献血员庚型肝炎病毒感染情况和部分基因序列分析*
作者：赵国强 邢培清 苏 堤 胡志荣 刘利民 马宏伟 王 凯
单位：赵国强 苏堤 胡志荣(河南医科大学微生物学与免疫学教研 郑州 450052)；邢培清 刘利民 马宏伟 王凯(河南省红十字血液中心 郑州 450003)
关键词：献血员；庚型肝炎病毒；聚合酶链反应；序列分析
河南医科大学学报990214 摘要 目的：为探讨河南省献血员中庚型肝炎病毒(HGV)的感染情况和病毒基因的变异特征。方法：利用逆转录-巢式-聚合酶链反应(RT-Nest-PCR)检测HGVRNA；克隆入T载体并测序。结果：在300名义务献血员中发现1例庚型肝炎病毒RNA阳性；200例初检合格献血员标本中无1例阳性。河南株HGV与GenBank中HGV对应位置序列的同源性为90.9%～98.8%。结论：河南省义务献血员中有HGV携带者；河南株HGV与国内(河北株HGU75356)分离株的同源性为98.8%，其同源性高于国外分离株(90.9%～95.2%)；建议对献血员增加HGV检测。
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中图分类号 R512.63
Detection of hepatitis G virus infection in donors and sequencing of partial gene
Zhao Guoqiang1) , Xing Peiqing2) , Su Di1) , Hu Zhirong1) , Liu Limin2) , Ma Hongwei2) ,Wang kai2)
1)Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University,Zhengz hou 450052 2)The Red Cross Blood Center of Henan， Zhengzhou 450003
, 百拇医药
Abstract Aim：In order to study hepatitis G virus (HGV) infection in volunt ary donors of Henan province and characteristics of gene mutation. Methods：HGV RNA was detected by reverse transcription nest polymerase chain reaction (RT-Nest-PCR). Partial gene was cloned and sequenced.Results：One posi tive case of HGV RNA was detected in 300 voluntary donors and HGV RNA in 200 initial screened donor were all negative.The sequence showed 90.9%～98.8% nucleotide homology to the corresponding region of HGV in Genbank.The nucleotide homology between Henan st rain HGV and Hebei is higher than that between Henan and foreign country strains.Conclusion：The existence of HGV infection in Henan has been a ffirmed and it is suggesting that screening for blood donors is of importance to transfusion secu rity.
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Key words Donor, Hepatitis G virus, PCR, Sequencing
近年来的研究表明除了HAV、HBV、HCV、HDV、HEV外，仍存在有未知的肝炎病毒。Simons等[1]于1995年在非甲～戊型肝炎患者血浆中发现了一种新的人类肝炎相关的病毒，暂称之为HGV/GBV-C,国内称之为庚型肝炎病毒。为了研究河南省庚型肝炎病毒的感染情况及河南株基因的变异特点，作者利用RT-Nest-PCR方法对300名义务献血员、200例初检合格献血员标本进行了检测和部分基因的克隆及cDNA序列分析。
1 材料与方法
1.1 标本及来源 河南省红十字血液中心200例初检合格献血员标本。300名义务献血员为郑州市高校在校生。以上标本用常规方法分离血清，-20℃保存。
1.2 标准病毒和引物 标准病毒由美国NIH提供。引物参照GenBank中国株HGU75356[2]以及国外株HGU44402、HGU45966和HGU36380设计出一组巢式引物，扩增区为相对保守的非结构基因NS5，第二轮扩增靶片段长度为504bp。引物见表1。
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表1 HGV巢式引物 引物
序列
位置
内引物F1
5'GAAGACTCAGAACTGACTGA3'
6689～6708
内引物R1
5'ATAGGCTGTATGGTTCTGGA3'
7192～7173
外引物F2
5'GAGATTGGGACGGAGACTG3'
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6671～6689
外引物R2
5'CACCAAGCACCCAACTTGC3'
7240～7222
1.3 标本处理 取血清200μl加200μl裂解液(8mol/L异硫氰酸胍、42mmol/L柠檬酸钠、8.3g/L的十二烷基肌氨酸、0.2mmol/Lβ-巯基乙醇)，充分混匀，室温放置10min，然后加入2 mol/L醋酸钠40μl、V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)为(25∶24∶1)的液体400μl，混合后冰浴10min，12000r/min离心20min，取上层水相至另一管中，加等体积预冷异丙醇，-20℃过夜。12000r/min离心20min，去上清，体积分数为75%乙醇洗一次，真空干燥，用10μlDEPC水溶解，-20℃备用。
1.4 逆转录 10×RT缓冲液(含50mmol/LMgCl2)2μl，10mmol/L4×dNTP2μl，RNasin40U，AMV10U，外引物R21μl，最后加入变性处理(94℃水浴，5min后立刻放入冰浴)过的提取标本14μl，用2滴液体石蜡封顶，42℃水浴逆转录45min。
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1.5 PCR扩增 第一轮扩增反应体积为30μl,10×缓冲液3μl，10mmol/L4×dNTP2μl，外引物F2和R2各1μl，Taq酶2U，DEPCH2O17μl，逆转录产物5μl。20μl液体石蜡封顶，用PE480型PCR仪扩增，扩增反应参数为94℃3min预变性；94℃40s，55℃40s，72℃50s，三温循环25次；72℃7min末延伸。第二轮扩增反应体系与第一轮基本一样，只是用内引物F1和R1代替外引物，用第一轮扩增产物代替逆转录产物，扩增反应参数完全一致。
1.6 产物分析 将第二轮扩增产物10μl加于15g/L的琼脂糖凝胶上(含EB0.5μg/ml)，以30V/cm的电压电泳40min，紫外分析仪256nm下观察到504bp处有扩增带为阳性。
1.7 扩增产物的克隆及测序 从琼脂糖中回收第二轮PCR扩增产物，采用Promega公司的PCR产物纯化和克隆试剂盒，纯化后与T载体连接，转化入宿主菌JM107，从阳性菌中提取质粒DNA。利用荧光标记终止物循环测序试剂盒和ABI377自动测序仪测序。
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1.8 序列比较分析 测得序列利用DNASIS软件与GenBank中查到的GBV/CHGU36380，HGVHGU44402，HGV45966和中国株HGU75356等进行同源性比较和分析。
2 结果
300例义务献血员中庚型肝炎病毒RNA阳性1例，暂称HGVHENAN，阳性率为0.333%(1/300)见图1；200例初检合格献血员标本中未发现阳性。
图1 义务献血员中1例阳性标本RT-Nest-PCR结果
A：相对分子质量标准Marker(1543，994，695，515，377，237bp)；B：标准病毒扩增产物；C：标准阴性对照扩增产物；D：阳性义务献血员标本扩增产物
, 百拇医药
义务献血员中庚型肝炎病毒RNA阳性的扩增产物克隆测序，与GenBank中HGU36380对应位置序列的同源性为90.9%，HGU44402的为95.2%，HGU45966的为91.1%；与中国河北株HGU75356的同源性为98.8%(图2)。与已发表的HCV序列的同源性在40.2%～48.7%之间。
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图2 HGVHENA株与HGU75356株DNASIS软件比较分析结果
3 讨论
近2a有许多报道证实国内有庚型肝炎病毒感染的存在。国内有报道205例个体供血员中HGVRNA阳性率为8.3%(17/205)，义务献血员中的阳性率为7.6%(19/250)[3]；远远高于本研究的结果0.333%(1/300)。其原因可能为：①不同地域分布造成；②小样本抽样所致。本研究在200例初检合格献血员标本中未发现庚型肝炎病毒RNA阳性，而金银娣等[3]报道205例个体供血员中HGVRNA阳性率为8.3%，两者标本之间存在很大差异。本研究的对象是初检合格献血员标本，金银娣等[3]报道是未经筛选的标本，提示现行的献血员筛选制度能够在一定程度上阻止HGV感染的血液进入血库。但也有报道[3，4]HGV感染者中ALT不出现异常。因此，对献血员中存在HGV感染的情况，应引起有关部门警惕和重视，对目前使用的献血员筛选制度的可靠性进行探索和论证，以确定是否添加HGV的筛选。
, http://www.100md.com
河南株庚型肝炎病毒部分基因序列与已报道的序列均不完全一致，同源性是90.9%～98.8%，提示HGVNS5非常保守。利用NS5序列的保守性，在该区域内设计引物进行HGVRNA的检测，能提高检出率，减少漏检的发生。河南株HGVNS5基因序列与国内分离株的同源性高于国外分离株，其原因可能是HGV亚型的地理分布所致。河南株与GenBank中亚洲株HGV的同源性也高于欧美分离株，这也提示HGV流行和进化存在地域特征。
*河南省科技攻关项目 981170404
参考文献
[1] Simons JN,Pilot-Matias TJ,Leary TP，et al. Identification of two flavivirus-like genomes in the GB hepatitis agent. Proc Natl Acad Sci，1995,92(8):3401
[2] 周育森，陈薇，赵秋敏，等.中国株庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定.军事医学科学院刊，1996,20(4):249
[3] 金银娣，陆志檬，张东华，等.聚合酶链反应和杂交试验检测上海地区庚型肝炎病毒感染的初步报告.中华传染病杂志，1997,15(3):142
[4] 徐俊杰，周育森，徐家障，等.中国南京庚型肝炎病毒部分基因克隆及cDNA序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1997,11(1):27
(1998-10-26收稿), 百拇医药
单位：赵国强 苏堤 胡志荣(河南医科大学微生物学与免疫学教研 郑州 450052)；邢培清 刘利民 马宏伟 王凯(河南省红十字血液中心 郑州 450003)
关键词：献血员；庚型肝炎病毒；聚合酶链反应；序列分析
河南医科大学学报990214 摘要 目的：为探讨河南省献血员中庚型肝炎病毒(HGV)的感染情况和病毒基因的变异特征。方法：利用逆转录-巢式-聚合酶链反应(RT-Nest-PCR)检测HGVRNA；克隆入T载体并测序。结果：在300名义务献血员中发现1例庚型肝炎病毒RNA阳性；200例初检合格献血员标本中无1例阳性。河南株HGV与GenBank中HGV对应位置序列的同源性为90.9%～98.8%。结论：河南省义务献血员中有HGV携带者；河南株HGV与国内(河北株HGU75356)分离株的同源性为98.8%，其同源性高于国外分离株(90.9%～95.2%)；建议对献血员增加HGV检测。
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中图分类号 R512.63
Detection of hepatitis G virus infection in donors and sequencing of partial gene
Zhao Guoqiang1) , Xing Peiqing2) , Su Di1) , Hu Zhirong1) , Liu Limin2) , Ma Hongwei2) ,Wang kai2)
1)Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University,Zhengz hou 450052 2)The Red Cross Blood Center of Henan， Zhengzhou 450003
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Abstract Aim：In order to study hepatitis G virus (HGV) infection in volunt ary donors of Henan province and characteristics of gene mutation. Methods：HGV RNA was detected by reverse transcription nest polymerase chain reaction (RT-Nest-PCR). Partial gene was cloned and sequenced.Results：One posi tive case of HGV RNA was detected in 300 voluntary donors and HGV RNA in 200 initial screened donor were all negative.The sequence showed 90.9%～98.8% nucleotide homology to the corresponding region of HGV in Genbank.The nucleotide homology between Henan st rain HGV and Hebei is higher than that between Henan and foreign country strains.Conclusion：The existence of HGV infection in Henan has been a ffirmed and it is suggesting that screening for blood donors is of importance to transfusion secu rity.
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Key words Donor, Hepatitis G virus, PCR, Sequencing
近年来的研究表明除了HAV、HBV、HCV、HDV、HEV外，仍存在有未知的肝炎病毒。Simons等[1]于1995年在非甲～戊型肝炎患者血浆中发现了一种新的人类肝炎相关的病毒，暂称之为HGV/GBV-C,国内称之为庚型肝炎病毒。为了研究河南省庚型肝炎病毒的感染情况及河南株基因的变异特点，作者利用RT-Nest-PCR方法对300名义务献血员、200例初检合格献血员标本进行了检测和部分基因的克隆及cDNA序列分析。
1 材料与方法
1.1 标本及来源 河南省红十字血液中心200例初检合格献血员标本。300名义务献血员为郑州市高校在校生。以上标本用常规方法分离血清，-20℃保存。
1.2 标准病毒和引物 标准病毒由美国NIH提供。引物参照GenBank中国株HGU75356[2]以及国外株HGU44402、HGU45966和HGU36380设计出一组巢式引物，扩增区为相对保守的非结构基因NS5，第二轮扩增靶片段长度为504bp。引物见表1。
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表1 HGV巢式引物 引物
序列
位置
内引物F1
5'GAAGACTCAGAACTGACTGA3'
6689～6708
内引物R1
5'ATAGGCTGTATGGTTCTGGA3'
7192～7173
外引物F2
5'GAGATTGGGACGGAGACTG3'
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6671～6689
外引物R2
5'CACCAAGCACCCAACTTGC3'
7240～7222
1.3 标本处理 取血清200μl加200μl裂解液(8mol/L异硫氰酸胍、42mmol/L柠檬酸钠、8.3g/L的十二烷基肌氨酸、0.2mmol/Lβ-巯基乙醇)，充分混匀，室温放置10min，然后加入2 mol/L醋酸钠40μl、V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)为(25∶24∶1)的液体400μl，混合后冰浴10min，12000r/min离心20min，取上层水相至另一管中，加等体积预冷异丙醇，-20℃过夜。12000r/min离心20min，去上清，体积分数为75%乙醇洗一次，真空干燥，用10μlDEPC水溶解，-20℃备用。
1.4 逆转录 10×RT缓冲液(含50mmol/LMgCl2)2μl，10mmol/L4×dNTP2μl，RNasin40U，AMV10U，外引物R21μl，最后加入变性处理(94℃水浴，5min后立刻放入冰浴)过的提取标本14μl，用2滴液体石蜡封顶，42℃水浴逆转录45min。
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1.5 PCR扩增 第一轮扩增反应体积为30μl,10×缓冲液3μl，10mmol/L4×dNTP2μl，外引物F2和R2各1μl，Taq酶2U，DEPCH2O17μl，逆转录产物5μl。20μl液体石蜡封顶，用PE480型PCR仪扩增，扩增反应参数为94℃3min预变性；94℃40s，55℃40s，72℃50s，三温循环25次；72℃7min末延伸。第二轮扩增反应体系与第一轮基本一样，只是用内引物F1和R1代替外引物，用第一轮扩增产物代替逆转录产物，扩增反应参数完全一致。
1.6 产物分析 将第二轮扩增产物10μl加于15g/L的琼脂糖凝胶上(含EB0.5μg/ml)，以30V/cm的电压电泳40min，紫外分析仪256nm下观察到504bp处有扩增带为阳性。
1.7 扩增产物的克隆及测序 从琼脂糖中回收第二轮PCR扩增产物，采用Promega公司的PCR产物纯化和克隆试剂盒，纯化后与T载体连接，转化入宿主菌JM107，从阳性菌中提取质粒DNA。利用荧光标记终止物循环测序试剂盒和ABI377自动测序仪测序。
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1.8 序列比较分析 测得序列利用DNASIS软件与GenBank中查到的GBV/CHGU36380，HGVHGU44402，HGV45966和中国株HGU75356等进行同源性比较和分析。
2 结果
300例义务献血员中庚型肝炎病毒RNA阳性1例，暂称HGVHENAN，阳性率为0.333%(1/300)见图1；200例初检合格献血员标本中未发现阳性。
图1 义务献血员中1例阳性标本RT-Nest-PCR结果
A：相对分子质量标准Marker(1543，994，695，515，377，237bp)；B：标准病毒扩增产物；C：标准阴性对照扩增产物；D：阳性义务献血员标本扩增产物
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义务献血员中庚型肝炎病毒RNA阳性的扩增产物克隆测序，与GenBank中HGU36380对应位置序列的同源性为90.9%，HGU44402的为95.2%，HGU45966的为91.1%；与中国河北株HGU75356的同源性为98.8%(图2)。与已发表的HCV序列的同源性在40.2%～48.7%之间。
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图2 HGVHENA株与HGU75356株DNASIS软件比较分析结果
3 讨论
近2a有许多报道证实国内有庚型肝炎病毒感染的存在。国内有报道205例个体供血员中HGVRNA阳性率为8.3%(17/205)，义务献血员中的阳性率为7.6%(19/250)[3]；远远高于本研究的结果0.333%(1/300)。其原因可能为：①不同地域分布造成；②小样本抽样所致。本研究在200例初检合格献血员标本中未发现庚型肝炎病毒RNA阳性，而金银娣等[3]报道205例个体供血员中HGVRNA阳性率为8.3%，两者标本之间存在很大差异。本研究的对象是初检合格献血员标本，金银娣等[3]报道是未经筛选的标本，提示现行的献血员筛选制度能够在一定程度上阻止HGV感染的血液进入血库。但也有报道[3，4]HGV感染者中ALT不出现异常。因此，对献血员中存在HGV感染的情况，应引起有关部门警惕和重视，对目前使用的献血员筛选制度的可靠性进行探索和论证，以确定是否添加HGV的筛选。
, http://www.100md.com
河南株庚型肝炎病毒部分基因序列与已报道的序列均不完全一致，同源性是90.9%～98.8%，提示HGVNS5非常保守。利用NS5序列的保守性，在该区域内设计引物进行HGVRNA的检测，能提高检出率，减少漏检的发生。河南株HGVNS5基因序列与国内分离株的同源性高于国外分离株，其原因可能是HGV亚型的地理分布所致。河南株与GenBank中亚洲株HGV的同源性也高于欧美分离株，这也提示HGV流行和进化存在地域特征。
*河南省科技攻关项目 981170404
参考文献
[1] Simons JN,Pilot-Matias TJ,Leary TP，et al. Identification of two flavivirus-like genomes in the GB hepatitis agent. Proc Natl Acad Sci，1995,92(8):3401
[2] 周育森，陈薇，赵秋敏，等.中国株庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定.军事医学科学院刊，1996,20(4):249
[3] 金银娣，陆志檬，张东华，等.聚合酶链反应和杂交试验检测上海地区庚型肝炎病毒感染的初步报告.中华传染病杂志，1997,15(3):142
[4] 徐俊杰，周育森，徐家障，等.中国南京庚型肝炎病毒部分基因克隆及cDNA序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1997,11(1):27
(1998-10-26收稿), 百拇医药