IL-2基因转移对卵巢癌细胞系SKOV3粘附性的影响
作者：张震宇1 郎景和2
单位：张震宇 北京军区总医院妇产科100700 郎景和 北京协和医院妇产科
关键词：白细胞介素2基因；卵巢癌；基因治疗；粘附性
现代妇产科进展990107 摘要 目的：研究IL-2基因转移对卵巢癌SKOV3细胞系粘附性的影响。方法：细胞对塑料基质、细胞基底膜成分的粘附实验，流式细胞术测定CD44H的表达。结果：EDTA介导的细胞分离实验表明，SKOV3/IL-2细胞对塑料基质的粘附能力明显下降(P<0.01)；对基质及基底膜成分的粘附实验表明，SKOV3/IL-2细胞对Ⅳ型胶原和matrigel的粘附能力下降，但对LN、FN的粘附能力无明显改变；粘附分子CD44H的表达：SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/IL-2组细胞粘附分子CD44H阳性细胞百分率分别为76.2%、66.7%和37.8%，SKOV3/IL-2组明显降低(P<0.001)。结论：IL-2基因修饰可使卵巢癌细胞系SKOV3粘附能力下降。
, 百拇医药
The effect of human interleukin-2 gene transfer on the adhesive ability of ovarian cancer cell line SKOV3.
Zhang Zhenyu.Lang Jinghe.
1Dept.of Gynecology and Obstetrics，General Hospital of Beijing
Military Command，100700 2 Peking Union Medical College Hospital
Abstract Objective：To evaluate the adhesive ability of ovarian cancer cell line SKOV3 and the IL-2 gene modified cells.Methods：EDTA-induced cell detachment and cell adhesive ability to LN，FN，collagen Ⅳ and matrgel were performed.The percentage of CD44H positive cells was detected by FCM. Results：Cell adhesion tests showed that the hIL-2 modified SKOV3 cells adhered less effectively to plastic substance，collagen Ⅳ and matrigel，but there were no significant difference to LN and FN.The percentage of CD44H positive cells decreased from 76.2% of parental SKOV3 cells to 37.8% of hIL-2 gene modified cells.Conclusion：IL-2 gene modification can significantly decrease the adhesive ability of SKOV3 cells.
, 百拇医药
Key words Interleukin-2 Gene；Ovarian neoplasms；gene therapy；Adhesiveness
卵巢上皮癌病程早期即于腹盆腔内广泛种植、播散，是影响患者预后的主要因素之一，粘附是肿瘤细胞转移的主要环节之一，肿瘤细胞对细胞基质的粘附性及CD44H的表达是评价细胞转移性的重要指标。白细胞介素-2(IL-2)基因转移可使卵巢癌细胞系SKOV3的形态、增殖和致瘤性发生一系列改变，但对卵巢癌细胞转移性的影响尚未见报道。本研究通过细胞对塑料基质、细胞基底膜成分的粘附实验及CD44H表达的测定明确了IL-2基因转移对卵巢癌细胞系SKOV3转移性的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞系 SKOV3为卵巢腺癌细胞系，本科冻存，培养于含10%新生牛血清、100U/ml青霉素、50mg/ml链霉素的DMEM培养基中。SKOV3/Neo由逆转录病毒介导将新霉素抗性基因Neo导入SKOV3细胞而建立，具有新霉素抗性。SKOV3/IL2系IL-2分泌卵巢癌细胞，由逆转录病毒介导，将人IL-2基因导入SKOV3细胞而建立(另文发表)，IL-2分泌量为318U/106细胞/24h，具有新霉素抗性。
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1.2 EDTA介导的细胞分离实验 收集待测细胞，制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度至1×104/ml，将1×104待测细胞接种于6孔培养板，加入完全培养液，常规培养；5d后取出培养板，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2遍后加入0.02%EDTA/孔，37℃水平摇床100r/min摇动，分别于摇动后5、10、15、20min收集消化液，仍未脱落之细胞加胰酶消化后吹打，计数各时相消化液中的细胞数，各时相脱落细胞数与培养板中残留细胞数之和为细胞总数；细胞脱落率的计算公式如下：
1.3 细胞对不同基质成分和基底膜成分的粘附性实验 ①30μg/ml LN、FN、IV型胶原溶液(北京医科大学细胞生物学教研室提供)100μl加入96孔平底培养板，每个时相点分别设4个复孔，37℃孵育1h，用PBS洗涤2遍，1%BSA (Sigma)100μl/孔，室温孵育2h，用PBS洗涤2遍备用；②30μg/ml Matrigel(人工基底膜，北京医科大学细胞生物学教研室提供)或多聚赖氨酸(plys,Sigma)100μl/孔加入96孔平底培养板，每个时相点设4个复孔，37℃孵育2h，用PBS洗涤2遍备用；③对数生长期待测细胞胰酶消化，制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105/ml，于预包被培养板每孔加入细胞悬液100μl，37℃、5%CO2、饱和湿度孵育；④60min后取出培养板，用PBS洗涤2遍，去除未粘附细胞，加入含0.25%胰酶、0.02%EDTA消化液100μl，37℃孵育10min，吹打，计数；(5)以多聚赖氨酸预包被者为100%，计算各种细胞对不同基质成分粘附的相对百分率。
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1.4 流式细胞术检测细胞膜表面CD44H 收集对数生长期待测细胞，制成单细胞悬液，计数，用2%NCS/PBS洗涤2遍，待测细胞1×106，离心沉淀，鼠抗人单克隆抗体CD44H(DAKO)稀释液100μl重悬，37℃孵育30～60min，用2%NCS/PBS洗涤3遍，荧光标记的免抗鼠IgG(福兴公司)稀释液100μl，37℃孵育30min,用2%NCS/PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定过夜，流式细胞仪检测阳性细胞百分率。
2 结果
2.1 细胞对塑料基质的粘附能力 亲本细胞及基因修饰细胞各时相点细胞脱落累积百分率，见附图。SKOV3/IL-2组各时相点细胞脱落百分率均高于SKOV3和SKOV3/Neo组(P<0.01)。
附图 EDTA介导的细胞分离实验
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A：SKOV3/IL2 B：SKOV3
C：SKOV3/Neo
2.2 细胞对基质及基底膜成分的粘附能力 SKOV3/IL-2细胞对IV型胶原和Matrigel的粘附性较SKOV3和SKOV3/Neo明显增强，而对LN和FN的粘附性，3者间无明显差别，见附表。
2.3 基因修饰对细胞系CD44表达的影响 SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2 3组细胞CD44H阳性细胞百分率分别为76.2%、66.7%和37.8%，SKOV3/IL-2组阳性细胞百分率较SKOV3和SKOV3/Neo组明显降低(P<0.01)。
附表 细胞对基质及基底膜成分的粘附能力(%) 指标
SKOV3/IL-2
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SKOV3/Neo
SKOV3
LN
FN
Ⅳ型胶原
Matrigel
21.4
15.3
41.1
27.4
19.4
20.2
61.9
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73.3
21.8
20.1
62.2
72.4
3 讨论
粘附、水解酶分泌、运动是肿瘤细胞侵蚀的3个基本环节。肿瘤细胞与LN、FN及Ⅳ型胶原等的粘附，是肿瘤转移不可缺少的环节。本实验通过EDTA介导的细胞分离实验，对FN、LN、Ⅳ型胶原等基底膜成分及重组基底膜成分Matrigel的粘附实验表明，SKOV3/IL-2对塑料基质及Ⅳ型胶原、Matrigel等细胞基底膜成分的粘附能力降低。裸鼠移殖瘤镜下所见显示，SKOV3组肿瘤细胞具有较强的侵蚀能力，肿瘤组织可突破肿瘤包膜，向邻近组织如肌肉侵蚀，形成转移病灶；而SKOV3/IL-2组肿瘤包膜完整，邻近组织内未见转移灶。基因转移所引起的细胞粘附性和侵蚀性降低的确切原因尚不清楚，可能与IL-2基因转移所引起的细胞膜表面相应受体或粘附分子，如CD44表达的改变有关。
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卵巢癌细胞表面有CD44H的表达，与卵巢癌腹膜腔内播散的转移特性有很大关系[3]，CD44H(+)的卵巢癌患者，其肿瘤期别、患者生存期均低于CD44H(-)者，CD44H与预后有明显的关系[4]。本实验测定了卵巢癌细胞系SKOV3细胞膜表面CD44H的表达，野生型细胞CD44H(+)细胞占76.2%，而SKOV3/IL-2细胞CD44(+)细胞降为37.8%，表明IL-2基因修饰可下调SKOV3细胞CD44H表达，CD44H表达的下降，提示SKOV3/IL-2细胞转移能力降低。本研究首次证实IL-2基因转移可引起SKOV3细胞转移能力和裸鼠体内侵蚀能力降低，对于改善卵巢癌患者的预后无疑具有极为重要的意义，为体内IL-2基因转移的研究奠下了基础。
参考文献
1.张震宇，郎景和，等.白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3形态及增殖的影响.中华妇产科杂志 1998，33(10)：614
, 百拇医药
2.Aruffo A，stamenkoric I，Melick M，et al.A lymphoid cell surface glycoprotein involved in endothelial cell recognition and lymphocyte homing in man.Eur J Immunol 1986；16；1195
3.曲梵梵，焦书竹，陈斌琪，等.CD44H与卵巢癌种植的初步研究.第五次全国妇科肿瘤学术会议论文汇编，北京，1996
4 Cannistra SA，Kansas GS，Niloff J，et al.Binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro is partly mediated by CD44H.Cancer Res 1993；53：3830
(收稿日期 1998-06-09), http://www.100md.com(张震宇1 郎景和2)
单位：张震宇 北京军区总医院妇产科100700 郎景和 北京协和医院妇产科
关键词：白细胞介素2基因；卵巢癌；基因治疗；粘附性
现代妇产科进展990107 摘要 目的：研究IL-2基因转移对卵巢癌SKOV3细胞系粘附性的影响。方法：细胞对塑料基质、细胞基底膜成分的粘附实验，流式细胞术测定CD44H的表达。结果：EDTA介导的细胞分离实验表明，SKOV3/IL-2细胞对塑料基质的粘附能力明显下降(P<0.01)；对基质及基底膜成分的粘附实验表明，SKOV3/IL-2细胞对Ⅳ型胶原和matrigel的粘附能力下降，但对LN、FN的粘附能力无明显改变；粘附分子CD44H的表达：SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/IL-2组细胞粘附分子CD44H阳性细胞百分率分别为76.2%、66.7%和37.8%，SKOV3/IL-2组明显降低(P<0.001)。结论：IL-2基因修饰可使卵巢癌细胞系SKOV3粘附能力下降。
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The effect of human interleukin-2 gene transfer on the adhesive ability of ovarian cancer cell line SKOV3.
Zhang Zhenyu.Lang Jinghe.
1Dept.of Gynecology and Obstetrics，General Hospital of Beijing
Military Command，100700 2 Peking Union Medical College Hospital
Abstract Objective：To evaluate the adhesive ability of ovarian cancer cell line SKOV3 and the IL-2 gene modified cells.Methods：EDTA-induced cell detachment and cell adhesive ability to LN，FN，collagen Ⅳ and matrgel were performed.The percentage of CD44H positive cells was detected by FCM. Results：Cell adhesion tests showed that the hIL-2 modified SKOV3 cells adhered less effectively to plastic substance，collagen Ⅳ and matrigel，but there were no significant difference to LN and FN.The percentage of CD44H positive cells decreased from 76.2% of parental SKOV3 cells to 37.8% of hIL-2 gene modified cells.Conclusion：IL-2 gene modification can significantly decrease the adhesive ability of SKOV3 cells.
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Key words Interleukin-2 Gene；Ovarian neoplasms；gene therapy；Adhesiveness
卵巢上皮癌病程早期即于腹盆腔内广泛种植、播散，是影响患者预后的主要因素之一，粘附是肿瘤细胞转移的主要环节之一，肿瘤细胞对细胞基质的粘附性及CD44H的表达是评价细胞转移性的重要指标。白细胞介素-2(IL-2)基因转移可使卵巢癌细胞系SKOV3的形态、增殖和致瘤性发生一系列改变，但对卵巢癌细胞转移性的影响尚未见报道。本研究通过细胞对塑料基质、细胞基底膜成分的粘附实验及CD44H表达的测定明确了IL-2基因转移对卵巢癌细胞系SKOV3转移性的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞系 SKOV3为卵巢腺癌细胞系，本科冻存，培养于含10%新生牛血清、100U/ml青霉素、50mg/ml链霉素的DMEM培养基中。SKOV3/Neo由逆转录病毒介导将新霉素抗性基因Neo导入SKOV3细胞而建立，具有新霉素抗性。SKOV3/IL2系IL-2分泌卵巢癌细胞，由逆转录病毒介导，将人IL-2基因导入SKOV3细胞而建立(另文发表)，IL-2分泌量为318U/106细胞/24h，具有新霉素抗性。
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1.2 EDTA介导的细胞分离实验 收集待测细胞，制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度至1×104/ml，将1×104待测细胞接种于6孔培养板，加入完全培养液，常规培养；5d后取出培养板，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2遍后加入0.02%EDTA/孔，37℃水平摇床100r/min摇动，分别于摇动后5、10、15、20min收集消化液，仍未脱落之细胞加胰酶消化后吹打，计数各时相消化液中的细胞数，各时相脱落细胞数与培养板中残留细胞数之和为细胞总数；细胞脱落率的计算公式如下：
1.3 细胞对不同基质成分和基底膜成分的粘附性实验 ①30μg/ml LN、FN、IV型胶原溶液(北京医科大学细胞生物学教研室提供)100μl加入96孔平底培养板，每个时相点分别设4个复孔，37℃孵育1h，用PBS洗涤2遍，1%BSA (Sigma)100μl/孔，室温孵育2h，用PBS洗涤2遍备用；②30μg/ml Matrigel(人工基底膜，北京医科大学细胞生物学教研室提供)或多聚赖氨酸(plys,Sigma)100μl/孔加入96孔平底培养板，每个时相点设4个复孔，37℃孵育2h，用PBS洗涤2遍备用；③对数生长期待测细胞胰酶消化，制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105/ml，于预包被培养板每孔加入细胞悬液100μl，37℃、5%CO2、饱和湿度孵育；④60min后取出培养板，用PBS洗涤2遍，去除未粘附细胞，加入含0.25%胰酶、0.02%EDTA消化液100μl，37℃孵育10min，吹打，计数；(5)以多聚赖氨酸预包被者为100%，计算各种细胞对不同基质成分粘附的相对百分率。
, http://www.100md.com
1.4 流式细胞术检测细胞膜表面CD44H 收集对数生长期待测细胞，制成单细胞悬液，计数，用2%NCS/PBS洗涤2遍，待测细胞1×106，离心沉淀，鼠抗人单克隆抗体CD44H(DAKO)稀释液100μl重悬，37℃孵育30～60min，用2%NCS/PBS洗涤3遍，荧光标记的免抗鼠IgG(福兴公司)稀释液100μl，37℃孵育30min,用2%NCS/PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定过夜，流式细胞仪检测阳性细胞百分率。
2 结果
2.1 细胞对塑料基质的粘附能力 亲本细胞及基因修饰细胞各时相点细胞脱落累积百分率，见附图。SKOV3/IL-2组各时相点细胞脱落百分率均高于SKOV3和SKOV3/Neo组(P<0.01)。
附图 EDTA介导的细胞分离实验
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A：SKOV3/IL2 B：SKOV3
C：SKOV3/Neo
2.2 细胞对基质及基底膜成分的粘附能力 SKOV3/IL-2细胞对IV型胶原和Matrigel的粘附性较SKOV3和SKOV3/Neo明显增强，而对LN和FN的粘附性，3者间无明显差别，见附表。
2.3 基因修饰对细胞系CD44表达的影响 SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2 3组细胞CD44H阳性细胞百分率分别为76.2%、66.7%和37.8%，SKOV3/IL-2组阳性细胞百分率较SKOV3和SKOV3/Neo组明显降低(P<0.01)。
附表 细胞对基质及基底膜成分的粘附能力(%) 指标
SKOV3/IL-2
, http://www.100md.com
SKOV3/Neo
SKOV3
LN
FN
Ⅳ型胶原
Matrigel
21.4
15.3
41.1
27.4
19.4
20.2
61.9
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73.3
21.8
20.1
62.2
72.4
3 讨论
粘附、水解酶分泌、运动是肿瘤细胞侵蚀的3个基本环节。肿瘤细胞与LN、FN及Ⅳ型胶原等的粘附，是肿瘤转移不可缺少的环节。本实验通过EDTA介导的细胞分离实验，对FN、LN、Ⅳ型胶原等基底膜成分及重组基底膜成分Matrigel的粘附实验表明，SKOV3/IL-2对塑料基质及Ⅳ型胶原、Matrigel等细胞基底膜成分的粘附能力降低。裸鼠移殖瘤镜下所见显示，SKOV3组肿瘤细胞具有较强的侵蚀能力，肿瘤组织可突破肿瘤包膜，向邻近组织如肌肉侵蚀，形成转移病灶；而SKOV3/IL-2组肿瘤包膜完整，邻近组织内未见转移灶。基因转移所引起的细胞粘附性和侵蚀性降低的确切原因尚不清楚，可能与IL-2基因转移所引起的细胞膜表面相应受体或粘附分子，如CD44表达的改变有关。
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卵巢癌细胞表面有CD44H的表达，与卵巢癌腹膜腔内播散的转移特性有很大关系[3]，CD44H(+)的卵巢癌患者，其肿瘤期别、患者生存期均低于CD44H(-)者，CD44H与预后有明显的关系[4]。本实验测定了卵巢癌细胞系SKOV3细胞膜表面CD44H的表达，野生型细胞CD44H(+)细胞占76.2%，而SKOV3/IL-2细胞CD44(+)细胞降为37.8%，表明IL-2基因修饰可下调SKOV3细胞CD44H表达，CD44H表达的下降，提示SKOV3/IL-2细胞转移能力降低。本研究首次证实IL-2基因转移可引起SKOV3细胞转移能力和裸鼠体内侵蚀能力降低，对于改善卵巢癌患者的预后无疑具有极为重要的意义，为体内IL-2基因转移的研究奠下了基础。
参考文献
1.张震宇，郎景和，等.白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3形态及增殖的影响.中华妇产科杂志 1998，33(10)：614
, 百拇医药
2.Aruffo A，stamenkoric I，Melick M，et al.A lymphoid cell surface glycoprotein involved in endothelial cell recognition and lymphocyte homing in man.Eur J Immunol 1986；16；1195
3.曲梵梵，焦书竹，陈斌琪，等.CD44H与卵巢癌种植的初步研究.第五次全国妇科肿瘤学术会议论文汇编，北京，1996
4 Cannistra SA，Kansas GS，Niloff J，et al.Binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro is partly mediated by CD44H.Cancer Res 1993；53：3830
(收稿日期 1998-06-09), http://www.100md.com(张震宇1 郎景和2)