光化学法灭活红细胞浓缩液中病毒的研究进展
作者：王敦成 卜凤荣 许金波
单位：军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850
关键词：关键词；血液消毒；病毒灭活；光化学法
中国消毒学杂志980109 红细胞浓缩液(red blood cell concentrates, RBCC)是重要的血液制品之一。如何灭活该类制品所含病毒以保证其安全使用，日益受到人们的重视。光化学法用于病毒灭活的发展日新月异，很多光敏物质(血卟啉、苯并卟啉、萘胺 〔1,2〕 、玫瑰红 〔3〕 、sapphyrins和四苯基卟啉)曾被试用于光化学法对病毒的灭活。现将以酞菁衍生物为主的某些光敏物质对血红细胞浓缩液中病毒灭活作用的研究进展综述于下。
1 酞菁
酞菁(phthalocynines Pcs)是一种类卟啉的合成染料，在远红外区(650～700 nm)有较强的光吸收。其复合物，如ALPc及其磺化物，能有效灭活红细胞中的水泡性口炎病毒(VSV)和细胞内及游离于细胞外的人类免疫缺陷病毒(HIV)，且经其处理后的红细胞溶血低，损伤小。用ALPcS 4 处理的RBCC，红细胞溶血低于2%，虽然细胞脆性微有升高，但在体内可自行恢复及循环再生。
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Pc衍生物与某些金属离子螯合，可提高对病毒的灭活能力。当其与锌(Zn)、铝(Al)、镓(Ga)等离子螯合，对病毒灭活能力增强的顺序为：ZnPc>AlPc> GaPc。加入t-丁基基团三磺基化的 Pc〔PcS3(t-Bu)〕，对病毒的灭活能力可增加5～40倍。磺化型式因减少了与血清蛋白的结合，可更多结合到病毒包膜上〔4〕。Rywkin用AlPcS4OH灭活RBCC中的脂包膜病毒VSV，使之减少5 lg以上，而红细胞完整性仍较好〔9〕。
不同病毒对Pc光敏性反应不同。VSV与辛德毕斯病毒对Pc5、Pc6 、AlPcS4OH的敏感性相似，而HIV对AlPcS4OH和Pc5比VSV者敏感〔5〕。
目前认为，Pc衍生物AlPcS4灭活RBCC中病毒的机理主要有二：①光化学产物自由基的作用；② 光化学产物单线态氧的作用。对人RBCC中的VSV，用10～13μmol/LAlPcS4与25～26mW/cm2可见光作用后，可将其全部灭活。加入甘露醇、甘油、还原谷胱甘肽(GSH)或过氧化物歧化酶淬灭光化学产物自由基，对VSV灭活无明显影响；如加入色氨酸或叠氮化钠淬灭光化学产物单线态氧，则对VSV的灭活率明显下降。因此，在用光处理红细胞时，单线态氧对VSV的灭活起重要作用〔6〕。抗氧化剂维生素E可有效抑制AlPcS4诱导的光溶血作用。维生素E的衍生物Trolox，可保护红细胞而不影响对病毒的灭活效果。此外，维生素E还可淬灭光化学反应产生的活性氧。活性氧物质(ROS)的寿命仅百万分之一秒，只能与近距离(< 0.1μm)的底物起作用，所以只有光敏剂与病毒颗粒和红细胞结合，才可产生光动力损伤〔7〕。Trolox对红细胞的保护，可能是基于其结合红细胞胞膜比结合病毒的效率更高，和(或)淬灭自由基比淬灭单线态氧更有效。Trolox结合胞膜的位点可能是保护红细胞的关键〔8〕。
, 百拇医药
Rywkin等用Pcs、AlPcS4、Pc5 或Pc6和红光结合，灭活HIV、VSV和辛德毕斯病毒(TCID 50 > 5 lg)〔9〕。为得最佳灭活效果且对红细胞损伤最小，他们又进行了以下研究：① 其灭活病毒和减少对红细胞损伤的结构特征；② 以活性氧的灭活剂或类型I淬灭剂减少红细胞损伤而不影响病毒灭活效果；③ 以提高血中病毒灭活的选择性或改变光照射等方法，以及靠细胞自身淬灭物和抗氧化酶清除ROS；④ 通过调节光比率以优化对红细胞中病毒灭活的处理条件 [10〕。
2 部花青
部花青540(MC 540)与可见光结合，可用于灭活红细胞浓缩液中的病毒，尤其是包膜病毒。然而，此后的贮存中红细胞大量溶解，ATP含量下降。此外，白蛋白对MC 540光灭活病毒亦有明显干扰，MC 540活性谱在570 nm与血红蛋白有重叠。上述问题成为MC 540用于消毒的障 碍 〔11,12〕 。
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3 亚甲基蓝
亚甲基蓝(MB)最大吸收在665 nm，可用于RBCC消毒。但不同病毒对MB的敏感性有差异，如MB不能灭活细胞内的HIV。此外，MB有致突变可能且在灭活病毒的同时，红细胞胞膜可发生改变，导致IgG结合和钾离子外渗。低强度光照虽可减少红细胞损伤，但不能使病毒完全灭活。综上情况，一般认为不适用于红细胞消毒 〔13～15〕 。
4 苯甲酸卟啉衍生物单酸A
苯甲酸卟啉衍生物单酸A(BPD- MA)在692 nm波段有强吸收。以其2～4 μg/ml的浓度与57 J/cm 2 白光结合，可灭活全血中的VSV(> 7 lg)，48 h后溶血极少。该法可用于灭活细胞内的和游离于细胞外的HIV，且对红细胞无明显损伤。经BPD与光处理后，红细胞损伤程度与红细胞钾离子水平及24 h输血后存活率有关。24 h输血后红细胞存活率随其钾离子水平下降而减少。也有人认为，24 h输血后红细胞存活率与其ATP含量有关 〔15〕 。Valeri的实验表明，经BPD与光处理后，红细胞钾离子水平下降，ATP含量增加。因此，在体外试验中，红细胞钾离子水平比其ATP含量更能客观反映24 h输血后其存活率 〔16〕 。
, 百拇医药
5 金丝桃素与玫瑰红
金丝桃素(hyperisin)是从植物中提取的一种活性物质，有抗逆转录病毒效果，用以抑制成熟病毒颗粒的反转录。据报道，金丝桃素可灭活多种脂包膜病毒，对无包膜病毒无明显效果。与光结合后，其对病毒的灭活能力可提高100倍以上。
玫瑰红与金丝桃素相似处为均可催化光诱导产生单线态氧。高活性的氧化物是导致膜破裂的主要原因。玫瑰红与光协同灭活痘苗病毒，主要是通过破坏其蛋白质，而非核酸；金丝桃素与光协同灭活包膜病毒，主要则是破坏其融合功能。但两者均可因诱导产生单线态氧，加速膜蛋白交联，使脂包膜病毒融合细胞的功能丧失。这一作用与 MC 540、某些卟啉衍生物相似，均与膜有关 〔17〕 。
6 Sapphyrin
Judy用sapphyrins与可见光结合灭活HSV-l包膜病毒时，经荧光散射法观察到sapphyrin结合在病毒包膜的脂双层区，尤其是极性区。sapphyrin对血制品中的HIV可能也有灭活能力 〔18〕 。
, 百拇医药
7 结语
病毒灭活与红细胞损伤机理不同。前者主要是单线态氧作用或能量转移反应所致，后者的标志主要是溶血。IgG与红细胞胞膜结合，消除自由基可减轻红细胞损伤。此外，以光波协同AlPcS 4 或Pc 5 灭活病毒时，5 mW/cm 2 与80 mW/cm 2 光强度对病毒的灭活效果相似，但前者对红细胞损伤则较小〔19〕。
综上所述，在光化学法灭活红细胞浓缩液中病毒方面，目前以酞菁衍生物与光结合的方法可望有较好发展前景，但需注意选择辐射剂量合适的光源，以减轻对红细胞损害。
参 考 文 献
〔1〕 North J, Neyndorff H, King D, et al. Viral inactivation in blood and red cell concentrates with benzoporphyrin derivative. Blood Cells 1992; 18: 129.
, 百拇医药
〔2〕 Mathews JL, Judy MM. The use of naphthalimide photochemical for inactivation of virus in blood. Photochem Photobiol 1996; 63(suppl): 47s.
〔3〕 Ben-Hur E, Horowitz B. Advances in photochemical approaches for blood sterilization. Photochem Photobiol 1995; 62: 383.
〔4〕 Ben-Hur E, Zuk MM, Chin S, et al. Biodistribution and virus inactivation efficacy of sillicon phthalocyanine in red blood cell concentrentes as a function of delivery vehicle. Photochem Photobiol 1995; 62: 575.
, 百拇医药
〔5〕 Horowitz B, Williams S, Rywkin AM, et al. Inactivation of viruses in red cell and platelet concentrates with aluminum phthalocyanine (AlPc) sulfonates. Blood Cells 1992; 18: 141.
〔6〕 Allen CM, Weber JM, Lier JE, et al. Sulfphthalocyanines for photodynamic inactivation of viruses in blood products: effects of structure modifications. Photochem Photobiol 1995; 62: 184.
〔7〕 Rywkin S, Lenny L, Goldsein J, et al. Importance of type I and type II mechanisms in the photodynamic inactivation of viruses in blood with aluminun phthalocyanine derivative. Photochem Photobiol 1992; 56: 463.
, http://www.100md.com
〔8〕 Ben-Hur E, Rywkin S, Rosenthal I, et al. Virus inactivation in red cell concentrates by photosensitization with phthalocyanines protection of red cells but not of vesicular stomatitis virus with a water-soluble anaglogue of vitamin E. Transf 1995; 35: 401.
〔9〕 Rywkin S, Ben-Hur E, Malik Z, et al. New Pes for phtodynamic virus inactivation in RBCC. Photochem Photobiol 1994; 60: 165.
〔10〕 Rywkin S, Ben-Hur E, Reid MR, et al. Selective protection against IgG binding to red cells treated with phthalocyanines and red light for virus inactivation. Transf 1995; 35: 414.
, 百拇医药
〔11〕 Abe H, Wagner SJ. Analysis of viral DNA protein and envelope damage after methylene blue, Pc derivative or MC-540 photosensitization. Photochem Photobiol 1995; 61: 402.
〔12〕 Prodouz KN, Lytic CD, Kcville EA, et al. Inhibition by albumin of MC-540 mediated photosensitization of platelets and virus. Transf 1991; 31: 415.
〔13〕 Wagner SJ, Cifone MA, Murli H, et al. Mammalian genotoxicity assessment of MB in plasma:implication for virus inactivation. Transf 1995； 35：407.
, http://www.100md.com
〔14〕 Wagner SJ, Storry JR, Mallory DA, et al. Red cell alterations associated with virucidal methylene blue phototreatment. Transf 1993; 33: 30.
〔15〕 Mohr H, Lambrecht B, Schmitt H, et al. Virus inactivation of blood products by phenothiazine dye and light. Photochem Photobiol 1996; 63(suppl): 46s.
〔16〕 Valeri CR, Bachman B, Klein-Struckmeier A, et al. The effect of disinfection on validity and function of baboon red blood cells. Photochem Photobiol 1997; 65: 446.
, 百拇医药
〔17〕 Lenard J, Rabson A, Vanderocf R. Photdynamic inactivation of infectivity of human immunoeffeciency virus and other enveloped viruses using hypericin and rose bcngal:inhibition of fusion and syncytia formation. Proc Natl Acac Sci USA 1993; 90: 158.
〔18〕 Judy MM, Matthews JL, Newman JT, et al. In Vitro photodynamic inactivation of herpes simplex virus with sapphyrins: 22 pi-electron porphyrin-like macrocycles. Photochem Photobiol 1991; 53: 101.
〔19〕 Ben-Hur E, Geacintov NE, Studamire B, et al. The effect of irradiance on virus sterilization and photodynamic damage in red blood cells sensitized by phtoalocyacines. Photochem Photobiol 1995; 61: 190.
(1997-05-26收稿 1997-09-22修回), 百拇医药
单位：军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850
关键词：关键词；血液消毒；病毒灭活；光化学法
中国消毒学杂志980109 红细胞浓缩液(red blood cell concentrates, RBCC)是重要的血液制品之一。如何灭活该类制品所含病毒以保证其安全使用，日益受到人们的重视。光化学法用于病毒灭活的发展日新月异，很多光敏物质(血卟啉、苯并卟啉、萘胺 〔1,2〕 、玫瑰红 〔3〕 、sapphyrins和四苯基卟啉)曾被试用于光化学法对病毒的灭活。现将以酞菁衍生物为主的某些光敏物质对血红细胞浓缩液中病毒灭活作用的研究进展综述于下。
1 酞菁
酞菁(phthalocynines Pcs)是一种类卟啉的合成染料，在远红外区(650～700 nm)有较强的光吸收。其复合物，如ALPc及其磺化物，能有效灭活红细胞中的水泡性口炎病毒(VSV)和细胞内及游离于细胞外的人类免疫缺陷病毒(HIV)，且经其处理后的红细胞溶血低，损伤小。用ALPcS 4 处理的RBCC，红细胞溶血低于2%，虽然细胞脆性微有升高，但在体内可自行恢复及循环再生。
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Pc衍生物与某些金属离子螯合，可提高对病毒的灭活能力。当其与锌(Zn)、铝(Al)、镓(Ga)等离子螯合，对病毒灭活能力增强的顺序为：ZnPc>AlPc> GaPc。加入t-丁基基团三磺基化的 Pc〔PcS3(t-Bu)〕，对病毒的灭活能力可增加5～40倍。磺化型式因减少了与血清蛋白的结合，可更多结合到病毒包膜上〔4〕。Rywkin用AlPcS4OH灭活RBCC中的脂包膜病毒VSV，使之减少5 lg以上，而红细胞完整性仍较好〔9〕。
不同病毒对Pc光敏性反应不同。VSV与辛德毕斯病毒对Pc5、Pc6 、AlPcS4OH的敏感性相似，而HIV对AlPcS4OH和Pc5比VSV者敏感〔5〕。
目前认为，Pc衍生物AlPcS4灭活RBCC中病毒的机理主要有二：①光化学产物自由基的作用；② 光化学产物单线态氧的作用。对人RBCC中的VSV，用10～13μmol/LAlPcS4与25～26mW/cm2可见光作用后，可将其全部灭活。加入甘露醇、甘油、还原谷胱甘肽(GSH)或过氧化物歧化酶淬灭光化学产物自由基，对VSV灭活无明显影响；如加入色氨酸或叠氮化钠淬灭光化学产物单线态氧，则对VSV的灭活率明显下降。因此，在用光处理红细胞时，单线态氧对VSV的灭活起重要作用〔6〕。抗氧化剂维生素E可有效抑制AlPcS4诱导的光溶血作用。维生素E的衍生物Trolox，可保护红细胞而不影响对病毒的灭活效果。此外，维生素E还可淬灭光化学反应产生的活性氧。活性氧物质(ROS)的寿命仅百万分之一秒，只能与近距离(< 0.1μm)的底物起作用，所以只有光敏剂与病毒颗粒和红细胞结合，才可产生光动力损伤〔7〕。Trolox对红细胞的保护，可能是基于其结合红细胞胞膜比结合病毒的效率更高，和(或)淬灭自由基比淬灭单线态氧更有效。Trolox结合胞膜的位点可能是保护红细胞的关键〔8〕。
, 百拇医药
Rywkin等用Pcs、AlPcS4、Pc5 或Pc6和红光结合，灭活HIV、VSV和辛德毕斯病毒(TCID 50 > 5 lg)〔9〕。为得最佳灭活效果且对红细胞损伤最小，他们又进行了以下研究：① 其灭活病毒和减少对红细胞损伤的结构特征；② 以活性氧的灭活剂或类型I淬灭剂减少红细胞损伤而不影响病毒灭活效果；③ 以提高血中病毒灭活的选择性或改变光照射等方法，以及靠细胞自身淬灭物和抗氧化酶清除ROS；④ 通过调节光比率以优化对红细胞中病毒灭活的处理条件 [10〕。
2 部花青
部花青540(MC 540)与可见光结合，可用于灭活红细胞浓缩液中的病毒，尤其是包膜病毒。然而，此后的贮存中红细胞大量溶解，ATP含量下降。此外，白蛋白对MC 540光灭活病毒亦有明显干扰，MC 540活性谱在570 nm与血红蛋白有重叠。上述问题成为MC 540用于消毒的障 碍 〔11,12〕 。
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3 亚甲基蓝
亚甲基蓝(MB)最大吸收在665 nm，可用于RBCC消毒。但不同病毒对MB的敏感性有差异，如MB不能灭活细胞内的HIV。此外，MB有致突变可能且在灭活病毒的同时，红细胞胞膜可发生改变，导致IgG结合和钾离子外渗。低强度光照虽可减少红细胞损伤，但不能使病毒完全灭活。综上情况，一般认为不适用于红细胞消毒 〔13～15〕 。
4 苯甲酸卟啉衍生物单酸A
苯甲酸卟啉衍生物单酸A(BPD- MA)在692 nm波段有强吸收。以其2～4 μg/ml的浓度与57 J/cm 2 白光结合，可灭活全血中的VSV(> 7 lg)，48 h后溶血极少。该法可用于灭活细胞内的和游离于细胞外的HIV，且对红细胞无明显损伤。经BPD与光处理后，红细胞损伤程度与红细胞钾离子水平及24 h输血后存活率有关。24 h输血后红细胞存活率随其钾离子水平下降而减少。也有人认为，24 h输血后红细胞存活率与其ATP含量有关 〔15〕 。Valeri的实验表明，经BPD与光处理后，红细胞钾离子水平下降，ATP含量增加。因此，在体外试验中，红细胞钾离子水平比其ATP含量更能客观反映24 h输血后其存活率 〔16〕 。
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5 金丝桃素与玫瑰红
金丝桃素(hyperisin)是从植物中提取的一种活性物质，有抗逆转录病毒效果，用以抑制成熟病毒颗粒的反转录。据报道，金丝桃素可灭活多种脂包膜病毒，对无包膜病毒无明显效果。与光结合后，其对病毒的灭活能力可提高100倍以上。
玫瑰红与金丝桃素相似处为均可催化光诱导产生单线态氧。高活性的氧化物是导致膜破裂的主要原因。玫瑰红与光协同灭活痘苗病毒，主要是通过破坏其蛋白质，而非核酸；金丝桃素与光协同灭活包膜病毒，主要则是破坏其融合功能。但两者均可因诱导产生单线态氧，加速膜蛋白交联，使脂包膜病毒融合细胞的功能丧失。这一作用与 MC 540、某些卟啉衍生物相似，均与膜有关 〔17〕 。
6 Sapphyrin
Judy用sapphyrins与可见光结合灭活HSV-l包膜病毒时，经荧光散射法观察到sapphyrin结合在病毒包膜的脂双层区，尤其是极性区。sapphyrin对血制品中的HIV可能也有灭活能力 〔18〕 。
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7 结语
病毒灭活与红细胞损伤机理不同。前者主要是单线态氧作用或能量转移反应所致，后者的标志主要是溶血。IgG与红细胞胞膜结合，消除自由基可减轻红细胞损伤。此外，以光波协同AlPcS 4 或Pc 5 灭活病毒时，5 mW/cm 2 与80 mW/cm 2 光强度对病毒的灭活效果相似，但前者对红细胞损伤则较小〔19〕。
综上所述，在光化学法灭活红细胞浓缩液中病毒方面，目前以酞菁衍生物与光结合的方法可望有较好发展前景，但需注意选择辐射剂量合适的光源，以减轻对红细胞损害。
参 考 文 献
〔1〕 North J, Neyndorff H, King D, et al. Viral inactivation in blood and red cell concentrates with benzoporphyrin derivative. Blood Cells 1992; 18: 129.
, 百拇医药
〔2〕 Mathews JL, Judy MM. The use of naphthalimide photochemical for inactivation of virus in blood. Photochem Photobiol 1996; 63(suppl): 47s.
〔3〕 Ben-Hur E, Horowitz B. Advances in photochemical approaches for blood sterilization. Photochem Photobiol 1995; 62: 383.
〔4〕 Ben-Hur E, Zuk MM, Chin S, et al. Biodistribution and virus inactivation efficacy of sillicon phthalocyanine in red blood cell concentrentes as a function of delivery vehicle. Photochem Photobiol 1995; 62: 575.
, 百拇医药
〔5〕 Horowitz B, Williams S, Rywkin AM, et al. Inactivation of viruses in red cell and platelet concentrates with aluminum phthalocyanine (AlPc) sulfonates. Blood Cells 1992; 18: 141.
〔6〕 Allen CM, Weber JM, Lier JE, et al. Sulfphthalocyanines for photodynamic inactivation of viruses in blood products: effects of structure modifications. Photochem Photobiol 1995; 62: 184.
〔7〕 Rywkin S, Lenny L, Goldsein J, et al. Importance of type I and type II mechanisms in the photodynamic inactivation of viruses in blood with aluminun phthalocyanine derivative. Photochem Photobiol 1992; 56: 463.
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〔8〕 Ben-Hur E, Rywkin S, Rosenthal I, et al. Virus inactivation in red cell concentrates by photosensitization with phthalocyanines protection of red cells but not of vesicular stomatitis virus with a water-soluble anaglogue of vitamin E. Transf 1995; 35: 401.
〔9〕 Rywkin S, Ben-Hur E, Malik Z, et al. New Pes for phtodynamic virus inactivation in RBCC. Photochem Photobiol 1994; 60: 165.
〔10〕 Rywkin S, Ben-Hur E, Reid MR, et al. Selective protection against IgG binding to red cells treated with phthalocyanines and red light for virus inactivation. Transf 1995; 35: 414.
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〔11〕 Abe H, Wagner SJ. Analysis of viral DNA protein and envelope damage after methylene blue, Pc derivative or MC-540 photosensitization. Photochem Photobiol 1995; 61: 402.
〔12〕 Prodouz KN, Lytic CD, Kcville EA, et al. Inhibition by albumin of MC-540 mediated photosensitization of platelets and virus. Transf 1991; 31: 415.
〔13〕 Wagner SJ, Cifone MA, Murli H, et al. Mammalian genotoxicity assessment of MB in plasma:implication for virus inactivation. Transf 1995； 35：407.
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〔14〕 Wagner SJ, Storry JR, Mallory DA, et al. Red cell alterations associated with virucidal methylene blue phototreatment. Transf 1993; 33: 30.
〔15〕 Mohr H, Lambrecht B, Schmitt H, et al. Virus inactivation of blood products by phenothiazine dye and light. Photochem Photobiol 1996; 63(suppl): 46s.
〔16〕 Valeri CR, Bachman B, Klein-Struckmeier A, et al. The effect of disinfection on validity and function of baboon red blood cells. Photochem Photobiol 1997; 65: 446.
, 百拇医药
〔17〕 Lenard J, Rabson A, Vanderocf R. Photdynamic inactivation of infectivity of human immunoeffeciency virus and other enveloped viruses using hypericin and rose bcngal:inhibition of fusion and syncytia formation. Proc Natl Acac Sci USA 1993; 90: 158.
〔18〕 Judy MM, Matthews JL, Newman JT, et al. In Vitro photodynamic inactivation of herpes simplex virus with sapphyrins: 22 pi-electron porphyrin-like macrocycles. Photochem Photobiol 1991; 53: 101.
〔19〕 Ben-Hur E, Geacintov NE, Studamire B, et al. The effect of irradiance on virus sterilization and photodynamic damage in red blood cells sensitized by phtoalocyacines. Photochem Photobiol 1995; 61: 190.
(1997-05-26收稿 1997-09-22修回), 百拇医药