。
, 百拇医药
2.2 扫描及反射电镜：光镜检查后的冷冻切片或组织块孵育于上述5′-Nase反应液
中，乙醇脱水，丁醇冷冻干燥处理，炭喷涂标本(20～30nm)以防止电荷造成的假象。
日立S-800扫描电镜装有GW30反射电子探头，观察电压20kV，焦点距离10mm[8]。
2.3 透射电镜：采用两种5′-Nase染色液，一是腺苷酸-铅反应液(pH7.2)，含
0.2mol/LTris-maleate缓冲液20ml；腺苷-5-单磷酸25mg；0.1mol/L硫酸镁5ml葡萄糖3～
4g；蒸馏水22ml和硝酸铅1.5ml[9]。另一种为腺苷酸-铈反应液，含0.2mol/L Tris-maleate
, http://www.100md.com
缓冲液(pH7.4) 20ml；腺苷-5′-单磷酸16mg；20mmol/L氯化镁(酶激活剂)4ml；葡萄糖
2g；蒸馏水12ml和20mmol/L氯化铈4ml。于各染色液中添加左旋咪唑以获得特异性反
应[10]。ALPase反应液含0.2mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.5)7ml；0.015mol/L硫酸镁13ml;
3% β-磷酸甘油(酶作用物)10ml，葡萄糖3～4g和枸橼酸铅(捕捉剂)20ml[11]。反应条件
均为37℃，25～30min。5′-Nase-ALPse双重染色法不适应于电镜组织块。对照组采用：
(1) 省去酶作用物；(2) 将特异抑制剂50mmol/L氯化镍或5mmol/L左旋咪唑添加于标准反
, 百拇医药
应液中；(3) 反应前将酶于37℃，60min条件下灭活。厚100～120μm组织切片经酶组化
染色后，2%四氧化锇4℃，2h后固定，乙醇逐级脱水，环氧聚合树脂包埋。1μm半薄
切片经0.1%甲苯胺蓝染色以初步鉴定内、外分泌组织的淋巴管或血管的一般外形与分
布。超薄切片经乙酸双氧铀染色或无需进一步染色，在JEOL-100CX或1200EX电镜观
察。
结 果
1. 胰岛炎
本实验所观察的NOD小鼠株，60%雌性和20%雄性于生后270d出现了显性糖尿病。
, 百拇医药
发病后20只NOD小鼠血糖平均值5.4585g/L(2.98～7.48g/L)，明显高于发病前平均值
1.2656g/L(0.95～1.6g/L)和BALB/c正常小鼠的平均值1.2363g/L(1.17～1.34g/L)(P<0.001)。
淋巴细胞浸润胰岛(胰岛炎)最早发生于生后30～35d，到生后210d高达84%以上。动物
早期阶段(生后90d内)，血糖一般在正常水平，未见胰岛细胞脱颗粒(图1a)。有时可见
轻微胰岛炎，胰岛的淋巴细胞浸润始于靠血管或淋巴管一侧，淋巴细胞围绕胰岛、导
管和毛细血管。随着血糖浓度的增加，浸润扩散至胰岛外周部，β细胞出现某种程度
的脱颗粒。发病后，典型的胰腺表现为进行性胰岛炎，β细胞质内线粒体等膜性结构
, 百拇医药
的膨胀及轻度细胞核固缩(图1b)。严重程度的胰岛炎可见β细胞坏死像。发病末期胰岛
以大量β细胞成分的绝对丧失和胰岛的退行性变为特征，浸润的淋巴细胞数量已明显
减少。如未经任何处理，小鼠多在发病后3～6周死亡。30只210d未发病的小鼠中22只
出现不同程度的胰岛炎。胰岛β细胞外的其他内分泌细胞及胰外分泌部细胞未见结构
改变。
2.小叶间淋巴管
5′-Nase阳性小叶间淋巴管局限于腺小叶之间，与小叶间微动脉、微静脉及胰腺
导管等伴行(图1c,d;2a,b)。生后90d即可见突向管腔或基底面的淋巴管内皮皱褶。5′-
, http://www.100md.com
Nase反应颗粒主要分布于内皮细胞的管腔与基底面及某些细胞器的膜表面(图2a,b)。聚
集于淋巴管腔内的淋巴细胞通常具有较强的5′-Nase反应活性(图2b)。淋巴管壁附近可
见无髓神经纤维分布，但未见直接与淋巴管壁接触。小叶间淋巴管具有典型的两叶瓣
膜，阳性反应颗粒也均匀地附着于瓣膜的表面。随着显性糖尿病的发生，淋巴管壁有
时可见淋巴细胞穿过。糖尿病持续2～3周的动物，淋巴管内皮细胞明显地向管腔内突
起，突起的尖端偶尔延伸至管壁的对侧，但其接触面上仍可见明显的反应颗粒附着(图
2a)。小叶间淋巴管的基膜未发现明显改变。
, http://www.100md.com
3.小叶内淋巴管
5′-Nase阳性小叶内淋巴管光镜下染成棕褐色，位于胰腺小叶内并靠近腺细胞；
ALPase阳性小叶内毛细血管染成蓝色，很少与毛细淋巴管伴行。动物早期阶段(生后
90d内)，未见明显结构改变，淋巴管壁极薄而不规则，内皮细胞间以端端、重叠和指
状突起连接为特征。结缔组织中可见到围绕淋巴管较少的弹性纤维和胶原纤维，但无
明显基膜。胰岛炎出现后，淋巴管内皮细胞和突起明显增加。糖尿病期小鼠的显著特
征是在小叶内淋巴管出现宽大的开放性(500～1500nm)细胞间连接，大量的细胞及纤维
, http://www.100md.com
碎片通过该途径从组织间隙进入淋巴管(图2c,d)。有时可见胰腺小叶内新生的毛细淋巴
管，这些淋巴管的5′-Nase活性低，反应颗粒大多散在于内皮细胞中。细胞质富含游
离核糖体和粗面内质网，但小泡极少。新生淋巴管周围常可见成纤维细胞。
4.毛细血管
35d前无胰岛炎状态的胰腺毛细血管壁均较平滑、整齐(图2e)。35～90d胰岛炎出现
后多表现为细胞突起和内皮小泡的增加(图2f)。糖尿病发病后，血管壁部分区域增厚、内皮细胞微小突起明显增多、孔(fenestration)减少、间质组织水肿。可见大量淋巴细胞
附着于管腔外周，逐渐向胰岛实质内部浸润。另外，胰腺内分泌部毛细血管ALPase活
, http://www.100md.com
性明显降低，内皮细胞突起多见于外分泌部。糖尿病末期NOD小鼠胰岛毛细血管与发
病前或正常BALB/c小鼠的毛细血管相比，走行较僵硬，管腔粗细不一，较多的胶原纤
维围绕毛细血管。未见小动脉瘤等改变。
NOD小鼠糖尿病:胰岛炎、高血糖和淋巴管的相互关系示意图
NOD mouse;Showingthe relationship among insulitis,byperglycemia and lymphatics.
讨 论
5′-核苷酸酶(5′-Nase)已广泛用于哺乳类动物的某些器官，以研究淋巴管的分布
, http://www.100md.com
及超微结构，尤其是与碱性磷酸酶(ALPase)阳性毛细血管的相互关系[12～14]。本实验采
用此方法证明：NOD小鼠的5′-Nase阳性小叶间淋巴管分布于整个胰腺，多与血管、胰腺导管伴行；小叶内毛细淋巴管数量少分布稀疏，走行相对独立于毛细血管。5′-
Nase-ALP双重染色的OCT或JB4切片可清楚地分辩同一视野的淋巴管与血管，甚至在某
种意义上可用来分析淋巴细胞的酶活性和浸润程度。铈反应颗粒细小、电子密度高，均
匀连续地分布于淋巴管内皮细胞或某些细胞器的膜表面。酶组织化学方法可确切地在
一般分布或超微结构上定位与分析淋巴管，是研究淋巴管的重要手段之一。
, http://www.100md.com
5′-Nase阳性小叶内淋巴管作为吸收性淋巴管，以盲端起于小叶内并紧邻腺细胞。
我们认为，这些分布稀疏的小叶内淋巴管的盲端就是胰腺淋巴引流的最初部位，而具有
明显神经支配和丰富瓣膜的小叶间淋巴管在小叶内淋巴向胰外引流的过程中起重要的调
节作用[14]。随着病程发展，腺小叶内可见新生的毛细淋巴管，其内皮细胞的结构特征
提示新生期较为低下的吸收功能，但这可能有助于病理状态下淋巴管网的代偿性发育。
已有报道，NOD小鼠糖尿病的发病原因主要由于来自胸腺的T淋巴细胞(L3T4和Lyt2)
浸润胰岛[1]。炎症的进展，使某些动物产生诸如β细胞脱颗粒和坏死的结构改变，导致
, 百拇医药
内源性胰岛素分泌不足，血糖在短期内明显增高。有的研究表明：糖尿病胰岛素缺乏，细胞外血糖浓度增高，造成糖蛋白、山梨(糖)醇、糖原及脂类等的代谢异常[4]。一般来
讲，糖尿病患者或实验模型(动物)的微小血管功能异常先于其结构改变，长期增加的
血浆蛋白渗出及其在微小血管壁的沉着，是微小血管从功能异常向病理形态转化的关
键因素。所以，局部微循环障碍和代谢产物及炎性刺激物的聚积，可能是淋巴管通透
性增强、内皮细胞间连接和细胞成分改变的直接或间接原因。本实验发现，NOD小鼠
胰腺淋巴管内皮细胞最显著的特征是具有开放性细胞间连接。正常状态下，胰腺淋巴
管几乎不存在开放性连接，与肝、肾和甲状腺的非常相似。在这些器官中，小泡转运
, http://www.100md.com
途径或其他因素(膜扩散、细胞内通路)是液体和颗粒成分通过淋巴管内皮细胞的主要
方式[14,15]。糖尿病胰腺的小叶内淋巴管紧邻腺泡，其内皮细胞所形成的宽大的开放性
细胞间通道，可能对过多的组织液的吸收、浸润的淋巴细胞、坏死的细胞碎片、某些
溶质及局部组织中激素的转运起到极为重要的作用。因此，进一步探讨有关代谢产物
聚积引起淋巴管通透性与结构改变的机理以及多脏器淋巴管改变，将会促进对糖尿病
状态下微循环的再认识。
本文承蒙章静波教授的热情帮助，在此深表感谢。
收稿1996-11 修回 1997-06
, 百拇医药
本文图1a～2f见插图第9，10页
图 版 说 明
图1a 生后30dNOD小鼠，浸润的淋巴细胞(LC)仅见于胰岛外周，尚未侵入胰岛内部。
胰岛细胞(A：α细胞，B：β细胞)无脱颗粒现象。×1 500
b 生后207d NOD小鼠，高血糖持续14d。胰岛出现明显淋巴细胞(LC)浸润，β细胞可
见明显脱颗粒与空泡变性以及轻度细胞核(N)固缩和线粒体膨胀。×3 000
c 5′-Nase阳性小叶间淋巴管(LV)的反射电镜像表现为轮廓分明的强光反射区(high
, http://www.100md.com
light)，与小叶间微血管(BV)形成明显的对比。×300
d 是图1c同一视野的普通扫描电镜像，小叶间淋巴管(LV)与小叶间微血管(BV)伴行于
小叶间结缔组织内。 ×300
图2a 糖尿病发病期小鼠，5′-Nase反应颗粒均匀地分布于小叶间淋巴管(LV)内皮细胞
的管腔面及某些细胞器的表面。内皮细胞明显突向管腔内(↑)，并在多处突向周
围结缔组织(▲)。内皮细胞的小泡增多。小叶间腺导管(D)无5′-Nase反应活性。
×2 500
, http://www.100md.com
b 高血糖出现7d NOD小鼠，淋巴细胞聚集于小叶间淋巴管(LV)内，具有较强的5′-
Nase反应活性。小叶间微血管(BV)无阳性反应颗粒附着。×3 000
c 糖尿病发病期，小叶内淋巴管(LV)内皮细胞可见明显的开放性细胞间连接(*)，大量
细胞和纤维碎片从组织间隙经此进入淋巴管。2 000
d 5′-Nase阳性小叶内淋巴管(LV)显示反应颗粒分布于内皮细胞间的指状突起(↑)和
开放性连接(*)的膜表面。×10 000
e 生后30d NOD小鼠ALPase阳性毛细血管(c)显示平滑、整齐的血管壁和反应颗粒的附
, 百拇医药
着。 ×6 600
f 生后53d胰岛炎出现后，毛细血管(c)内皮细胞突起增多，ALPase铅反应颗粒粗大，散在于内皮细胞的膜表面。 ×8 300
Explanationof figures
Fig.1a 30-day-old NODmouse, infiltrated lymphocytes (LC) are only seen near the islet,but
do not invade the inside of the islet. Nodegranulation can be found in islet cells (A: α
cell, B:β cell). ×1 500
, 百拇医药
b 207-day-old NOD mouse, hyperglycemia wassustained for 14 days. The islet represents
obvious lymphocyte (LC) infiltraton. β-cellshows conspicuous damages:degranulation,vacuolated granules, slight pyknosis (N)and swollen mitochondria. ×3 000
c Backscattered electron image (BEI)photograph of 5′-Nase-positive interlobular
lymphatic (LV) shows a strong highlight,contrasting sharply with interlobular blood
, 百拇医药
vesels (BV). ×300
d Scanning electron microscopy (SEM) viewof the same field as shown in Figure 1c.
A interlobular lymphatic (LV) accompaniesblood vessels (BV) in the interlobular
connective tissue. ×300
Fig.2a In diabetic stage, 5′-Nase reaction precipitates areregularly distributed in the luminal
surface and the membrane of some organellsin the interlobular lymphatic (LV). The
, 百拇医药
endothelium of interlobular lymphaticobviously protrudes into the cavity (arrow) and
the surrounding connective tissue inseveral areas (arrow heads). Pinocytotic vesicles
increase in the lymphatic endothelium. 5′-Nasereaction activity is not seen in the
interlobular duct (D). ×2 500
b NOD mouse on the seventh day afterhyperglycemia, lymphocytes with high 5′-Nase
, http://www.100md.com
reaction activity accumulate in theinterlobular lymphatic (LV). No positive granules can
be seen in the interlobular blood vessel(BV) ×3 000
c In diabetic stage, the endothelium ofintralobular lymphatic (LV) represents obvious open
intercellular junctions (asterisks),through which much debris of cells or fibers enters the
lymphatic cavity. ×2 000
, http://www.100md.com
d 5′-Nase-positive intralobularlymphatic (LV) shows that reaction granules are distribu-
ted in the membrane of the interdigitating(arrow) and open junctions (asterisk). ×10 000
e 30-day-old NOD mouse, ALPase-positiveblood capillary (c) has a smooth and regular
wall attached with reaction precipitates. ×6 600
f 53-day-old NOD mouse with insulitis, theendothelial protrusions and pinocytotic vesicles
, http://www.100md.com
increase in the blood capillary (c).ALPase-lead-based granules are large and scattered
in the membrane of endothelium. ×8 300
参 考 文 献
[1] Tochino Y. Discoveryand breeding of the NOD mouse. Insulitis and Type I Diabetes.
Japan:Academic Press Inc, 1986:3-10
[2] Makino S, Kunimoto K, Muraoka Y, et al. Breeding of anon-obese, diabetic strain
, http://www.100md.com
of mice. Exp Anim, 1980, 29(1):1
[3] Lorenzi M, Cagliero E. Pathobiology of endothelial and othervascular cells in diabetes
mellitus. Diabetes, 1991, 40(6):653
[4] Tooke JE. Microvascular function in human diabetes. Diabetes,1995, 44(7):721
[5] Wachstein M, Meisel E. Histochemistry of hepatic phosphataseat physiologic pH.Am J
, http://www.100md.com Clin Pathol, 1957, 27(1):13
[6] Kato S, Miyauchi R. Enzyme-histochemical visualization oflymphatic capillaries in the
mouse tongue:Light and electronmicroscopic study. Okajimas Folia Anat Jpn, 1989,65(9):391
[7] Burstone MS. Phosphatase. Enzyme histochemistry and itsapplication in the study of
neoplasma. New York and London:AcademicPress, 1962:160-292
, http://www.100md.com
[8] Kato S, Gotoh M. Application of backscattered electronimaging to enzyme histochemistry
of lymphatic capillaries. J ElectronMicrosc, 1990,39(3):186
[9] Uusitalo RJ, Karnovsky MJ. Surface localization of 5′-nucleotidaseon the mouse
lymphocytes. J Histochem Cytochem, 1977,25(2):87
[10] Robinson JM, Karnovsky MJ. Ultrastructural localization of 5′-nucleotidasein guinea
, http://www.100md.com
pig neutrophils based upon the use ofcerium as capturing agent. J Histochem Cytochem,1983, 31(10):1190
[11] Mayahara H, Hirano H, Saito T, et al. The new lead citratemethod for the ultracyto-
chemical demonstration of activity ofnon-specific alkaline phosphatase (Orthophosphoric
mononuclear phosphohydrase). Histochemie,1967, 11(1):88
[12] Kato S, Itonaga I, Ji RC, et al. Enzyme triple staining fordifferentiation of lymphatics from
, 百拇医药
venous and arterial capillaries.Lymphology, 1996, 29(1);15
[13] Ji RC, Kato S, Miura M, et al. The distribution andarchitecture of lymphatic vessels in the
rat stomach as revealed by anenzyme-histochemical method. Okajimas Folia Anat Jpn,1996, 73(1):37
[14] Ji RC, Kato S. Demonstration of the intralobular lymphaticsin the guinea pig pancreas by
an enzyme-histochemical method.JAnat,1997,(in press)
, http://www.100md.com
[15] O′Morchoe PJ, Han Y, Doyle MD, et al.Lymphatic system of the thyroid gland in the
rat. Lymphology, 1987,20(1):10
FINEDISTRIBUTION AND ULTRASTRUCTURE OF LYMPHATIC
VESSELS IN THE NOD MICE PANCREAS:
AN ENZYME-HISTOCHEMICAL STUDY
JiRuicheng△,Kato Seiji*, Usui Takeshi**(Departmentof Anatomy, Shandong Medical University, Jinan; **Departmentsof Anatomy and
, 百拇医药
*Human Biolgoy, Oita MedicalUniversity, Oita 879-55, Japan)
Fine distribution and structure oflymphatics and their relationship to insulitis were
examined in the pancreas of non-obese diabetic (NOD) miceenzyme-histochemically by
combined light and electron microscopy. Interlobular 5′-nucleotidase(5′-Nase)-positive
lymphatics with active innervatoin and rich lymphatic valves werepresent throughout the
, http://www.100md.com
pancreas, but intralobular ones were relatively rare andindependent even though they had
typical structural characteristics, such as very thin andindented wall, and intercellular
junctions (end to end, overlapping and interdigitating).Lymphocyte infiltration, usually
appeared in the islet from 4-5 weeks after birth and began fromthe area adjacent to blood
vessels or lymphatics. As the infiltration become severe, theblood glucose increased and the
, 百拇医药
diabetes occurred. The degranulation and necrosis of β cellswere noted during the last stage
of the diabetes. Lymphatics were filled with a large number oflymphocytes. A lot of pinocy-
totic vesicles and extensive cytoplasmic protrusions were foundin the lymphatic endothelium.
It was noteworthy that open intercellular junctions of thelymphatic endothelium adorned with
, 百拇医药
5′-Nase reaction product, formed a widepathway (500-1500nm) for the debris of cells or
fibers. The results suggested that lymphatics may play animportant role in the transport of infil-
trated lymphocytes and destructed cell components or some solutesin the diabetic pancreas. KEY WORDS Enzyme-histochemicalstaining; 5′-nucleotidase (5′-Nase); Lympha-
tics; Pancreas; NOD mouse
_______________________
△Department of Anatomy, Oita MedicalUniversity, Oita 879-55, Japan, http://www.100md.com