甲基丙烯酸环氧丙酯对细胞间隙连接通讯的影响
作者：尹学钧 许建宁 王全凯 宋文佳 谢晓霜 李忠生 邹昌淇 方福德 何凤生
单位：尹学钧(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；许建宁(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；王全凯(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；宋文佳(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；谢晓霜(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；李忠生(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；邹昌淇(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)
关键词：甲基丙烯酸环氧丙酯；细胞间隙连接通讯；人胚肺成纤维细胞
摘 要摘 要：为探讨甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导细胞转化的机理，选用划痕染料示踪技术(SLDT)初步研究了GMA对人胚肺成纤维细胞间隙连接通讯(GJIC)的影响。用0.5、2.5和5.0mg/L的GMA给细胞染毒12h，经划痕导入荧光黄染料并测定各组细胞中该荧光染料向其相邻细胞扩散的程度。结果表明，在染毒剂量及时间范围内，GMA对人胚肺成纤维细胞GJIC产生较强的抑制作用，呈良好的剂量-效应关系。其中，2.5和5.0mg/L剂量组细胞的GJIC明显降低。结果提示GMA对细胞间隙通讯的抑制作用可能是其导致细胞恶性转化的重要机制之一。
, 百拇医药
分类号：R730.231.1 O623.624 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0073-03
Effects of glycidyl methacrylate on gap junctional
intercellular communication
Yin Xuejun Xu Jianning Wang Quankai Song Wenjia，et al.
(Institute of Occupational Medicine，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing 100050，China)
, 百拇医药 Abstract：In order to probe into the mechanism of glycidyl methacrylate (GMA)-induced cell tansformation，the effects of GMA on gap junctional intercellular communication (GJIC) in human lung, embryonic fibroblasts(HLEF) were studied by using scrape-loading and dye transfer(SLDT) technique.HLEF cells were treated with GMA at concentrations of 0.5，2.5 and 5.0mg/L for 12 hours and Lucifer Yellow was introduced by scrape-loading after exposure.The GJIC in exposed cells and that of controls were determined directly as the diffusion extent of fluorescent dye into adjacent cells.The results indicated that GMA could inhibit the GJIC in exposed cells in a dose-dependent manner.Significantly decreased GJIC was found in 2.5 and 5.0mg/L dose groups.It was suggested that the inhibition of GJIC might be one of the mechanisms responsible for GMA-induced cell transformation.
, 百拇医药
Key words：glycidyl methacrylate，gap junctional intercellular communication，human lung embryonic fibroblasts
甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)是一种重要的化工原料，在军事和民用工业中有着广泛的应用。研究表明，GMA可诱导人及多种哺乳动物细胞发生恶性转化，而DNA损伤及癌基因/抑癌基因突变等遗传毒性作用是其导致细胞转化的重要机制[1，2]。由于癌变是一个多因素参与、多阶段发展的复杂过程，除细胞关键基因结构及表达调控外，其基因外某些中间代谢途径发生变化也可能是环境致癌的成因之一。
划痕染料示踪技术(SLDT)是一种检测各种培养细胞间隙连接通讯(GJIC)的方法，目前已广泛应用于化学致癌物的检测及其致癌机理的研究[3]。其基本原理是，通过划痕损伤细胞膜，使小分子量的荧光染料进入细胞使之标记。在荧光显微镜下观察，有GJIC功能的细胞其标记染料可沿划痕区向外扩散，通过测定荧光染料扩散的距离或划痕区的荧光强度，即可直接反映细胞的GJIC功能状况。该技术的最大优点是，操作简单、灵敏度高，检测谱广，可同时检测遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物及促癌物。本实验采用SLDT技术观察了GMA对人胚肺成纤维细胞GJIC的改变情况，以期为GMA诱导细胞转化及其潜在致癌机理的研究提供新的实验依据和线索。
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1 材料与方法
1.1 试剂与材料
GMA粗品由航天部601所提供，在通氮条件下加入对苯二酚作为阻聚剂进行减压蒸馏，收集150～152.5℃/kPa馏份，纯品折光率η30D=1.4494。12-O-十四烷酰佛波-13-醋酸酯(TPA)、荧光黄(LY)为Sigma公司产品；EMEM培养基为Gibco公司产品，小牛血清(FBS)为天津川页生化制品有限公司产品，其他所需试剂均为国产分析纯试剂。人胚肺成纤维细胞株(2BS)购自北京生物制品研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养与染毒 将细胞接种在35mm塑料平皿内，37℃、5%CO2条件下培养。待细胞长满平皿后1天，加入终浓度为0.5、2.5和5.0mg/L的GMA染毒，每个剂量组做3个平行皿。实验同时设阳性对照组(TPA，0.1 mg/L)及溶剂对照组(DMSO，1ml/L)。TPA与细胞作用1h，GMA及DMSO与细胞作用12h。
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1.2.2 细胞毒性测定 染毒结束后用0.1%胰酶消化收获细胞，按台盼蓝排斥法计数存活细胞数，计算相对细胞存活率。
1.2.3 GJIC测定 实验参考El-Fouly等方法进行[4]，细胞培养、染毒剂量、分组及染毒时间同1.2.1。染毒结束后弃去培养液，用PBS洗涤细胞3次，加入适量0.5g/L的LY染液，用外科手术刀在细胞表面轻轻划痕3条，将细胞培养皿移至37℃培养箱中10min。吸除LY染液，再用PBS洗涤数次，以除去残存游离的LY染料及脱落细胞。用Olympus荧光显微镜观察各组细胞荧光染料的扩散程度，拍照。用图像分析系统(image Pro-plus)于每条划痕上随机取10个点测定荧光强度，求其平均值，所得数据用方差分析进行统计处理。
2 结果
实验结果表明，用0.5、2.5和5.0mg/L的GMA和0.1mg/L的TPA分别作用细胞12h及1h，其存活率均未受明显影响，表明所选染毒剂量是适宜的。GJIC测定结果显示，TPA与细胞接触1h即表现出对细胞间荧光扩散的抑制作用，荧光染料没有向划痕两边细胞扩散，而溶剂对照组细胞间荧光扩散良好。在0.5～5.0mg/L染毒剂量范围内，GMA与细胞接触12h后对细胞GJIC产生较强的抑制作用，并随染毒剂量的递增而加重，呈良好的剂量-效应关系。其中，2.5和5.0mg/L剂量组荧光相对强度与溶剂对照组相比明显降低(附表、附图)。
, 百拇医药
附表 甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)对人胚肺成纤维细胞
间隙连接通讯的抑制作用
受试物
剂量
(mg/L)
相对细胞
存活率(%)
荧光强度
(n=90，
±s)
DMSO
, 百拇医药
1
100
96±25
GMA
0.5
97
88±18
2.5
98
68±13(1)
5.0
90
49± 6(1)
, 百拇医药
TPA
0.1
87
60±12(1)
注：与DMSO组相比，(1)P<0.05
a.DMSO b.TPA(0.1mg/L) c.GMA(2.5mg/L) d.GMA(5.0mg/L)
, 百拇医药
(图中白色直线为在塑料皿底部的划痕)
附图 GMA对人胚肺成纤维细胞GJIC的抑制作用
3 讨论
间隙连接是动物细胞间存在的最为普遍的连接方式。近年研究认为，GJIC是细胞间离子及小分子物质如氨基酸、核苷酸、环核苷酸、葡萄糖、维生素、激素和其他重要代谢产物的交换通道，它通过细胞间离子和分子的共享而传递信息，在细胞的生长、发育、繁殖、分化和死亡及不同细胞、组织间代谢或电传导性的协调活动中起到十分重要的调节作用[5]。GJIC异常几乎存在于所有的实质性肿瘤组织，肿瘤细胞间及其与周围正常细胞间的信息传递完全阻断[6]。体外实验也证实，许多致癌物、促癌物、癌基因和生长因子可明显抑制GJIC，而一些抗癌物质的作用恰恰相反。另外，GJIC功能的丧失或降低在正常细胞向突变型细胞或转化细胞的恶变过程中也发挥重要作用[5]。一些研究发现，在细胞转化过程中常常伴有GJIC功能的逐步下降，推测GJIC的阻断可以使转化细胞摆脱周围正常细胞的生长调控而获得自主性生长[7]。以上结果均提示，GJIC异常可能是肿瘤发生的重要机制之一。本研究利用SLDT技术，对GMA对GJIC的影响进行了初步探讨。结果显示，GMA染毒后人胚肺成纤维细胞的GJIC明显下降，提示GMA对GJIC的抑制作用可能是其导致细胞恶性转化的一个新的重要机制。由于抑制GJIC是促癌物借以发挥促癌作用的一条重要途径，故GMA在诱导细胞转化过程中除了作为“启动剂”外，是否还具有促癌物作用也是一个值得深入探讨的问题。
, 百拇医药
关于GMA抑制GJIC的机制尚不清楚。目前普遍认为，间隙连接蛋白基因的表达调控及其在蛋白质水平的修饰作用是细胞调节GJIC的核心内容，其中许多重要的第二信使起到关键作用。如细胞内cAMP增高可激活蛋白激酶A依赖的间隙连接蛋白磷酸化而提高GJIC水平，而cGMP的作用则相反。cAMP还可直接作用于间隙连接蛋白基因的cAMP反应部位，从而影响其转录水平和mRNA的稳定性。此外，细胞内游离Ca2+浓度、蛋白激酶C活性、NO及自由基生成等均与GJIC水平有密切关系[5]。
基金项目：国家自然科学基金(No.39840017)
作者简介：尹学钧，男，博士生，副教授
作者单位：何凤生(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)
方福德(中国医学科学院基础医学研究所)
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参考文献：
[1]谭明家，许建宁，李忠生，等.甲基丙烯酸环氧丙酯诱导哺乳类细胞转化的实验研究.卫生研究，1998，27(3)：145—148
[2]方福德.甲基丙烯酸环氧丙酯致癌性研究进展.国内外医学科学进展，1997，5：34—37
[3]James E.Role of inhibition of intercellullar communication in carcinogenesis.Lab Invest，1990，62(1):135—144
[4]El-Fouly MH，Trosko JE，Chang CC.Scrape-loading and dye transfer:a rapid and simple technique to study gap junctional intercelluar communication.Exp Cell Res，1987，168:422—430
, http://www.100md.com
[5]郭新彪，姚碧云.调节细胞间隙通讯的毒理学意义.国外医学卫生学分册，1997，24(6)：326—328
[6]Loewenstein WR.Junctional intercellular communication and the control of growth.Biochem Biophys Acta，1979，560(1):1—65
[7]Yamasaki H，Naus CCG.Role of connexin genes in growth control.Carcinogenesis，1996，17(6):1199—1213
收稿日期：1999-09-27, 百拇医药
单位：尹学钧(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；许建宁(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；王全凯(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；宋文佳(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；谢晓霜(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；李忠生(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；邹昌淇(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)
关键词：甲基丙烯酸环氧丙酯；细胞间隙连接通讯；人胚肺成纤维细胞
摘 要摘 要：为探讨甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导细胞转化的机理，选用划痕染料示踪技术(SLDT)初步研究了GMA对人胚肺成纤维细胞间隙连接通讯(GJIC)的影响。用0.5、2.5和5.0mg/L的GMA给细胞染毒12h，经划痕导入荧光黄染料并测定各组细胞中该荧光染料向其相邻细胞扩散的程度。结果表明，在染毒剂量及时间范围内，GMA对人胚肺成纤维细胞GJIC产生较强的抑制作用，呈良好的剂量-效应关系。其中，2.5和5.0mg/L剂量组细胞的GJIC明显降低。结果提示GMA对细胞间隙通讯的抑制作用可能是其导致细胞恶性转化的重要机制之一。
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分类号：R730.231.1 O623.624 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0073-03
Effects of glycidyl methacrylate on gap junctional
intercellular communication
Yin Xuejun Xu Jianning Wang Quankai Song Wenjia，et al.
(Institute of Occupational Medicine，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing 100050，China)
, 百拇医药 Abstract：In order to probe into the mechanism of glycidyl methacrylate (GMA)-induced cell tansformation，the effects of GMA on gap junctional intercellular communication (GJIC) in human lung, embryonic fibroblasts(HLEF) were studied by using scrape-loading and dye transfer(SLDT) technique.HLEF cells were treated with GMA at concentrations of 0.5，2.5 and 5.0mg/L for 12 hours and Lucifer Yellow was introduced by scrape-loading after exposure.The GJIC in exposed cells and that of controls were determined directly as the diffusion extent of fluorescent dye into adjacent cells.The results indicated that GMA could inhibit the GJIC in exposed cells in a dose-dependent manner.Significantly decreased GJIC was found in 2.5 and 5.0mg/L dose groups.It was suggested that the inhibition of GJIC might be one of the mechanisms responsible for GMA-induced cell transformation.
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Key words：glycidyl methacrylate，gap junctional intercellular communication，human lung embryonic fibroblasts
甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)是一种重要的化工原料，在军事和民用工业中有着广泛的应用。研究表明，GMA可诱导人及多种哺乳动物细胞发生恶性转化，而DNA损伤及癌基因/抑癌基因突变等遗传毒性作用是其导致细胞转化的重要机制[1，2]。由于癌变是一个多因素参与、多阶段发展的复杂过程，除细胞关键基因结构及表达调控外，其基因外某些中间代谢途径发生变化也可能是环境致癌的成因之一。
划痕染料示踪技术(SLDT)是一种检测各种培养细胞间隙连接通讯(GJIC)的方法，目前已广泛应用于化学致癌物的检测及其致癌机理的研究[3]。其基本原理是，通过划痕损伤细胞膜，使小分子量的荧光染料进入细胞使之标记。在荧光显微镜下观察，有GJIC功能的细胞其标记染料可沿划痕区向外扩散，通过测定荧光染料扩散的距离或划痕区的荧光强度，即可直接反映细胞的GJIC功能状况。该技术的最大优点是，操作简单、灵敏度高，检测谱广，可同时检测遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物及促癌物。本实验采用SLDT技术观察了GMA对人胚肺成纤维细胞GJIC的改变情况，以期为GMA诱导细胞转化及其潜在致癌机理的研究提供新的实验依据和线索。
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1 材料与方法
1.1 试剂与材料
GMA粗品由航天部601所提供，在通氮条件下加入对苯二酚作为阻聚剂进行减压蒸馏，收集150～152.5℃/kPa馏份，纯品折光率η30D=1.4494。12-O-十四烷酰佛波-13-醋酸酯(TPA)、荧光黄(LY)为Sigma公司产品；EMEM培养基为Gibco公司产品，小牛血清(FBS)为天津川页生化制品有限公司产品，其他所需试剂均为国产分析纯试剂。人胚肺成纤维细胞株(2BS)购自北京生物制品研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养与染毒 将细胞接种在35mm塑料平皿内，37℃、5%CO2条件下培养。待细胞长满平皿后1天，加入终浓度为0.5、2.5和5.0mg/L的GMA染毒，每个剂量组做3个平行皿。实验同时设阳性对照组(TPA，0.1 mg/L)及溶剂对照组(DMSO，1ml/L)。TPA与细胞作用1h，GMA及DMSO与细胞作用12h。
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1.2.2 细胞毒性测定 染毒结束后用0.1%胰酶消化收获细胞，按台盼蓝排斥法计数存活细胞数，计算相对细胞存活率。
1.2.3 GJIC测定 实验参考El-Fouly等方法进行[4]，细胞培养、染毒剂量、分组及染毒时间同1.2.1。染毒结束后弃去培养液，用PBS洗涤细胞3次，加入适量0.5g/L的LY染液，用外科手术刀在细胞表面轻轻划痕3条，将细胞培养皿移至37℃培养箱中10min。吸除LY染液，再用PBS洗涤数次，以除去残存游离的LY染料及脱落细胞。用Olympus荧光显微镜观察各组细胞荧光染料的扩散程度，拍照。用图像分析系统(image Pro-plus)于每条划痕上随机取10个点测定荧光强度，求其平均值，所得数据用方差分析进行统计处理。
2 结果
实验结果表明，用0.5、2.5和5.0mg/L的GMA和0.1mg/L的TPA分别作用细胞12h及1h，其存活率均未受明显影响，表明所选染毒剂量是适宜的。GJIC测定结果显示，TPA与细胞接触1h即表现出对细胞间荧光扩散的抑制作用，荧光染料没有向划痕两边细胞扩散，而溶剂对照组细胞间荧光扩散良好。在0.5～5.0mg/L染毒剂量范围内，GMA与细胞接触12h后对细胞GJIC产生较强的抑制作用，并随染毒剂量的递增而加重，呈良好的剂量-效应关系。其中，2.5和5.0mg/L剂量组荧光相对强度与溶剂对照组相比明显降低(附表、附图)。
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附表 甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)对人胚肺成纤维细胞
间隙连接通讯的抑制作用
受试物
剂量
(mg/L)
相对细胞
存活率(%)
荧光强度
(n=90，
±s)DMSO
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1
100
96±25
GMA
0.5
97
88±18
2.5
98
68±13(1)
5.0
90
49± 6(1)
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TPA
0.1
87
60±12(1)
注：与DMSO组相比，(1)P<0.05
a.DMSO b.TPA(0.1mg/L) c.GMA(2.5mg/L) d.GMA(5.0mg/L)
, 百拇医药
(图中白色直线为在塑料皿底部的划痕)
附图 GMA对人胚肺成纤维细胞GJIC的抑制作用
3 讨论
间隙连接是动物细胞间存在的最为普遍的连接方式。近年研究认为，GJIC是细胞间离子及小分子物质如氨基酸、核苷酸、环核苷酸、葡萄糖、维生素、激素和其他重要代谢产物的交换通道，它通过细胞间离子和分子的共享而传递信息，在细胞的生长、发育、繁殖、分化和死亡及不同细胞、组织间代谢或电传导性的协调活动中起到十分重要的调节作用[5]。GJIC异常几乎存在于所有的实质性肿瘤组织，肿瘤细胞间及其与周围正常细胞间的信息传递完全阻断[6]。体外实验也证实，许多致癌物、促癌物、癌基因和生长因子可明显抑制GJIC，而一些抗癌物质的作用恰恰相反。另外，GJIC功能的丧失或降低在正常细胞向突变型细胞或转化细胞的恶变过程中也发挥重要作用[5]。一些研究发现，在细胞转化过程中常常伴有GJIC功能的逐步下降，推测GJIC的阻断可以使转化细胞摆脱周围正常细胞的生长调控而获得自主性生长[7]。以上结果均提示，GJIC异常可能是肿瘤发生的重要机制之一。本研究利用SLDT技术，对GMA对GJIC的影响进行了初步探讨。结果显示，GMA染毒后人胚肺成纤维细胞的GJIC明显下降，提示GMA对GJIC的抑制作用可能是其导致细胞恶性转化的一个新的重要机制。由于抑制GJIC是促癌物借以发挥促癌作用的一条重要途径，故GMA在诱导细胞转化过程中除了作为“启动剂”外，是否还具有促癌物作用也是一个值得深入探讨的问题。
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关于GMA抑制GJIC的机制尚不清楚。目前普遍认为，间隙连接蛋白基因的表达调控及其在蛋白质水平的修饰作用是细胞调节GJIC的核心内容，其中许多重要的第二信使起到关键作用。如细胞内cAMP增高可激活蛋白激酶A依赖的间隙连接蛋白磷酸化而提高GJIC水平，而cGMP的作用则相反。cAMP还可直接作用于间隙连接蛋白基因的cAMP反应部位，从而影响其转录水平和mRNA的稳定性。此外，细胞内游离Ca2+浓度、蛋白激酶C活性、NO及自由基生成等均与GJIC水平有密切关系[5]。
基金项目：国家自然科学基金(No.39840017)
作者简介：尹学钧，男，博士生，副教授
作者单位：何凤生(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)
方福德(中国医学科学院基础医学研究所)
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参考文献：
[1]谭明家，许建宁，李忠生，等.甲基丙烯酸环氧丙酯诱导哺乳类细胞转化的实验研究.卫生研究，1998，27(3)：145—148
[2]方福德.甲基丙烯酸环氧丙酯致癌性研究进展.国内外医学科学进展，1997，5：34—37
[3]James E.Role of inhibition of intercellullar communication in carcinogenesis.Lab Invest，1990，62(1):135—144
[4]El-Fouly MH，Trosko JE，Chang CC.Scrape-loading and dye transfer:a rapid and simple technique to study gap junctional intercelluar communication.Exp Cell Res，1987，168:422—430
, http://www.100md.com
[5]郭新彪，姚碧云.调节细胞间隙通讯的毒理学意义.国外医学卫生学分册，1997，24(6)：326—328
[6]Loewenstein WR.Junctional intercellular communication and the control of growth.Biochem Biophys Acta，1979，560(1):1—65
[7]Yamasaki H，Naus CCG.Role of connexin genes in growth control.Carcinogenesis，1996，17(6):1199—1213
收稿日期：1999-09-27, 百拇医药