人神经营养因子-3基因在大肠杆菌中的克隆和表达
作者：章建程 殷明 戴建凉 林卿 余浩 刘忠权
单位：海军医学研究所，上海市 200433
关键词：人神经营养因子-3基因；PCR扩增；基因重组；基因表达
海军医学杂志990217 摘要 目的：获得人神经营养因子-3(hNT-3)在大肠杆菌中的克隆并表达。方法：采用PCR方法从20周人胎脑cDNA文库中扩增hNT-3基因，通过双酶切法在M13mp18载体上克隆获得全长基因，将正确全长基因插入PBV220载体，通过选择合适宿主菌获得hNT-3的高效表达。结果：获得全长基因完全正确的hNT-3基因，获得占细菌总蛋白30%的hNT-3表达菌株。结论：本研究获得了序列正确的hNT-3基因克隆，并实现了在大肠杆菌中的高效表达。
Gene Cloning and Expression of Human Neurotrophin-3 in E.Coli
, 百拇医药
Zhang Jiancheng, Yin Ming, Dai Jianliang, et al
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To obtain hNT-3 gene and express it in E.coli. Methods: The human fetal brain cDNA library was chosen as the template to obtain hNT-3 gene through PCR. The PCR products, which had been cut by a suitable enzyme, were cloned into M13mp18 vector. It was then cloned into expression vector PBV220. The rhNT-3 was highly expressed in E. coli. Results: The correct full-length hNT-3 gene was obtained, and the expressed hNT-3 amounts to 30% of the total bacterial protein. Conclusion: A confirmed hNT-3 clone was obtained and highly expressed in E. coli.
, 百拇医药
Key words: human neurotrophin-3; PCR amplification; gene recombination; gene expression
神经营养因子-3(neurotrophic-3,NT-3)是神经系统重要的生物活性分子之一，由119个氨基酸组成的小分子量碱性蛋白质，与神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)同属一个基因家庭[1]，它能促进中枢和外周神经元分化、生长和存活，在神经系统发育和正常生理功能的维持及神经损伤修复中起重要作用[2]。近年来研究发现NT-3在急性脑脊髓损伤时可保护其效应神经元；对外伤、中毒、老化等因素引起的神经疾患有治疗作用；对低氧环境下脑神经细胞损伤具有保护作用[3]。由于NT-3在人体中的天然含量极低，须用基因工程手段来大量获取。我们根据已知的hNT-3序列，采用PCR扩增的方法，通过双酶切法在M13mp18载体上完成了hNT-3结构基因克隆，再将正确序列的hNT-3插入高效表达载体PBV220上，获得了hNT-3在大肠杆菌中的高效表达。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 限制性内切酶SalI、EcoRI、T4 DNA连接酶(ligase)及其缓冲液均为美国Promerger公司产品；DNA测序所用的Dye Primer Cycle Sequencing Kit为美国ABI公司产品；5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)为美国Sigma公司产品；DNA分子量标准为华美公司产品；PCR试剂盒为复华公司产品；丙烯酰胺和N、N＇-亚甲双丙烯酰胺和TEMBD为Fluka公司产品。
1.1.2 菌株和质粒 M13mp18噬菌体、E. coli TG1菌株由海军医学研究所分子生物学实验室保存，PBV220由中国预防医学院侯云德教授构建。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 PCR扩增hNT-3 引物的设计是在计算机辅助下根据Hohn、Maisonpierre发表的NT-3氨基酸序列[4，5]完成的，在结构基因的5’端增加了起始密码子ATG，3’端增加了终止密码子TGA，并在5’引物与3’引物中分别引入EcoRI和SalI位点。通过计算两条引物的Tm值[6]确定以下反应条件：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30个循环。以20周人胎脑cDNA文库作模板，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，冻融法回收DNA。
1.2.2 克隆和测序 PCR所得基因经SalI、EcoRI双酶切和同样双酶切的M13mp18RF DNA用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。按文献[7]方法转化E.coli TG1感受态细胞，对重组的白色噬菌斑用PCR方法筛选，凡能扩增出hNT-3全长基因的克隆再用碱法小量制备RFDNA进一步酶切分析，然后抽提酶切正确的重组克隆单链DNA作序列分析。
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1.2.3 PBV220/ hNT-3质粒的构建 含正确序列的M13mp18/hNT-3RFDNA经SalI、EocRI双酶切后在1%琼脂糖凝胶电泳上切割377bp左右片断，冻融法回收hNT-3基因，将PBV220质粒同样酶切后，取酶切载体100μg与约50μg hNT-3基因混合，用T4DNA连接酶16℃连接过夜。连接物转化E.coli TG1感受态细胞后涂板，挑单菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中30℃培养8h，抽质粒DNA，经SalI、EocRI双酶切可得到380bp左右基因即为重组克隆。菌株为PBV220/hNT-3/TG1。
1.2.4 重组蛋白的诱导表达 挑取PBV220/hNT-3/TG1单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养过夜，次日接此过夜菌50μl于新鲜 LB+Amp中，30℃培养至菌液浓度0.D590值为0.5左右时，迅速转入42℃摇床继续培养3～5h。采样1ml菌液5 000转/min离心，菌体沉淀加50μl 1×SDS蛋白加样缓冲液，100℃15min后作短暂离心，上样15%SDS-PAGE，30mA恒流电泳4h后，考马斯亮蓝R-250染色经脱色后观察蛋白条带。
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2 结 果
2.1 hNT-3基因的PCR扩增 自cDNA文库中PCR扩增出的hNT-3基因全长根据PCR Makers约在377bp左右，由于从cDNA文库中初次扩增出的hNT-3量较少，有许多非特异性条带，我们以扩增产物为模板，二次PCR，同时提高退火温度，可得到特异性明显增强的条带。
2.2 基因克隆和序列分析 将上述经PCR扩增后得到的hNT-3基因用SalI、EocRI双酶切后回收，与同样双酶切的M13mp18 RFDNA连接，转化E. coli TG1后得到白色噬菌斑。挑选10个白色噬菌斑分别在含1% E. coli TG1过夜菌的LB培养基中培养5h后，取1μl上清作模板，PCR扩增该基因，其中4个可扩增出全长基因。对这4个克隆的RFDNA进行SalI、EocRI双酶切，均切出了分子量约为377bp左右的hNT-3基因。将以上重组克隆单链DNA作序列分析，证明重组克隆M13mp18/ hNT-3中的NT-3基因序列与国外文献报道的完全一致。
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2.3 基因的表达 将测序正确的M13mp18/hNT-3 RFDNA经EocRI、SalI双酶切后电泳回收hNT-3基因，然后将其导入同样双酶切的PBV220载体，挑18个克隆化单菌落，抽质粒鉴定得到14个阳性重组子，经诱导表达后可见2个有明显特异性表达条带，分子量约为14kD。扫描显示，hNT-3表达占细胞总蛋白30%。
3 讨 论
本研究采用自20周人胎脑cDNA文库中PCR扩增hNT-3的方法，由于hNT-3结构基因本身含有二级结构，给PCR扩增时造成一定的困难。实验中我们采用煮沸法以打开模板的二级结构，然后突然插入0℃冰浴中，以维持单链状态；同时在缓冲体系中加入了1%DMSO(二甲基亚砜)，以减少模板的二级结构[8]。由于cDNA文库中hNT-3基因含量很低，模板量太少，从而给PCR扩增带来一定的难度。实验中我们先以较低的退火温度扩增得到含hNT-3及非特异性条带的PCR产物，然后再针对以上产物提高退火温度进行二次PCR，从而得到相对丰富的特异性基因，便于进行克隆操作。而TaqDNA聚合酶因其5’→3’DNA聚合酶活性可以很快将已消解产生的粘性末端补平，而单纯过柱或电泳回收有时不能除尽该酶，残留的TaqDNA酶会影响下一步酶切反应，实验中我们将PCR扩增片段用酚：氯仿抽提以除尽该酶，从而保证了酶切反应的质量。
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PBV220是一种有热诱导启动子的载体，在30℃下启动子PL PR引起的转录被抑制蛋白CIts857严重阻止，这时的质粒只能复制不能转录。当培养温度升高到42℃时CIts857被灭活，克隆在PL PR之后的外源基因起始转录。这样既保证了表达载体在宿主菌中的稳定存在，又保证重组蛋白经诱导后迅速合成。而在质粒PBV220启动子后，EcoRI位点是最佳外源基因插入位置，它使得启动子的SD序列与ATG具有最佳距离，从而使插入的hNT-3基因获得了高效表达。
近年来大量研究表明，NT-3对外周神经损伤的修复和神经再生具有治疗作用；在ALS、AD以及神经系统肿瘤如神经胶质瘤等疾病的诊断和治疗中具有临床应用价值。随着NGF、BDNF治疗进入临床试验，hNT-3治疗ALS的应用亦必将成为现实。本实验用基因工程获得重组人神经营养因子-3基因和高效表达工程菌，从而为解决舰船特殊环境下艇员的机能保障研究打下了扎实的基础。
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参考文献
1 Barde YA. The nerve growth factor family. Prog Growth Factor Res,1990,2:237
2 Lewin GR, Barde YA. Physiology of the neurotrophins. Annu Rev Neurosci,1996,19:289
3 Lindsay RM, Wiegand SJ, Altar CA et al. Neurotrophic factors: From molecule to man. Trends in Neuroscience,1994,17:182
4 Hohn A, Leibrocd J, Baileg K et al. Identification and characterization of a novelmember of the nerve growth factor/brain -derived neurotrophic factor family. Nature, 1990,344:339
, 百拇医药
5 Maisonpierre PC, Le Beau MM, Espinosa III R et al. Human and rat brain-derived factor and Neurotrophin-3: Gene structure, distribution, and chromosomal localization. Genomics 1991,10:558
6 Saiki RK. Primer direct enzymatic amplification of DNA with athermostable DNA polymerase. Science,1988,239:487
7 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著(金冬雁、黎孟枫等译).分子克隆实验指南.第2版，北京：科学技术出版社，1992.222
8 彭秀玲，袁汉英，谢 毅等.基因工程实验技术.第2版，湖南：湖南科学技术出版社，1997.75
(收稿：1999-06-01), 百拇医药
单位：海军医学研究所，上海市 200433
关键词：人神经营养因子-3基因；PCR扩增；基因重组；基因表达
海军医学杂志990217 摘要 目的：获得人神经营养因子-3(hNT-3)在大肠杆菌中的克隆并表达。方法：采用PCR方法从20周人胎脑cDNA文库中扩增hNT-3基因，通过双酶切法在M13mp18载体上克隆获得全长基因，将正确全长基因插入PBV220载体，通过选择合适宿主菌获得hNT-3的高效表达。结果：获得全长基因完全正确的hNT-3基因，获得占细菌总蛋白30%的hNT-3表达菌株。结论：本研究获得了序列正确的hNT-3基因克隆，并实现了在大肠杆菌中的高效表达。
Gene Cloning and Expression of Human Neurotrophin-3 in E.Coli
, 百拇医药
Zhang Jiancheng, Yin Ming, Dai Jianliang, et al
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To obtain hNT-3 gene and express it in E.coli. Methods: The human fetal brain cDNA library was chosen as the template to obtain hNT-3 gene through PCR. The PCR products, which had been cut by a suitable enzyme, were cloned into M13mp18 vector. It was then cloned into expression vector PBV220. The rhNT-3 was highly expressed in E. coli. Results: The correct full-length hNT-3 gene was obtained, and the expressed hNT-3 amounts to 30% of the total bacterial protein. Conclusion: A confirmed hNT-3 clone was obtained and highly expressed in E. coli.
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Key words: human neurotrophin-3; PCR amplification; gene recombination; gene expression
神经营养因子-3(neurotrophic-3,NT-3)是神经系统重要的生物活性分子之一，由119个氨基酸组成的小分子量碱性蛋白质，与神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)同属一个基因家庭[1]，它能促进中枢和外周神经元分化、生长和存活，在神经系统发育和正常生理功能的维持及神经损伤修复中起重要作用[2]。近年来研究发现NT-3在急性脑脊髓损伤时可保护其效应神经元；对外伤、中毒、老化等因素引起的神经疾患有治疗作用；对低氧环境下脑神经细胞损伤具有保护作用[3]。由于NT-3在人体中的天然含量极低，须用基因工程手段来大量获取。我们根据已知的hNT-3序列，采用PCR扩增的方法，通过双酶切法在M13mp18载体上完成了hNT-3结构基因克隆，再将正确序列的hNT-3插入高效表达载体PBV220上，获得了hNT-3在大肠杆菌中的高效表达。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 限制性内切酶SalI、EcoRI、T4 DNA连接酶(ligase)及其缓冲液均为美国Promerger公司产品；DNA测序所用的Dye Primer Cycle Sequencing Kit为美国ABI公司产品；5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)为美国Sigma公司产品；DNA分子量标准为华美公司产品；PCR试剂盒为复华公司产品；丙烯酰胺和N、N＇-亚甲双丙烯酰胺和TEMBD为Fluka公司产品。
1.1.2 菌株和质粒 M13mp18噬菌体、E. coli TG1菌株由海军医学研究所分子生物学实验室保存，PBV220由中国预防医学院侯云德教授构建。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 PCR扩增hNT-3 引物的设计是在计算机辅助下根据Hohn、Maisonpierre发表的NT-3氨基酸序列[4，5]完成的，在结构基因的5’端增加了起始密码子ATG，3’端增加了终止密码子TGA，并在5’引物与3’引物中分别引入EcoRI和SalI位点。通过计算两条引物的Tm值[6]确定以下反应条件：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30个循环。以20周人胎脑cDNA文库作模板，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，冻融法回收DNA。
1.2.2 克隆和测序 PCR所得基因经SalI、EcoRI双酶切和同样双酶切的M13mp18RF DNA用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。按文献[7]方法转化E.coli TG1感受态细胞，对重组的白色噬菌斑用PCR方法筛选，凡能扩增出hNT-3全长基因的克隆再用碱法小量制备RFDNA进一步酶切分析，然后抽提酶切正确的重组克隆单链DNA作序列分析。
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1.2.3 PBV220/ hNT-3质粒的构建 含正确序列的M13mp18/hNT-3RFDNA经SalI、EocRI双酶切后在1%琼脂糖凝胶电泳上切割377bp左右片断，冻融法回收hNT-3基因，将PBV220质粒同样酶切后，取酶切载体100μg与约50μg hNT-3基因混合，用T4DNA连接酶16℃连接过夜。连接物转化E.coli TG1感受态细胞后涂板，挑单菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中30℃培养8h，抽质粒DNA，经SalI、EocRI双酶切可得到380bp左右基因即为重组克隆。菌株为PBV220/hNT-3/TG1。
1.2.4 重组蛋白的诱导表达 挑取PBV220/hNT-3/TG1单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养过夜，次日接此过夜菌50μl于新鲜 LB+Amp中，30℃培养至菌液浓度0.D590值为0.5左右时，迅速转入42℃摇床继续培养3～5h。采样1ml菌液5 000转/min离心，菌体沉淀加50μl 1×SDS蛋白加样缓冲液，100℃15min后作短暂离心，上样15%SDS-PAGE，30mA恒流电泳4h后，考马斯亮蓝R-250染色经脱色后观察蛋白条带。
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2 结 果
2.1 hNT-3基因的PCR扩增 自cDNA文库中PCR扩增出的hNT-3基因全长根据PCR Makers约在377bp左右，由于从cDNA文库中初次扩增出的hNT-3量较少，有许多非特异性条带，我们以扩增产物为模板，二次PCR，同时提高退火温度，可得到特异性明显增强的条带。
2.2 基因克隆和序列分析 将上述经PCR扩增后得到的hNT-3基因用SalI、EocRI双酶切后回收，与同样双酶切的M13mp18 RFDNA连接，转化E. coli TG1后得到白色噬菌斑。挑选10个白色噬菌斑分别在含1% E. coli TG1过夜菌的LB培养基中培养5h后，取1μl上清作模板，PCR扩增该基因，其中4个可扩增出全长基因。对这4个克隆的RFDNA进行SalI、EocRI双酶切，均切出了分子量约为377bp左右的hNT-3基因。将以上重组克隆单链DNA作序列分析，证明重组克隆M13mp18/ hNT-3中的NT-3基因序列与国外文献报道的完全一致。
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2.3 基因的表达 将测序正确的M13mp18/hNT-3 RFDNA经EocRI、SalI双酶切后电泳回收hNT-3基因，然后将其导入同样双酶切的PBV220载体，挑18个克隆化单菌落，抽质粒鉴定得到14个阳性重组子，经诱导表达后可见2个有明显特异性表达条带，分子量约为14kD。扫描显示，hNT-3表达占细胞总蛋白30%。
3 讨 论
本研究采用自20周人胎脑cDNA文库中PCR扩增hNT-3的方法，由于hNT-3结构基因本身含有二级结构，给PCR扩增时造成一定的困难。实验中我们采用煮沸法以打开模板的二级结构，然后突然插入0℃冰浴中，以维持单链状态；同时在缓冲体系中加入了1%DMSO(二甲基亚砜)，以减少模板的二级结构[8]。由于cDNA文库中hNT-3基因含量很低，模板量太少，从而给PCR扩增带来一定的难度。实验中我们先以较低的退火温度扩增得到含hNT-3及非特异性条带的PCR产物，然后再针对以上产物提高退火温度进行二次PCR，从而得到相对丰富的特异性基因，便于进行克隆操作。而TaqDNA聚合酶因其5’→3’DNA聚合酶活性可以很快将已消解产生的粘性末端补平，而单纯过柱或电泳回收有时不能除尽该酶，残留的TaqDNA酶会影响下一步酶切反应，实验中我们将PCR扩增片段用酚：氯仿抽提以除尽该酶，从而保证了酶切反应的质量。
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PBV220是一种有热诱导启动子的载体，在30℃下启动子PL PR引起的转录被抑制蛋白CIts857严重阻止，这时的质粒只能复制不能转录。当培养温度升高到42℃时CIts857被灭活，克隆在PL PR之后的外源基因起始转录。这样既保证了表达载体在宿主菌中的稳定存在，又保证重组蛋白经诱导后迅速合成。而在质粒PBV220启动子后，EcoRI位点是最佳外源基因插入位置，它使得启动子的SD序列与ATG具有最佳距离，从而使插入的hNT-3基因获得了高效表达。
近年来大量研究表明，NT-3对外周神经损伤的修复和神经再生具有治疗作用；在ALS、AD以及神经系统肿瘤如神经胶质瘤等疾病的诊断和治疗中具有临床应用价值。随着NGF、BDNF治疗进入临床试验，hNT-3治疗ALS的应用亦必将成为现实。本实验用基因工程获得重组人神经营养因子-3基因和高效表达工程菌，从而为解决舰船特殊环境下艇员的机能保障研究打下了扎实的基础。
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参考文献
1 Barde YA. The nerve growth factor family. Prog Growth Factor Res,1990,2:237
2 Lewin GR, Barde YA. Physiology of the neurotrophins. Annu Rev Neurosci,1996,19:289
3 Lindsay RM, Wiegand SJ, Altar CA et al. Neurotrophic factors: From molecule to man. Trends in Neuroscience,1994,17:182
4 Hohn A, Leibrocd J, Baileg K et al. Identification and characterization of a novelmember of the nerve growth factor/brain -derived neurotrophic factor family. Nature, 1990,344:339
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5 Maisonpierre PC, Le Beau MM, Espinosa III R et al. Human and rat brain-derived factor and Neurotrophin-3: Gene structure, distribution, and chromosomal localization. Genomics 1991,10:558
6 Saiki RK. Primer direct enzymatic amplification of DNA with athermostable DNA polymerase. Science,1988,239:487
7 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著(金冬雁、黎孟枫等译).分子克隆实验指南.第2版，北京：科学技术出版社，1992.222
8 彭秀玲，袁汉英，谢 毅等.基因工程实验技术.第2版，湖南：湖南科学技术出版社，1997.75
(收稿：1999-06-01), 百拇医药