大鼠心肌急性缺血再灌注Fos蛋白表达及其意义
作者：马孟云 徐小虎 陈玉川 罗斌 陈建国 赵连旭 祝家镇
单位：马孟云 陈玉川 罗斌 陈建国 赵连旭 祝家镇 中山医科大学法医病理学教研室； 广州，510089；徐小虎 汕头大学医学院法医研究所； 汕头，515031
关键词：心肌再灌注损伤；原癌基因蛋白质c-fos类；免疫组织化学；大鼠
中山医科大学学报990408
摘 要 目的：探讨急性心肌缺血再灌注早期不同时间心肌细胞内Fos蛋白表达的变化，为心肌早期缺血再灌注损伤致死死后诊断提供新方法。方法：在32只SD大鼠建立心肌早期缺血再灌注损伤模型，另外40只大鼠分为正常与缺血对照组。用免疫组化SABC法结合图象分析研究心肌细胞核Fos蛋白的累积情况。结果：缺血30 min再灌注30 min后，再灌注区有部分心肌细胞核呈弱阳性着色，以后随缺血时间延长核阳性增强。 缺血90 min再灌注30 min后核棕褐色染色最强，180 min后又开始减弱。正常和单纯缺血组心肌细胞核未见有阳性反应。HE染色无明显病理改变。结论：Fos 蛋白表达高峰在缺血90～180 min之间，Fos-SABC染色法可诊断缺血30 min再灌注30 min或更长时间的损伤。免疫组化染色法检测心肌细胞核Fos蛋白的表达有望成为急性心肌缺血再灌注死后诊断的一种有意义的手段。
, 百拇医药
中图号 R 541.1； R 89
Expression and Significance of Fos Protein on Myocardial Acute Ischemia/Reperfusion Injury in Rats
Ma Mengyun1 Xu Xiaohu2 Chen Yuchuan1 Luo Bin1 Chen Jianguo1 Zhao Lianxu1 Zhu Jiazhen1
( 1 Department of Forensic Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou,510089
, http://www.100md.com
2 Institute of Forensic Medicine, Shantou University Medical College, Shantou, 515031)
Abstract Objective: To investigate the changes of Fos protein induced by myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) during acute period, and provide a new method for postmortem diagnosis of acute ischemia/rperfusion. Methods: It was established that the model of MI/R successfully in 32 anaethetized SD rats. Parallelly, the other 40 rats were used as normal and ischemic control. Immunohistochemical SABC method and computerized image analysis were used to observe alterations of Fos protein in nuclei of cardiac myocytes. Results: After 30 min ischemia followed by 30 min reperfusion, the area of MI/R showed a part of nuclei of cardiac myocytes weak staining, and became stronger with the elongation of ischemia. But after 90 min ischemia followed by 30 min reperfusion, staining of nuclei of cardiac myocytes was strongest, it began to attenuate after 180 min. The myocardium in normal and ischemic control animals showed negative staining. No changes were seen with HE staining in all groups. Conclusion: There is a high point of Fos protein expression during the period of 90 to 180 min. SABC immunohistochemical method may reveal injury of myocardial 30 min ischemia/30 min reperfusion or longer time. Immunohistochemical detection of Fos protein in nuclei of cardiomyocytes would be a meaningful tool for the postmortem diagnosis of myocardial acute ischemia/reperfusion.
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Subject headings myocardial reperfusion injury; proto-oncogene proteins c-fos; immunohistochemistry; rats
心肌急性缺血再灌注损伤是心脏性猝死的主要原因之一，在心性猝死中占有重要的地位[1]。多年来已引起许多学者的重视并且对其死后诊断进行了大量的研究，但准确诊断仍然没有彻底解决。大鼠心肌早期缺血再灌注后引起心肌局部的应激反应蛋白Fos蛋白发生了变化，本文对其进行免疫组化研究，旨在为法医实践中怀疑为急性缺血再灌注死亡案例的死因鉴定探索一种灵敏、特异且实用的形态学指标。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
中山医科大学动物中心提供的SD大鼠72只，雌雄不限，体重180～250 g。设立正常对照、缺血和缺血再灌注组。将72只SD大鼠随机分为9组，每小组8只。另外，正常对照组(A组)设立一小组8只大鼠；缺血组(B组)分为4小组共32只；缺血再灌注组(C组)根据缺血时间不同也分为4小组。A组：为麻醉开胸不结扎组。B组：B1组为缺血30 min组；B2组缺血60 min组；B3组为90 min组； B4组缺血180 min。C组：C1组缺血30 min再灌注30 min；C2组缺血60 min再灌注30 min；C3组缺血90 min再灌注30 min；C4组缺血180 min再灌注30 min。
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1.2 试 剂
Fos一抗、DAB显色试剂盒与SABC试剂盒均购于武汉博士德公司。
1.3 鼠心肌缺血再灌注模型的制作[2，3]
大鼠用戊巴比妥钠(20 g/L)腹腔注射麻醉(45 mg/kg)后，按文献[2，3]复制早期缺血再灌模型及心律失常评分。
1.4 心脏组织处理过程
分别在各组大鼠相应的时间点完整剪取心脏，以体积分数为0.1的福尔马林固定24 h后，在左心室尖部至底部中间作心脏横切取材，常规脱水、石蜡包埋及制片。
1.5 Fos-SABC免疫组化及常规染色方法
SABC是链酶亲和素—生物素—酶复合物(Strept avidin-biotin complex)的英文缩写，此方法操作程序同S—P和LSAB法，但更为敏感特异。各组心脏标本切片，按照SABC试剂盒内说明书进行Fos-SABC免疫组化染色操作。以正常大鼠、单纯缺血组大鼠作对照。PSB取代一抗、二抗作阴性对照。各组切片进行常规HE染色。
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1.6 图像分析与统计学处理
各组玻片均应用英国Quantimet-520图像分析仪对免疫组化染色的阳性反应产物进行定量检测分析，具体操作为低倍镜找视野，调至400×，自动控制装置随即机选10个位点测量阳性细胞率与灰度值，然后取平均值。灰度从最大到最小共分为255个层次，其中灰度值愈大则阳性反应物的强度愈小。所有数据应用SPSS for Windows软件包进行方差分析，t检验等统计学处理。数据用
±s表示。
2 结 果
2.1 心电图指标观察
B组与C组大鼠均有心律失常发生，程度不一。心律失常评分结果与文献[2]结果类似。
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2.2 常规HE染色
各组心肌细胞染色清晰，横纹清楚，细胞核致密清晰。除心肌嗜伊红性增强及肌纤维肿胀，轻度心肌水肿外，未见明显病变。
2.3 SABC-Fos免疫组化染色
正常对照组：大鼠心肌组织未见阳性反应。缺血对照组：与正常对照组结果相似(图1)。缺血再灌注组：缺血30 min再灌注30 min(C1组)后心肌细胞核淡棕色着色散在分布；缺血60 min再灌注30 min组(C2组)核阳性增强，C3组核阳性最强(图2)，而C4组核阳性又开始减弱，形成鲜明的对比。
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图1 对照组心肌细胞核Fos阴性
Fig.1 Fos negative nuclei of cardiac myocytes in control groups(SABC ×400)
图2 再灌流区大量的心肌细胞核Fos阳性
Fig.2 A large amount of Fos positive nuclei of cardiac myocytes can be seen in reperfusion area(Group C3,SABC ×400)
2.4 图像分析处理
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各组心脏标本Fos免疫组化染色图像分析结果见表1。
表1 各组Fos蛋白免疫组化染色阳性细胞率
Table 1 Rate of Fos protein positive staining in cardiac myocytes of each group
(±s，%) t(Reperfu-
sion)/min
t(Ischemia)/min
, 百拇医药
0
30
60
90
180
0
1.3±0.6
2.3±1.5
2.3±1.5
2.3±1.5
2.3±1.5
30
1.3±0.6
, 百拇医药
17.8±9.71)
20.3±3.31)
65.4±10.81),2)
41.5±7.11)
1) Compared with normal and ischemic control groups, P<0.01; 2) compared with C1、C2 and C4 groups,P<0.05
结果说明，在C1～C3组之间，心肌细胞核阳性率与染色强度随缺血时间的延长而增强，缺血90 min再灌注30 min时核阳性最多，最强。
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3 讨 论
3.1 Fos-SABC染色法对显示心肌缺血再灌的意义
Fos蛋白是原癌基因C-fos的蛋白产物。它们不仅参与正常心肌的生长和发育，是心肌生长的一个触发因素和调节因素。并且也是心血管系统应激反应基因和蛋白。可是在成年心肌细胞很少表达或不表达[4]。近年有些学者的研究成果表明，不但在脑[5]、肝[6]与肾脏[7]等早期缺血再灌注模型上观察到有c-fos基因和Fos蛋白的表达，而且在心肌缺血再灌注模型上发现缺血5 min再灌注10 min，c-fos mRNA开始有少量表达。且表达增加是时间依赖性的，而正常与单纯缺血组未见阳性表达[8，9]。
本文用SABC免疫组化染色法观察了Fos蛋白在心肌局部的变化情况，并对观察结果进行图像分析与统计学处理。结果观察到：缺血30 min再灌注30 min后，在缺血再灌流区散在心肌细胞核Fos蛋白免疫组化阳性，而缺血90 min再灌注30 min后Fos蛋白阳性反应增强，180 min后有所减弱。而对照组及非缺血区细胞核呈阴性。说明Fos蛋白随缺血时间延长而在核内累积增加，且在90～180 min之间可能有一高峰期。由此可见，Fos-SABC法可诊断心肌缺血30 min再灌注30 min或更长时间的缺血再灌注。而 Webster等人[10](1993)在培养乳鼠心肌细胞缺氧后1～4 h内，c-fos基因表达达高峰，是对照组5～10倍。在细胞发生不可逆损伤之前，用抗Fos抗体免疫染色揭示了缺氧细胞核中蛋白的积累。两者结果不一致可能是由于缺血再灌注与缺氧诱导c-fos表达的时程与机制不同，且可能受鼠龄的影响。
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3.2 心肌缺血再灌c-fos表达的机理与作用探讨
值得注意的是，原癌基因c-fos的诱导仅仅在缺血后的再灌注期间被检测到。目前公认的机理是[9，10]：再灌注介导的自由基大量生成；与再灌注有关的钙离子超载；缺血介导的蛋白质合成抑制，同时缺血后，PKC和raf等细胞激酶的激活等，这些因素均可诱导原癌基因c-fos的表达。在此种情况下c-fos基因与蛋白作为应激反应基因与蛋白出现，作为第三信使，使某些基因的表达发生改变，并转而调控其它基因，结果是激活细胞增殖并启动了细胞修复过程，有助于可逆性损伤的修复[10]。但若过度表达可致心肌细胞凋亡[11]。鉴于此，大部分学者认为原癌基因c-fos及蛋白是再灌注的特征性指标。
3.3 Fos-SABC法诊断法医学心性猝死的价值
冠心病猝死及青壮年猝死综合症，由其他器质性病变所致除外，尚有很多情况是由冠状动脉痉挛突然缓解和血栓溶解后的再灌注损伤触发的，而此类猝死者多发生在早期，有时仅是心脏电生理功能的改变，细胞及组织结构无明显的改变，此种情况用法医病理学常规方法检查找不到或仅见轻微病变，给判断死因带来困难。近几十年来国内外学者已从不同角度和水平对缺血再灌注进行了大量的研究。在形态学观察中，已有酶组织化学、荧光技术、电镜及免疫组织化学研究报道[3]。其中酶学、荧光及电镜技术虽然灵敏但是因缺乏特异性，且易受自溶影响，在法医实际检案中的作用受到限制。免疫组化染色以其高度特异性、灵敏性和实用性集一身，已得到普遍的接受。虽然各国学者用免疫组织化学方法已对缺血再灌注后的心肌肌动蛋白，结蛋白，波形蛋白和补体c5b-9等进行了研究，但仍没有获得满意的结果。资料表明[10]，c-fos的过度表达似乎是细胞终末分化的标志及死亡先兆，且先于细胞出现生化和死亡形态学改变数小时至数天。本文研究也发现Fos蛋白阳性表达在心肌细胞发生不可逆性损伤之前。在此情况下尽管心肌细胞结构未发生明显的改变，但是心肌细胞功能一定是发生了变化。由此可见，在法医实践中怀疑为心肌缺血再灌注猝死者可根据细胞核Fos阳性程度，不仅可以明确心肌急性缺血再灌注损伤，而且结合组织学等改变可估计缺血再灌注的时间及损伤程度。本方法已应用于63例人体心性猝死的检测，均于死后12～72 h取材，石蜡包埋切片，取得有意义的结果(另文报道)。因此，本方法对诊断心肌缺血再灌注损伤具有法医检案的实用价值。尽管如此，但是要达到能完善地在实践中应用的程度，却仍然有待于研究工作的进一步深入。
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3.4 需进一步研究的问题
①在各种不同之种属动物的研究；②增加各组动物数量和实验时间点，研究更短时间内Fos蛋白的变化规律；③Fos蛋白在缺血再灌注中的确切机制与作用。结合形态学、组织学和生物化学等方法，对缺血再灌注进行实验与应用研究，比单纯应用某一方法更有价值。总之，本研究明确了心肌急性缺血再灌注损伤与心性猝死的关系，并且发现Fos-SABC染色可诊断缺血30 min再灌注30 min或更长时间的损伤。这就为法医学心性猝死案例的死因鉴定提供了一项快速灵敏、准确特异而且实用的新方法。
参考文献
1 世界卫生组织科学小组报告. 心脏性猝死. 国外医学心血管分册，1986，2(4)：285
2 Liu P T, Hock C E, Nagele R, et al. Formation of nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischemia-reperfusion injury in rats. Am J Physiol, 1997,272(41):H2327
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3 Fu C Z, Song Y X, Zhu J Z, et al. Immunocytochemical study with HHF35 on myocardial ischemia and reperfusion injury in rats. Forensic Sci Int, 1993,59(1):25
4 Simpson P C. Proto-oncogenes and cardiac hypertrophy. Ann Rev Physiol, 1988,51:189
5 Liu J S. Delayed transhemispheric c-fos gene expression focal cerebral ischemia reperfusion. J Formos Med Assoc, 1995,94(11):649
6 Schlossberg H, Zhang Y, Dudus L, et al. Expression of c-fos and c-jun during hepatocellular remodeling following I/R in mouse liver. Hepatology, 1996,23(6):1546
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7 Rosenberg M E, Paller W S. Differential gene expression in the recovery from ischemic renal injury. Kidney Int, 1991,39(6):1156
8 Wechsler A S, Entwishe J C, Yeh J Jr, et al. Early gene changes in myocardial ischemia. Ann Thorac Surg, 1994,58(4):1282
9 Plumier J C, Robertson H A, Currie R W. Differential accumulation of mRNA for immediate early genes and heat shock gene in heart after ischemic injury. J Mol Cardiol, 1996,28(6):1251
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10 Webster K A, Discher D J, Bishopric N H. Induction and nuclear accumulation of Fos and Jun proto-oncogenes in hypoxic cardiac myocytes. J Bio Chem,1993,268(22):16852
11 Smeyne R E, Vendrell M, Hayward M, et al. Continuous c-fos expression precedes programmed cell death in vivo. Nature, 1993,363(1):166
(1999 - 01 - 29收稿 1999 - 09 - 16修回), 百拇医药
单位：马孟云 陈玉川 罗斌 陈建国 赵连旭 祝家镇 中山医科大学法医病理学教研室； 广州，510089；徐小虎 汕头大学医学院法医研究所； 汕头，515031
关键词：心肌再灌注损伤；原癌基因蛋白质c-fos类；免疫组织化学；大鼠
中山医科大学学报990408
摘 要 目的：探讨急性心肌缺血再灌注早期不同时间心肌细胞内Fos蛋白表达的变化，为心肌早期缺血再灌注损伤致死死后诊断提供新方法。方法：在32只SD大鼠建立心肌早期缺血再灌注损伤模型，另外40只大鼠分为正常与缺血对照组。用免疫组化SABC法结合图象分析研究心肌细胞核Fos蛋白的累积情况。结果：缺血30 min再灌注30 min后，再灌注区有部分心肌细胞核呈弱阳性着色，以后随缺血时间延长核阳性增强。 缺血90 min再灌注30 min后核棕褐色染色最强，180 min后又开始减弱。正常和单纯缺血组心肌细胞核未见有阳性反应。HE染色无明显病理改变。结论：Fos 蛋白表达高峰在缺血90～180 min之间，Fos-SABC染色法可诊断缺血30 min再灌注30 min或更长时间的损伤。免疫组化染色法检测心肌细胞核Fos蛋白的表达有望成为急性心肌缺血再灌注死后诊断的一种有意义的手段。
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中图号 R 541.1； R 89
Expression and Significance of Fos Protein on Myocardial Acute Ischemia/Reperfusion Injury in Rats
Ma Mengyun1 Xu Xiaohu2 Chen Yuchuan1 Luo Bin1 Chen Jianguo1 Zhao Lianxu1 Zhu Jiazhen1
( 1 Department of Forensic Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou,510089
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2 Institute of Forensic Medicine, Shantou University Medical College, Shantou, 515031)
Abstract Objective: To investigate the changes of Fos protein induced by myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) during acute period, and provide a new method for postmortem diagnosis of acute ischemia/rperfusion. Methods: It was established that the model of MI/R successfully in 32 anaethetized SD rats. Parallelly, the other 40 rats were used as normal and ischemic control. Immunohistochemical SABC method and computerized image analysis were used to observe alterations of Fos protein in nuclei of cardiac myocytes. Results: After 30 min ischemia followed by 30 min reperfusion, the area of MI/R showed a part of nuclei of cardiac myocytes weak staining, and became stronger with the elongation of ischemia. But after 90 min ischemia followed by 30 min reperfusion, staining of nuclei of cardiac myocytes was strongest, it began to attenuate after 180 min. The myocardium in normal and ischemic control animals showed negative staining. No changes were seen with HE staining in all groups. Conclusion: There is a high point of Fos protein expression during the period of 90 to 180 min. SABC immunohistochemical method may reveal injury of myocardial 30 min ischemia/30 min reperfusion or longer time. Immunohistochemical detection of Fos protein in nuclei of cardiomyocytes would be a meaningful tool for the postmortem diagnosis of myocardial acute ischemia/reperfusion.
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Subject headings myocardial reperfusion injury; proto-oncogene proteins c-fos; immunohistochemistry; rats
心肌急性缺血再灌注损伤是心脏性猝死的主要原因之一，在心性猝死中占有重要的地位[1]。多年来已引起许多学者的重视并且对其死后诊断进行了大量的研究，但准确诊断仍然没有彻底解决。大鼠心肌早期缺血再灌注后引起心肌局部的应激反应蛋白Fos蛋白发生了变化，本文对其进行免疫组化研究，旨在为法医实践中怀疑为急性缺血再灌注死亡案例的死因鉴定探索一种灵敏、特异且实用的形态学指标。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
中山医科大学动物中心提供的SD大鼠72只，雌雄不限，体重180～250 g。设立正常对照、缺血和缺血再灌注组。将72只SD大鼠随机分为9组，每小组8只。另外，正常对照组(A组)设立一小组8只大鼠；缺血组(B组)分为4小组共32只；缺血再灌注组(C组)根据缺血时间不同也分为4小组。A组：为麻醉开胸不结扎组。B组：B1组为缺血30 min组；B2组缺血60 min组；B3组为90 min组； B4组缺血180 min。C组：C1组缺血30 min再灌注30 min；C2组缺血60 min再灌注30 min；C3组缺血90 min再灌注30 min；C4组缺血180 min再灌注30 min。
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1.2 试 剂
Fos一抗、DAB显色试剂盒与SABC试剂盒均购于武汉博士德公司。
1.3 鼠心肌缺血再灌注模型的制作[2，3]
大鼠用戊巴比妥钠(20 g/L)腹腔注射麻醉(45 mg/kg)后，按文献[2，3]复制早期缺血再灌模型及心律失常评分。
1.4 心脏组织处理过程
分别在各组大鼠相应的时间点完整剪取心脏，以体积分数为0.1的福尔马林固定24 h后，在左心室尖部至底部中间作心脏横切取材，常规脱水、石蜡包埋及制片。
1.5 Fos-SABC免疫组化及常规染色方法
SABC是链酶亲和素—生物素—酶复合物(Strept avidin-biotin complex)的英文缩写，此方法操作程序同S—P和LSAB法，但更为敏感特异。各组心脏标本切片，按照SABC试剂盒内说明书进行Fos-SABC免疫组化染色操作。以正常大鼠、单纯缺血组大鼠作对照。PSB取代一抗、二抗作阴性对照。各组切片进行常规HE染色。
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1.6 图像分析与统计学处理
各组玻片均应用英国Quantimet-520图像分析仪对免疫组化染色的阳性反应产物进行定量检测分析，具体操作为低倍镜找视野，调至400×，自动控制装置随即机选10个位点测量阳性细胞率与灰度值，然后取平均值。灰度从最大到最小共分为255个层次，其中灰度值愈大则阳性反应物的强度愈小。所有数据应用SPSS for Windows软件包进行方差分析，t检验等统计学处理。数据用
±s表示。2 结 果
2.1 心电图指标观察
B组与C组大鼠均有心律失常发生，程度不一。心律失常评分结果与文献[2]结果类似。
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2.2 常规HE染色
各组心肌细胞染色清晰，横纹清楚，细胞核致密清晰。除心肌嗜伊红性增强及肌纤维肿胀，轻度心肌水肿外，未见明显病变。
2.3 SABC-Fos免疫组化染色
正常对照组：大鼠心肌组织未见阳性反应。缺血对照组：与正常对照组结果相似(图1)。缺血再灌注组：缺血30 min再灌注30 min(C1组)后心肌细胞核淡棕色着色散在分布；缺血60 min再灌注30 min组(C2组)核阳性增强，C3组核阳性最强(图2)，而C4组核阳性又开始减弱，形成鲜明的对比。
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图1 对照组心肌细胞核Fos阴性
Fig.1 Fos negative nuclei of cardiac myocytes in control groups(SABC ×400)
图2 再灌流区大量的心肌细胞核Fos阳性
Fig.2 A large amount of Fos positive nuclei of cardiac myocytes can be seen in reperfusion area(Group C3,SABC ×400)
2.4 图像分析处理
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各组心脏标本Fos免疫组化染色图像分析结果见表1。
表1 各组Fos蛋白免疫组化染色阳性细胞率
Table 1 Rate of Fos protein positive staining in cardiac myocytes of each group
(
±s，%) t(Reperfu-sion)/min
t(Ischemia)/min
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0
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2.3±1.5
2.3±1.5
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17.8±9.71)
20.3±3.31)
65.4±10.81),2)
41.5±7.11)
1) Compared with normal and ischemic control groups, P<0.01; 2) compared with C1、C2 and C4 groups,P<0.05
结果说明，在C1～C3组之间，心肌细胞核阳性率与染色强度随缺血时间的延长而增强，缺血90 min再灌注30 min时核阳性最多，最强。
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3 讨 论
3.1 Fos-SABC染色法对显示心肌缺血再灌的意义
Fos蛋白是原癌基因C-fos的蛋白产物。它们不仅参与正常心肌的生长和发育，是心肌生长的一个触发因素和调节因素。并且也是心血管系统应激反应基因和蛋白。可是在成年心肌细胞很少表达或不表达[4]。近年有些学者的研究成果表明，不但在脑[5]、肝[6]与肾脏[7]等早期缺血再灌注模型上观察到有c-fos基因和Fos蛋白的表达，而且在心肌缺血再灌注模型上发现缺血5 min再灌注10 min，c-fos mRNA开始有少量表达。且表达增加是时间依赖性的，而正常与单纯缺血组未见阳性表达[8，9]。
本文用SABC免疫组化染色法观察了Fos蛋白在心肌局部的变化情况，并对观察结果进行图像分析与统计学处理。结果观察到：缺血30 min再灌注30 min后，在缺血再灌流区散在心肌细胞核Fos蛋白免疫组化阳性，而缺血90 min再灌注30 min后Fos蛋白阳性反应增强，180 min后有所减弱。而对照组及非缺血区细胞核呈阴性。说明Fos蛋白随缺血时间延长而在核内累积增加，且在90～180 min之间可能有一高峰期。由此可见，Fos-SABC法可诊断心肌缺血30 min再灌注30 min或更长时间的缺血再灌注。而 Webster等人[10](1993)在培养乳鼠心肌细胞缺氧后1～4 h内，c-fos基因表达达高峰，是对照组5～10倍。在细胞发生不可逆损伤之前，用抗Fos抗体免疫染色揭示了缺氧细胞核中蛋白的积累。两者结果不一致可能是由于缺血再灌注与缺氧诱导c-fos表达的时程与机制不同，且可能受鼠龄的影响。
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3.2 心肌缺血再灌c-fos表达的机理与作用探讨
值得注意的是，原癌基因c-fos的诱导仅仅在缺血后的再灌注期间被检测到。目前公认的机理是[9，10]：再灌注介导的自由基大量生成；与再灌注有关的钙离子超载；缺血介导的蛋白质合成抑制，同时缺血后，PKC和raf等细胞激酶的激活等，这些因素均可诱导原癌基因c-fos的表达。在此种情况下c-fos基因与蛋白作为应激反应基因与蛋白出现，作为第三信使，使某些基因的表达发生改变，并转而调控其它基因，结果是激活细胞增殖并启动了细胞修复过程，有助于可逆性损伤的修复[10]。但若过度表达可致心肌细胞凋亡[11]。鉴于此，大部分学者认为原癌基因c-fos及蛋白是再灌注的特征性指标。
3.3 Fos-SABC法诊断法医学心性猝死的价值
冠心病猝死及青壮年猝死综合症，由其他器质性病变所致除外，尚有很多情况是由冠状动脉痉挛突然缓解和血栓溶解后的再灌注损伤触发的，而此类猝死者多发生在早期，有时仅是心脏电生理功能的改变，细胞及组织结构无明显的改变，此种情况用法医病理学常规方法检查找不到或仅见轻微病变，给判断死因带来困难。近几十年来国内外学者已从不同角度和水平对缺血再灌注进行了大量的研究。在形态学观察中，已有酶组织化学、荧光技术、电镜及免疫组织化学研究报道[3]。其中酶学、荧光及电镜技术虽然灵敏但是因缺乏特异性，且易受自溶影响，在法医实际检案中的作用受到限制。免疫组化染色以其高度特异性、灵敏性和实用性集一身，已得到普遍的接受。虽然各国学者用免疫组织化学方法已对缺血再灌注后的心肌肌动蛋白，结蛋白，波形蛋白和补体c5b-9等进行了研究，但仍没有获得满意的结果。资料表明[10]，c-fos的过度表达似乎是细胞终末分化的标志及死亡先兆，且先于细胞出现生化和死亡形态学改变数小时至数天。本文研究也发现Fos蛋白阳性表达在心肌细胞发生不可逆性损伤之前。在此情况下尽管心肌细胞结构未发生明显的改变，但是心肌细胞功能一定是发生了变化。由此可见，在法医实践中怀疑为心肌缺血再灌注猝死者可根据细胞核Fos阳性程度，不仅可以明确心肌急性缺血再灌注损伤，而且结合组织学等改变可估计缺血再灌注的时间及损伤程度。本方法已应用于63例人体心性猝死的检测，均于死后12～72 h取材，石蜡包埋切片，取得有意义的结果(另文报道)。因此，本方法对诊断心肌缺血再灌注损伤具有法医检案的实用价值。尽管如此，但是要达到能完善地在实践中应用的程度，却仍然有待于研究工作的进一步深入。
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3.4 需进一步研究的问题
①在各种不同之种属动物的研究；②增加各组动物数量和实验时间点，研究更短时间内Fos蛋白的变化规律；③Fos蛋白在缺血再灌注中的确切机制与作用。结合形态学、组织学和生物化学等方法，对缺血再灌注进行实验与应用研究，比单纯应用某一方法更有价值。总之，本研究明确了心肌急性缺血再灌注损伤与心性猝死的关系，并且发现Fos-SABC染色可诊断缺血30 min再灌注30 min或更长时间的损伤。这就为法医学心性猝死案例的死因鉴定提供了一项快速灵敏、准确特异而且实用的新方法。
参考文献
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(1999 - 01 - 29收稿 1999 - 09 - 16修回), 百拇医药