健胎液对人脐静脉内皮细胞分泌血管活性物质的影响
作者：蒋德菊 黄光英 郝天玲
单位：蒋德菊(同济医科大学硕士研究生， 现在广东省深圳市龙岗区中心医院， 邮政编 码 深圳518101)；黄光英(硕士导师， 同济医科大学中西医结合研究所)；郝天玲(同济医科大学病理生理教研室)
关键词：健胎液，；中药；人脐静脉内皮细胞；内皮素；前列环素；一氧化氮
微循环学杂志000110
目的： 探讨健胎液防治胎儿宫内生长迟缓的机理， 应用血清药理学方法研究健胎液对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分泌血管活性物质内皮素(ET)、 前列环素(PGI2)、 一氧化氮(NO)的影响， 以及该方药对缺氧HUVEC形态结构上的保护作用。 方法： 将HUVEC随机分成四组： 正常组、 缺氧组、 血清组、 健胎液组， 观察细胞形态的改变； 检测内皮素(ET)、 前列环素(PGI2)和一氧化氮(NO)， 进行统计学处理。 结果： 健胎液可显著提高缺氧HUVEC合成分泌PGI2、 NO(P<0.05～0.01)， 同时， ET的释放显著降低(P4 h<0.05)。 从超微结构上观察， 健胎液能明显减轻缺氧对HUVEC的细胞器和细胞核的损伤， 尤以保护线粒体免受缺氧损伤的作用更显著。 结论： 通过增强血管内皮细胞对缺氧的耐受性， 调节血管性物质的分泌是健胎液防治胎儿宫内生长迟缓的机制之一。
, 百拇医药
Effect of Jiantaiye on Human Umbilical Vein Endothelium Cells Releasing Vascular Activity Substance
Jiang Deju, Huang Guangying, Hao Tianling
(Yongji Medical University, Wuhan 430030)
Objective: To investigate the mechanism of Jiantaiye's prevention and treatment to intrauterine growth retardation(IUGR), the effect of Jiantaiye on hypoxia cultured human umbilical vein endothelium cells(HUVEC) releasing endothelin(ET), prostacyclin(PGI2), nitric oxide(NO) and their protecting endothelium cells were studied by using the serum pharmacological method. Method: Four groups were observed. The normal group, the hypoxic group, the serum group, the Jiantaiye group. The ultrastructure of the HUVEC was observed and taken photos. The cultured juice was collected to measure ET, PGI2 and NO. Results: It was shown that Jiantaiye can significantly increase release of PGI2 and NO of HUVEC(P<0.05～0.01). At the same time, Jiantaiye can decrease release of ET of HUVEC(P4 h<0.05). Studying on the ultrastructure, Jiantaiye could alleviate the danger of the organelle and nucleus in hypoxia condition. The mitochondria were protected more obviously. Conclusion: One of the mechanisium of Jiantaiye's prevention and treatment to IUGR is brought out by enhancing the tolerance of endothelium cells in hypoxia state and regulating the release of endothelium factors.
, 百拇医药
Key words:Jiantaiye, Traditional Chinese Drug; Human umbilical vein endothelium cells; Endothelin; Prostacyclin; Nitric oxide
健胎液是临床长期运用防治胎儿宫内生长迟缓(Intrauterine growth retardation, IUGR)之 验方， 由黄芪、 当归、 丹参、 川芎、 桑寄生等益气活血、 补肾安胎中药组成。 前期 动物实验表明： 该方能改善IUGR孕鼠血液流变学特性， 增加胎盘组织一氧化氮的含量 [1]； 临床研究表明： 该方能增加新生儿体重， 增加胎儿脐血氨基酸含量， 使异常 胎盘合体细胞微绒毛恢复正常， 临床疗效高于氨基酸[2]。 本研究采用血清药理 学方法[3]探讨健胎液对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)合成分泌ET、 PGI2和NO 的影响， 观察健胎液对缺氧HUVEC形态结构上的保护作用， 从细胞水平上阐述健胎液防治I UGR和妊娠高血压综合征(妊高征， 很多IUGR源于妊高征)的机制。
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1 材料与方法
1.1仪器及试剂
主要仪器： CO2培养箱(Shel. Lrs Model 2300， Sheldon Manufacturing, INC. 美国) ； 倒置相差显微镜(COIC 4411， 日本)； 透射电镜(Opton, EM10C， 德国)； SN-682 型放免γ计数器(上海核福光电仪器公司)； 721型分光光度计(上海第三仪器分析厂)。
试剂： DMEM培养基、 胰酶(1∶250)均购自GIBCO公司； 小牛血清购自中国医学科学院血液 病研究所； 磺胺由浙江衢州化学试剂厂生产， 批号930624； N-1萘基乙二胺购自北京化 学试剂公司， 批号940320； NaNO2河南焦作化工三厂生产， 批号960218。
1.2 实验药物
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健胎液的组成： 黄芪、 当归、 川芎、 丹参、 桑寄生按一定比例制成无菌煎剂， 由同济 医院药剂科配制， 批号96072。
1.3 含药兔血清的制备
参照文献[4]方法， 取健康雄性日本大白兔6只， 体重2.5～3.0 kg， 由 同济医大实验动物中心提供。 随机分成二组， 一组用于制备含药兔血清， 另一组用于制 备正常兔血清。 按体表面积折算及灌药剂量筛选结果， 健胎液给家兔灌药量为7 ml/kg*2 4 h-1， 将三只兔连续7天灌胃， 末次灌胃2 h后心脏采血， 离心取血清， 56 ℃灭 活30 min， 滤过除菌， -70 ℃保存备用。 另三只兔灌等量生理盐水， 以同样方法制备正 常兔血清。
1.4 HUVEC的培养及实验分组
HUVEC购于武汉大学细胞保藏中心(ECV -304， Arcc NO CRL-1998)， 用DMEM培养基(pH= 7.2～7.4)， 含20%小牛血清， 每毫升培养液含青霉素100 U、 链霉素100 μg)， 在37 ℃ 5% CO2培养箱中培养， 待细胞完全汇合成单层后， 用0.125%胰酶(pH=7. 6， 含0.02% EDTA)消化传代， 接种于25 ml培养瓶中， 2～3×105/瓶， 3～4天 后细胞汇合成单层， 倒去培养液， 用D-Hanks液洗二遍， 随机分成四组， 每组6瓶：
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A组(正常组)： 加入3 ml无酚红、 无血清的DMEM培养液， 放入5% CO2、 95% O2培 养箱37 ℃培养。
B组(缺氧组)： 加入3 ml无酚红、 无血清的DMEM培养液。
C组(缺氧+正常血清组， 简称血清组)： 加入3 ml无酚红、 含正常血清的DMEM液， 兔血清 终浓度为400 μl/ml(培养液)。
D组(缺氧+含药血清组， 简称健胎液组)： 加入3 ml无酚红、 含药兔血清的DMEM液， 含药 血清终浓度为400 μl/ml(培养液)。
B、 C、 D组通入95% N2、 5% CO2， 37 ℃培养。
1.5 观测指标及方法
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1.5.1 透射电镜观察： 各组细胞加入各处理因素6 h后， 消化、 离心， 收集细胞， 2.5%戊二醛固定， 常规包埋、 切片， 透射电镜下观察摄像。
1.5.2 标本采集及ET、 PGI2、 NO检测： 各组细胞在培养2 h、 4 h、 6 h时取培养液离心， 取上清， -70 ℃保存待测ET、 PGI2、 NO。 6-keto-PGF1 α是PGI2稳定的代谢产物， 测定6-keto-PGF1α的浓度可以反映PGI2的生成 量； 亚硝酸盐(NO-2)是NO的代谢产物， NO-2的生成量与NO的合成分泌量相平行， 测定NO-2的量可以反映NO的生成水平[5]。
ET的放免测定： 125I-ET放免药盒购自北京东亚免疫技术研究所， 批内变异CV <10%， 批间变异CV<15%， 本抗体与α-人心钠素、 降钙素基因相关肽血管紧张素Ⅰ、 Ⅱ 以及舒血管肠肽(VIP)等均无交叉反应， 由同济医院核医学科用SN-682型放免γ计数器测 定。6-keto-PGF1α放免测定： 125I-6-keto-PGF1α放免药盒购 自北京东亚免疫技术研究所， 批内变异系数CV<3.5%， 批间变异系数CV<10%， 对其它 花生四烯酸代谢产物交叉反应<0.1%， 由同济医院核医学科测定。 NO-2测定： 取800 μl培养细胞上清液， 加入等量Griess反应液(5% H3PO4、 1% 磺胺、 0.1% N-1萘基乙二胺)， 室温静置10 min， 在550 nm处读取数值， 以NaNO 2作标准品， NO-2浓度单位为μmol/L。
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1.6 统计学处理
采用SAS软件包进行t检验， P<0.25表示有差异， P<0.05表示差异有 显著性， P<0.01表示差异有极显著性。
2 结 果
2.1透射电镜观察结果
正常组细胞线粒体、 内质网、 细胞核清晰可见， 有少量小空泡， 突起多， 核糖体多分 布于内质网附近， 有些细胞可见膜包被的杆状Weibel-Palade小体(图1)； 缺氧组细胞线 粒体严重肿胀呈球形， 有大量大空泡， 胞浆疏松， 内质网扩张， 突起很少或没有， 少 数细胞核碎裂(图2、 3)； 血清组线粒体肿胀程度略轻于缺氧组(图4)； 健胎液组线粒体不 肿胀， 或极少数轻度肿胀， 内质网和细胞核正常， 有少量小空泡， 突起正常(图5)。
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图1 正常组细胞线粒体,内质网,细胞核清晰可见×8000
图2 缺氧组细胞线粒体严重肿胀成大空泡,部分内质网扩张×8000
图3 缺氧组细胞核碎裂×8000
图4 缺氧+正常血清组细胞线粒体严重肿胀成大空泡×8000
图5 缺氧+含药血清组细胞线粒体正常,有极个别轻度肿胀×8000
2.2 检测指标结果
表 1 HUVEC培养液中ET放免测试结果(
±s， ng/L， n=6) 组别
2 h
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4 h
6 h
A组
26.58±16.41
25.27±7.54
30.51±32.08
B组
45.55±40.21
62.04±47.18
85.63±52.57
C组
131.21±33.71
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230.20±84.90
287.24±163.71
D组
102.21±32.031)
150.74±31.782)
197.23±35.32 3)
注： 与C组比较： 1) P<0.10， 2) P<0.05， 3) P<0.25表 2 HUVEC培养液中6-keto-PGF 1α放免测试结果
(±s， ng/L， n=6) 组别
, 百拇医药
2 h
4 h
6 h
A组
4.23±3.09
10.12±6.71
15.10±11.72
B组
3.03±2.28
4.73±3.30
6.22±5.007
C组
, 百拇医药
46.71±41.78
53.59±34.35
58.20±34.73
D组
69.55±23.121)
83.04±30.852)
98.81±15.233)
注： 与C组比较： 1) P<0.25， 2) P<0.10， 3) P<0.05表 3 HUVEC培养液中NO-2检验结 果(±s， μmol/L， n=6) 组别
, 百拇医药
2 h
4 h
6 h
A组
1.37±0.93
1.55±1.29
1.57±1.48
B组
0.67±0.41
1.07±1.04
1.35±0.67
C组
, 百拇医药 3.63±0.24
4.90±0.27
5.25±0.90
D组
4.80±0.691)
5.78±0.562)
8.55±1.213)
注： 与C组比较： 1) P<0.25， 2) P<0.05， 3) P<0.01
由表1～3结果可知： 缺氧HUVEC合成释放ET显著升高， 而PGI2和NO合成分泌明显下降； 健胎液组与血清组比较， 健胎液能明显抑制ET合成释放(P4 h<0.05)， 健 胎液能显著提高缺氧HUVEC合成分泌PGI2(P6 h<0.05)和NO(P4 h <0.05， P6 h<0.01)。
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3 讨 论
内皮细胞不仅是血液和组织间物质交换选择性通透屏障， 而且还能合成和分泌多种生物活 性物质， 参与多种病理过程， 如： 凝血与抗血栓， 调节血管平滑肌的舒缩， 参与脂质 代谢和血液中一些生物活性物质的清除， 并在免疫中也起一定作用[6]。 缺氧对H UVEC最显著的损伤是线粒体， 线粒体是活细胞生物氧化产生能量的主要机构， 一旦损伤， 会减少ATP的产生， 影响蛋白质的合成与分泌， 甚至破坏整个细胞， 使细胞崩解、 坏死 。 从电镜结果可知， 健胎液对缺氧HUVEC具有保护作用， 尤以稳定线粒体等亚细胞结构的 作用更为显著。 内皮细胞形态结构的完整性是维持正常功能的基础， 健胎液保护了缺氧内 皮细胞的完整性， 也就防止了因缺氧损伤内皮细胞所引起的凝血、 血管痉挛、 平滑肌增 生等一系列病变。 当然， 这与健胎液能调节内皮源性的血管活性物质分泌有关。
内皮细胞合成和分泌的血管收缩因子(ET)和血管舒张因子(PGI2、 NO)相互制约、 相互消 长， 保持内环境的平衡与稳定[7]。 ET是迄今所知最强的缩血管物质， 还可促进 内皮细胞vWF表达， 诱导血小板聚集， 导致血栓形成。 低氧诱导了内皮源性的ET基因表达 ， ET表达水平与IUGR呈正相关[8]。 PGI2、 NO都是强大的舒血管和抗凝物质。 IUGR者脐血管内皮细胞合成NO、 PGI2的能力下降[9]。 由于组织缺血、 缺氧 、 内毒素、 酸中毒等因素损伤了脐带、 胎盘血管内皮细胞， 血管收缩因子和舒张因子释 放失常， ET水平升高， PGI2、 NO水平下降， 导致凝血纤溶系统、 内皮通透性调节、 血小板和巨噬细胞的活化以及平滑肌细胞的生长等均失去平衡， 各种细胞释放超极化因子 、 生长因子、 粘附因子促使脐血管、 胎盘血管痉挛、 硬化、 血栓形成， 阻碍胎儿 营养运输而形成IUGR及妊高征等妊娠并发症。 本研究结果表明， 缺氧HUVEC合成分泌ET显 著升高， 而PGI2、 NO合成释放下降， 这与文献报道相符[8，10]， 健胎液能 明显抑制ET合成释放， 显著提高缺氧HUVEC合成分泌PGI2、 NO， 提示： 健胎液通过提 高缺氧HUVEC释放舒血管物质、 抑制缩血管物质的分泌来维持脐带和胎盘血管张力， 保证 营养物质运输道路的通畅从而达到防治IUGR的作用。
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因IUGR病因病生的复杂性和诊疗的困难性， 目前IUGR仍是产科和儿科的临床难题。 目前多 采用三种疗法[11]， 一是增加胎儿营养： 予孕妇吸氧， 静脉输注葡萄糖和氨基 酸等营养药物； 二是改善微循环状态： 予小剂量阿司匹林、 肝素低分子右旋糖酐等药抑 制血小板聚集、 改善血液粘度、 抗血栓、 疏通微循环； 三是解痉： 予舒喘灵等β2型 拟肾上素药物以扩张血管、 松弛子宫平滑肌、 改善子宫胎盘血供。 前期临床、 动物实验 研究和本实验研究均表明健胎液兼备以上三种疗法的特点， 既可以增加胎儿脐血氨基酸含 量[2]， 又可改善微循环粘度[1]， 同时还可通过调节血管活性物质的分 泌， 扩张血管以增加子宫--胎盘--胎儿血供， 临床疗效显著[2]。
当然， IUGR的病理机制很复杂， 健胎液是否促进某些生物活性因子(如： 胎儿生长激素、 胰岛素样生长因子、 甲状腺激素等)的基因表达等问题有待进一步研究， 深入研究健胎液 防治IUGR的机制将对健胎液在临床上的进一步开发应用具有重要意义。
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国家自然科学基金(39870923)和国家中医药管理局科研基金(922204)共同 资助课题
本文作者简介：蒋德菊(1969～)， 女， 汉族， 住院医师， 硕士
参考文献
1，徐珉， 黄光英， 叶望云. 健胎液对胎儿宫内发育迟缓孕鼠血浆、 胎盘NO含量 的影响. 微循环学杂志， 1998， 8(1)：10～12.
2，黄光英， 舒益民. 补肾益气活血方对胎儿宫内生长迟缓胎盘组织一氧化氮合酶 活性的影响. 中国组织化学和细胞化学， 1998， 7(3)：277～281.
3，Amagaya S, Kazumichi H, Miyaka A, et al. A new pharmacological testing method-different effects of levamisole on mitogenic activity of lipopolysaccha ride. J Chem Pharm Bull, 1989, 37(4):1 117～1 119.
, 百拇医药
4，王伟， 陈可冀， 史大卓， 等. 精制血府胶囊对缺氧缺糖心肌细胞一氧化氮合 酶基因表达的影响. 中国中西医结合杂志， 1996， 16(11)：670～672.
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6，蔡海江， 邓中端， 洪邵光， 等. 动脉粥样硬化基础与临床. 南京： 江苏科学 技术出版社， 1996. 87.
7，Luscher TF, Boulanger CⅡ， Dohi Y, et al. Endothelium-derived contra cting factors. Hypertension, 1992, 19:117～130.
8，Li H, Chen ST, Chen YF, et al. Enhanced endothelin-1 and endothelin r eceptor gene expression in chronic hypoxia. J Appl Physiol, 1994, 77: 1 451 ～1 459.
, 百拇医药
9，钟慈韦. 一氧化氮的生物医学. 上海： 上海医科大学出版社， 1996. 314.
10，Nucci G, Gryglewski RJ, Warner TD, et al. Receptor mediated release o f endothelium derived relaxing factor and prostacyclin from boving aortic endoth elial cells is coupled. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85:2 334.
11，王淑贞主编. 实用妇产科学. 北京： 人民卫生出版社出版， 1998. 540.
本文1999-06-04收到, 2000-01-11接受, http://www.100md.com
单位：蒋德菊(同济医科大学硕士研究生， 现在广东省深圳市龙岗区中心医院， 邮政编 码 深圳518101)；黄光英(硕士导师， 同济医科大学中西医结合研究所)；郝天玲(同济医科大学病理生理教研室)
关键词：健胎液，；中药；人脐静脉内皮细胞；内皮素；前列环素；一氧化氮
微循环学杂志000110
目的： 探讨健胎液防治胎儿宫内生长迟缓的机理， 应用血清药理学方法研究健胎液对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分泌血管活性物质内皮素(ET)、 前列环素(PGI2)、 一氧化氮(NO)的影响， 以及该方药对缺氧HUVEC形态结构上的保护作用。 方法： 将HUVEC随机分成四组： 正常组、 缺氧组、 血清组、 健胎液组， 观察细胞形态的改变； 检测内皮素(ET)、 前列环素(PGI2)和一氧化氮(NO)， 进行统计学处理。 结果： 健胎液可显著提高缺氧HUVEC合成分泌PGI2、 NO(P<0.05～0.01)， 同时， ET的释放显著降低(P4 h<0.05)。 从超微结构上观察， 健胎液能明显减轻缺氧对HUVEC的细胞器和细胞核的损伤， 尤以保护线粒体免受缺氧损伤的作用更显著。 结论： 通过增强血管内皮细胞对缺氧的耐受性， 调节血管性物质的分泌是健胎液防治胎儿宫内生长迟缓的机制之一。
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Effect of Jiantaiye on Human Umbilical Vein Endothelium Cells Releasing Vascular Activity Substance
Jiang Deju, Huang Guangying, Hao Tianling
(Yongji Medical University, Wuhan 430030)
Objective: To investigate the mechanism of Jiantaiye's prevention and treatment to intrauterine growth retardation(IUGR), the effect of Jiantaiye on hypoxia cultured human umbilical vein endothelium cells(HUVEC) releasing endothelin(ET), prostacyclin(PGI2), nitric oxide(NO) and their protecting endothelium cells were studied by using the serum pharmacological method. Method: Four groups were observed. The normal group, the hypoxic group, the serum group, the Jiantaiye group. The ultrastructure of the HUVEC was observed and taken photos. The cultured juice was collected to measure ET, PGI2 and NO. Results: It was shown that Jiantaiye can significantly increase release of PGI2 and NO of HUVEC(P<0.05～0.01). At the same time, Jiantaiye can decrease release of ET of HUVEC(P4 h<0.05). Studying on the ultrastructure, Jiantaiye could alleviate the danger of the organelle and nucleus in hypoxia condition. The mitochondria were protected more obviously. Conclusion: One of the mechanisium of Jiantaiye's prevention and treatment to IUGR is brought out by enhancing the tolerance of endothelium cells in hypoxia state and regulating the release of endothelium factors.
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Key words:Jiantaiye, Traditional Chinese Drug; Human umbilical vein endothelium cells; Endothelin; Prostacyclin; Nitric oxide
健胎液是临床长期运用防治胎儿宫内生长迟缓(Intrauterine growth retardation, IUGR)之 验方， 由黄芪、 当归、 丹参、 川芎、 桑寄生等益气活血、 补肾安胎中药组成。 前期 动物实验表明： 该方能改善IUGR孕鼠血液流变学特性， 增加胎盘组织一氧化氮的含量 [1]； 临床研究表明： 该方能增加新生儿体重， 增加胎儿脐血氨基酸含量， 使异常 胎盘合体细胞微绒毛恢复正常， 临床疗效高于氨基酸[2]。 本研究采用血清药理 学方法[3]探讨健胎液对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)合成分泌ET、 PGI2和NO 的影响， 观察健胎液对缺氧HUVEC形态结构上的保护作用， 从细胞水平上阐述健胎液防治I UGR和妊娠高血压综合征(妊高征， 很多IUGR源于妊高征)的机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1仪器及试剂
主要仪器： CO2培养箱(Shel. Lrs Model 2300， Sheldon Manufacturing, INC. 美国) ； 倒置相差显微镜(COIC 4411， 日本)； 透射电镜(Opton, EM10C， 德国)； SN-682 型放免γ计数器(上海核福光电仪器公司)； 721型分光光度计(上海第三仪器分析厂)。
试剂： DMEM培养基、 胰酶(1∶250)均购自GIBCO公司； 小牛血清购自中国医学科学院血液 病研究所； 磺胺由浙江衢州化学试剂厂生产， 批号930624； N-1萘基乙二胺购自北京化 学试剂公司， 批号940320； NaNO2河南焦作化工三厂生产， 批号960218。
1.2 实验药物
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健胎液的组成： 黄芪、 当归、 川芎、 丹参、 桑寄生按一定比例制成无菌煎剂， 由同济 医院药剂科配制， 批号96072。
1.3 含药兔血清的制备
参照文献[4]方法， 取健康雄性日本大白兔6只， 体重2.5～3.0 kg， 由 同济医大实验动物中心提供。 随机分成二组， 一组用于制备含药兔血清， 另一组用于制 备正常兔血清。 按体表面积折算及灌药剂量筛选结果， 健胎液给家兔灌药量为7 ml/kg*2 4 h-1， 将三只兔连续7天灌胃， 末次灌胃2 h后心脏采血， 离心取血清， 56 ℃灭 活30 min， 滤过除菌， -70 ℃保存备用。 另三只兔灌等量生理盐水， 以同样方法制备正 常兔血清。
1.4 HUVEC的培养及实验分组
HUVEC购于武汉大学细胞保藏中心(ECV -304， Arcc NO CRL-1998)， 用DMEM培养基(pH= 7.2～7.4)， 含20%小牛血清， 每毫升培养液含青霉素100 U、 链霉素100 μg)， 在37 ℃ 5% CO2培养箱中培养， 待细胞完全汇合成单层后， 用0.125%胰酶(pH=7. 6， 含0.02% EDTA)消化传代， 接种于25 ml培养瓶中， 2～3×105/瓶， 3～4天 后细胞汇合成单层， 倒去培养液， 用D-Hanks液洗二遍， 随机分成四组， 每组6瓶：
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A组(正常组)： 加入3 ml无酚红、 无血清的DMEM培养液， 放入5% CO2、 95% O2培 养箱37 ℃培养。
B组(缺氧组)： 加入3 ml无酚红、 无血清的DMEM培养液。
C组(缺氧+正常血清组， 简称血清组)： 加入3 ml无酚红、 含正常血清的DMEM液， 兔血清 终浓度为400 μl/ml(培养液)。
D组(缺氧+含药血清组， 简称健胎液组)： 加入3 ml无酚红、 含药兔血清的DMEM液， 含药 血清终浓度为400 μl/ml(培养液)。
B、 C、 D组通入95% N2、 5% CO2， 37 ℃培养。
1.5 观测指标及方法
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1.5.1 透射电镜观察： 各组细胞加入各处理因素6 h后， 消化、 离心， 收集细胞， 2.5%戊二醛固定， 常规包埋、 切片， 透射电镜下观察摄像。
1.5.2 标本采集及ET、 PGI2、 NO检测： 各组细胞在培养2 h、 4 h、 6 h时取培养液离心， 取上清， -70 ℃保存待测ET、 PGI2、 NO。 6-keto-PGF1 α是PGI2稳定的代谢产物， 测定6-keto-PGF1α的浓度可以反映PGI2的生成 量； 亚硝酸盐(NO-2)是NO的代谢产物， NO-2的生成量与NO的合成分泌量相平行， 测定NO-2的量可以反映NO的生成水平[5]。
ET的放免测定： 125I-ET放免药盒购自北京东亚免疫技术研究所， 批内变异CV <10%， 批间变异CV<15%， 本抗体与α-人心钠素、 降钙素基因相关肽血管紧张素Ⅰ、 Ⅱ 以及舒血管肠肽(VIP)等均无交叉反应， 由同济医院核医学科用SN-682型放免γ计数器测 定。6-keto-PGF1α放免测定： 125I-6-keto-PGF1α放免药盒购 自北京东亚免疫技术研究所， 批内变异系数CV<3.5%， 批间变异系数CV<10%， 对其它 花生四烯酸代谢产物交叉反应<0.1%， 由同济医院核医学科测定。 NO-2测定： 取800 μl培养细胞上清液， 加入等量Griess反应液(5% H3PO4、 1% 磺胺、 0.1% N-1萘基乙二胺)， 室温静置10 min， 在550 nm处读取数值， 以NaNO 2作标准品， NO-2浓度单位为μmol/L。
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1.6 统计学处理
采用SAS软件包进行t检验， P<0.25表示有差异， P<0.05表示差异有 显著性， P<0.01表示差异有极显著性。
2 结 果
2.1透射电镜观察结果
正常组细胞线粒体、 内质网、 细胞核清晰可见， 有少量小空泡， 突起多， 核糖体多分 布于内质网附近， 有些细胞可见膜包被的杆状Weibel-Palade小体(图1)； 缺氧组细胞线 粒体严重肿胀呈球形， 有大量大空泡， 胞浆疏松， 内质网扩张， 突起很少或没有， 少 数细胞核碎裂(图2、 3)； 血清组线粒体肿胀程度略轻于缺氧组(图4)； 健胎液组线粒体不 肿胀， 或极少数轻度肿胀， 内质网和细胞核正常， 有少量小空泡， 突起正常(图5)。
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图1 正常组细胞线粒体,内质网,细胞核清晰可见×8000
图2 缺氧组细胞线粒体严重肿胀成大空泡,部分内质网扩张×8000
图3 缺氧组细胞核碎裂×8000
图4 缺氧+正常血清组细胞线粒体严重肿胀成大空泡×8000
图5 缺氧+含药血清组细胞线粒体正常,有极个别轻度肿胀×8000
2.2 检测指标结果
表 1 HUVEC培养液中ET放免测试结果(
±s， ng/L， n=6) 组别2 h
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4 h
6 h
A组
26.58±16.41
25.27±7.54
30.51±32.08
B组
45.55±40.21
62.04±47.18
85.63±52.57
C组
131.21±33.71
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230.20±84.90
287.24±163.71
D组
102.21±32.031)
150.74±31.782)
197.23±35.32 3)
注： 与C组比较： 1) P<0.10， 2) P<0.05， 3) P<0.25表 2 HUVEC培养液中6-keto-PGF 1α放免测试结果
(
±s， ng/L， n=6) 组别, 百拇医药
2 h
4 h
6 h
A组
4.23±3.09
10.12±6.71
15.10±11.72
B组
3.03±2.28
4.73±3.30
6.22±5.007
C组
, 百拇医药
46.71±41.78
53.59±34.35
58.20±34.73
D组
69.55±23.121)
83.04±30.852)
98.81±15.233)
注： 与C组比较： 1) P<0.25， 2) P<0.10， 3) P<0.05表 3 HUVEC培养液中NO-2检验结 果(
±s， μmol/L， n=6) 组别, 百拇医药
2 h
4 h
6 h
A组
1.37±0.93
1.55±1.29
1.57±1.48
B组
0.67±0.41
1.07±1.04
1.35±0.67
C组
, 百拇医药 3.63±0.24
4.90±0.27
5.25±0.90
D组
4.80±0.691)
5.78±0.562)
8.55±1.213)
注： 与C组比较： 1) P<0.25， 2) P<0.05， 3) P<0.01
由表1～3结果可知： 缺氧HUVEC合成释放ET显著升高， 而PGI2和NO合成分泌明显下降； 健胎液组与血清组比较， 健胎液能明显抑制ET合成释放(P4 h<0.05)， 健 胎液能显著提高缺氧HUVEC合成分泌PGI2(P6 h<0.05)和NO(P4 h <0.05， P6 h<0.01)。
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3 讨 论
内皮细胞不仅是血液和组织间物质交换选择性通透屏障， 而且还能合成和分泌多种生物活 性物质， 参与多种病理过程， 如： 凝血与抗血栓， 调节血管平滑肌的舒缩， 参与脂质 代谢和血液中一些生物活性物质的清除， 并在免疫中也起一定作用[6]。 缺氧对H UVEC最显著的损伤是线粒体， 线粒体是活细胞生物氧化产生能量的主要机构， 一旦损伤， 会减少ATP的产生， 影响蛋白质的合成与分泌， 甚至破坏整个细胞， 使细胞崩解、 坏死 。 从电镜结果可知， 健胎液对缺氧HUVEC具有保护作用， 尤以稳定线粒体等亚细胞结构的 作用更为显著。 内皮细胞形态结构的完整性是维持正常功能的基础， 健胎液保护了缺氧内 皮细胞的完整性， 也就防止了因缺氧损伤内皮细胞所引起的凝血、 血管痉挛、 平滑肌增 生等一系列病变。 当然， 这与健胎液能调节内皮源性的血管活性物质分泌有关。
内皮细胞合成和分泌的血管收缩因子(ET)和血管舒张因子(PGI2、 NO)相互制约、 相互消 长， 保持内环境的平衡与稳定[7]。 ET是迄今所知最强的缩血管物质， 还可促进 内皮细胞vWF表达， 诱导血小板聚集， 导致血栓形成。 低氧诱导了内皮源性的ET基因表达 ， ET表达水平与IUGR呈正相关[8]。 PGI2、 NO都是强大的舒血管和抗凝物质。 IUGR者脐血管内皮细胞合成NO、 PGI2的能力下降[9]。 由于组织缺血、 缺氧 、 内毒素、 酸中毒等因素损伤了脐带、 胎盘血管内皮细胞， 血管收缩因子和舒张因子释 放失常， ET水平升高， PGI2、 NO水平下降， 导致凝血纤溶系统、 内皮通透性调节、 血小板和巨噬细胞的活化以及平滑肌细胞的生长等均失去平衡， 各种细胞释放超极化因子 、 生长因子、 粘附因子促使脐血管、 胎盘血管痉挛、 硬化、 血栓形成， 阻碍胎儿 营养运输而形成IUGR及妊高征等妊娠并发症。 本研究结果表明， 缺氧HUVEC合成分泌ET显 著升高， 而PGI2、 NO合成释放下降， 这与文献报道相符[8，10]， 健胎液能 明显抑制ET合成释放， 显著提高缺氧HUVEC合成分泌PGI2、 NO， 提示： 健胎液通过提 高缺氧HUVEC释放舒血管物质、 抑制缩血管物质的分泌来维持脐带和胎盘血管张力， 保证 营养物质运输道路的通畅从而达到防治IUGR的作用。
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因IUGR病因病生的复杂性和诊疗的困难性， 目前IUGR仍是产科和儿科的临床难题。 目前多 采用三种疗法[11]， 一是增加胎儿营养： 予孕妇吸氧， 静脉输注葡萄糖和氨基 酸等营养药物； 二是改善微循环状态： 予小剂量阿司匹林、 肝素低分子右旋糖酐等药抑 制血小板聚集、 改善血液粘度、 抗血栓、 疏通微循环； 三是解痉： 予舒喘灵等β2型 拟肾上素药物以扩张血管、 松弛子宫平滑肌、 改善子宫胎盘血供。 前期临床、 动物实验 研究和本实验研究均表明健胎液兼备以上三种疗法的特点， 既可以增加胎儿脐血氨基酸含 量[2]， 又可改善微循环粘度[1]， 同时还可通过调节血管活性物质的分 泌， 扩张血管以增加子宫--胎盘--胎儿血供， 临床疗效显著[2]。
当然， IUGR的病理机制很复杂， 健胎液是否促进某些生物活性因子(如： 胎儿生长激素、 胰岛素样生长因子、 甲状腺激素等)的基因表达等问题有待进一步研究， 深入研究健胎液 防治IUGR的机制将对健胎液在临床上的进一步开发应用具有重要意义。
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国家自然科学基金(39870923)和国家中医药管理局科研基金(922204)共同 资助课题
本文作者简介：蒋德菊(1969～)， 女， 汉族， 住院医师， 硕士
参考文献
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2，黄光英， 舒益民. 补肾益气活血方对胎儿宫内生长迟缓胎盘组织一氧化氮合酶 活性的影响. 中国组织化学和细胞化学， 1998， 7(3)：277～281.
3，Amagaya S, Kazumichi H, Miyaka A, et al. A new pharmacological testing method-different effects of levamisole on mitogenic activity of lipopolysaccha ride. J Chem Pharm Bull, 1989, 37(4):1 117～1 119.
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4，王伟， 陈可冀， 史大卓， 等. 精制血府胶囊对缺氧缺糖心肌细胞一氧化氮合 酶基因表达的影响. 中国中西医结合杂志， 1996， 16(11)：670～672.
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7，Luscher TF, Boulanger CⅡ， Dohi Y, et al. Endothelium-derived contra cting factors. Hypertension, 1992, 19:117～130.
8，Li H, Chen ST, Chen YF, et al. Enhanced endothelin-1 and endothelin r eceptor gene expression in chronic hypoxia. J Appl Physiol, 1994, 77: 1 451 ～1 459.
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9，钟慈韦. 一氧化氮的生物医学. 上海： 上海医科大学出版社， 1996. 314.
10，Nucci G, Gryglewski RJ, Warner TD, et al. Receptor mediated release o f endothelium derived relaxing factor and prostacyclin from boving aortic endoth elial cells is coupled. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85:2 334.
11，王淑贞主编. 实用妇产科学. 北京： 人民卫生出版社出版， 1998. 540.
本文1999-06-04收到, 2000-01-11接受, http://www.100md.com