巯基蛋白酶抑制剂对胃癌体外侵袭转移的影响
作者：陈向荣 任伟平 韩清锡 萧树东
单位：陈向荣 韩清锡(温州医学院附属第一医院 消化科，浙江 温州 325000)；任伟平 萧树东(上海第二医科大学附属仁济医院，上海消化疾病研究所，上海 200001)
关键词：巯基蛋白酶；胃癌；侵袭；转移
温州医学院学报000302 [摘要]目的:观察不同巯基蛋白酶抑制剂对不同恶性度胃癌细胞株体外侵袭转移力的影响。方法:用体外粘附法和Boyden小室模型法观察外源性巯基蛋白酶抑制剂E-64和内源性抑制剂胱蛋白A(Cystatin A)对高分化胃腺癌MKN28细胞株和低分化胃腺癌MKN45细胞株细胞体外的侵袭转移能力。结果:E-64和Cystatin A抑制二胃癌细胞株体外的细胞粘附力和细胞对基质胶(matrigel)的侵袭力，对MKN28细胞的作用较MKN45细胞明显。结论:巯基蛋白酶Cathepsin B参与胃癌的侵袭转移过程，巯基蛋白酶抑制剂有潜在治疗意义。
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[中图分类号]R730.54 [文献标识码]A
[文章编号]1000-2138(2000)03-0182-03
Inhibition of gartric carcinoma cell invasion and metastasis in vitro by cysteine proteinase inhibitors
CHEN Xiang-rong REN Wei-ping HAN Qing-xi et al
(Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000)
Abstract：Objective：To observe the effect of cysteine proteinase inhibitors(E-64 and cystatinA) on human gastric carcinoma cell lines(MKN 45 and MKN28) in terms of invasion and metastasis.Methods：To examine the cancer cell ability to interact with extracellular matrix components(laminin and fibronectin),and the ability to invasion to matrigel and motility in Boyden chamber.Results：E-64 and Cystatin A inhibit adherence of gastric cancer cells on laminin or fibronectin, also inhibit invasion of gastric cancer cells to metrigel, no effect on motility of cancer cells.Conclusion：Cysteine proteinase and cysteine proteinase inhibitor play an important role in the invasion and metastasis of gastric cancer cells.
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Key words：cysteine proteinase;gastric cancer; invasion; metastasis
胃癌的死因常与侵袭转移有关。蛋白水解酶在肿瘤侵袭转移中的作用现日益被关注[1]，但是，巯基蛋白酶(cysteine proteinase)与肿瘤侵袭转移的关系尚未深入了解。研究发现，在许多肿瘤中有巯基蛋白酶的主要成分Cathepsin B(简称CB)的表达异常，包括活性表达增高，细胞膜异常定位，mRNA 的剪切改变，内源性酶抑制剂表达的下降和酶/抑制剂平衡的改变[2]。尽管如此，这些改变与肿瘤侵袭转移有否直接联系仍不清，尤其是在胃癌中巯基蛋白酶和抑制剂的表达异常是否参与侵袭转移过程尚少见报道。我们用外源性巯基蛋白酶抑制剂和自行提取的内源性抑制剂,对不同胃癌细胞株体外侵袭转移等能力的干扰实验，探讨巯基蛋白酶抑制剂在胃癌侵袭转移中的作用。
1 材料和方法
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1.1 细胞株和酶抑制剂 MKN28胃高分化腺癌和MKN45胃低分化腺癌细胞株为上海消化病研究所保存，于5%CO2、37℃饱和湿度条件下常规培养于10%FCS-RPMI 1640培养液(GIBCO，USA)，2～3天换液，1周传代。供干预试验用细胞生长于25cm3培养瓶，达80%密度至对数生长期时，用
0.1%EDTA-PBS消化，0.5%BSA-RPMI 1640制成细胞悬液，计数并经苔盼兰拒染测活力大于95%，用于下一步实验。E-64，Sigma产品，系小分子特异性不可逆巯基蛋白酶抑制剂，从贴梗山海棠曲霉菌(Aspergilles Japonics)中提取，用二甲基亚砜(DMSO)溶解保存于-40℃备用，使用时于0.5%BSA-RPMI 1640释稀至所需浓度，DMSO在培养液中浓度小于0.1%，该浓度在预实验时证实对细胞无毒性和抑制剂增殖之作用。Cystatin A系内源性CB抑制剂，从人胃正常粘膜组织中提取，提取方法和鉴定另文发表，使用时用0.5% BSA-RPMI 1640稀释。
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1.2 体外侵袭转移能力的测定
1.2.1 条件培养液制备：选择出生时间少于1周的BALB/C小鼠(雌雄不限,上海第二医科大学动物房提供),脱颈处死后皮肤表面用75%酒精处理5分钟后，剥离皮肤并将其剪成1mm大小的组织块，于无血清RPMI 1640中泡一分钟, 按真皮面朝下将组织块放置于培养皿上，37℃、5%CO2静置1小时后再加入10%FCS-RPMI 1640培养液，37℃，5%CO2培养,数天后见小鼠成纤维细胞在组织块周围生长,无菌清除组织块后,成纤维细胞用胰酶消化传代达80%密度时换无血清RPMI 1640(50cm3瓶加10ml培养液)，37℃、5%CO2培养24小时，收集培养液。0.2μm滤膜过滤小管分装,-40℃保存备用。
1.2.2 细胞粘附力测定：按Daneker[3]方法并作改进测细胞粘附力的变化。板层素(laminin，LN)和纤维联接素(fibronectin，FN)(Sigma公司产品，USA)以20μg/ml浓度溶于PBS(pH7.2，20mmol/L)，以每孔2μg蛋白加入96孔细胞培养板(Corning公司产品，USA)，4℃，48小时包板，用前PBS洗二次，加RPMI 1640，37℃温育30分钟。胃癌细胞用EDTA消化，计数及测活力后，加E-64或Cystatin A(于RPMI 1640液中，浓度见表1)，37℃、5%CO2培养30分钟；而后以每孔3×104细胞数加入已包蛋白之孔板。37℃、5%CO2，饱和湿度培养75分钟。终止培养后未粘附细胞用温PBS轻洗二次洗去，粘附细胞用酸性磷酸酶法测定。在孔板上包BSA以测细胞的非特异性粘附力，对照组为不经E-64或Cystatin A处理的胃癌细胞。每组设三孔，计算平均值。
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1.2.3 细胞移动试验：按文献[4]所述方法进行。胃癌细胞于含10%FCS-RPMI 1640培养瓶内生长至80%密度时，弃液，经0.1%EDTA消化(PBS洗二次)，RPMI 1640培养液(含0.1%BSA)制单细胞悬液，经苔盼兰拒染测细胞活力大于95%后调整细胞浓度为2.5×105/ml。在每一Boyden小室(Millicell-PCF,直径12μm,Millipore,USA)上室中加悬液0.4ml，加细胞悬液前在下室加条件培养液0.6ml，且上下室均加酶抑制剂至所需浓度(见表2)。5%CO2,饱和湿度,37℃培养12小时后,倒置显微镜下计已穿透小室滤膜的细胞数(计标准显微镜计数格内细胞数，每格1mm×1mm，每孔随机计5格)，对照组不加E-64或Cystatin A。每一组设三室，计算平均值。
1.2.4 体外侵袭实验：方法与移动试验类似。但在加细胞悬液之前，在Boyden小室的滤膜上，4℃环境中加基质胶matrigel 30μl(Serva，USA)，并均匀铺满滤膜，37℃置30分钟，再置入条件培养液5分钟。细胞悬液加样量与移动试剂相同。培养72小时后于倒置显微镜下计数穿透滤膜的细胞数，每一组设三室,计算平均值。
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1.2.5 统计学处理：实验重复二次。各项指标进行Student't检验。
2 结果
2.1 酶抑制剂对胃癌细胞的增殖和活力之影响 在预试验时曾用酸性磷酸酶法观察试验所用的巯基蛋白酶抑制剂在实验浓度时，细胞培养1周，每天计数。它们对细胞的增殖无明显影响；同时，用苔盼兰拒染表明这种条件下该二酶抑制剂对细胞活力无影响(活力大于95%)。
2.2 酶抑制剂对胃癌细胞体外粘附力之影响 胃癌细胞在BSA上的细胞粘附率少于在LN和FN上的1%，提示二株细胞对LN和FN是特异的粘附。E-64不影响MKN45细胞在LN和FN上的粘附，但明显抑制MKN28细胞在LN和FN上的粘附，而且对FN粘附的影响较对LN粘附的影响大。Cystatin A均抑制二株胃癌细胞对LN和FN上的粘附(见表1)。
2.3 酶抑制剂对胃癌细胞体外移动性的影响 在所用工作浓度的酶抑制剂对两胃癌细胞株的体外移动能力无明显影响(见表2)。
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2.4 酶抑制剂对胃癌细胞体外侵袭力的影响 如
表1 酶抑制剂对胃癌细胞体外粘附力之影响 (
±s)
n
MKN45
MKN28
LN
FN
LN
FN
对照组
6
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0.71±0.12
0.54±0.08
0.43±0.09
0.39±0.10
E-64(100μm)
6
0.69±0.03
0.58±0.10
0.27±0.12**
0.10±0.07**
Cystatin A(50μg/ml)
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6
0.58±0.13*
0.42±0.05*
0.33±0.05*
0.32±0.04*
数值为OD值，与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01表2 胃癌细胞体外移动性和体外侵袭力实验结果 (单位：细胞数/米2，±s)
n
体外移动性改变
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体外侵袭力改变
MKN 45
MKN 28
MKN 45
MKN 28
对照组
15
11.2±2.8
17.4±3.1
25.7±2.8
17.4±3.1
E-64(100μm)
, 百拇医药
15
12.9±1.3
9.5±2.4
18.2±1.4*
10.2±2.9**
Cystatin A(50μg/ml)
15
9.8±1.5
9.9±0.9
19.3±3.7*
8.4±2.8**
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与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01表2所示，E-64和Cystatin A均抑制两细胞株体外对matrigel的侵袭，数据差异有显著性，而且对MKN28细胞的抑制作用较对MKN45细胞的抑制作用大。3 讨论
肿瘤的侵袭转移能力是其恶性行为的重要表现之一，是致死的主要原因，在胃癌也是一样。以Liotta所提出的理论，肿瘤侵袭转移存在肿瘤细胞与细胞外基质(extracellular matrix，简称ECM)和基膜成分的粘附，细胞对ECM和基膜的降解、以及细胞的移行这三个基础过程。肿瘤细胞和(或)周围细胞表达异常的生物大分子影响或参与这些过程。目前认为Boyden小室是最佳的体外侵袭转移模型，matrigel是较好的人工基膜材料[4]。为了较好地观察胃癌细胞体外的侵袭转移能力，我们用细胞对LN、FN的粘附，细胞在Boyden小室中的移行以及对matrigel的侵袭这一分室培养模型来模拟细胞的粘附、移行和侵袭过程。
LN和FN是ECM和基膜的主要成分和细胞粘附蛋白，其分子片段参与或影响肿瘤细胞的侵袭转移能力[5]。George[3]发现肿瘤细胞对他们的粘附力与恶性度和侵袭能力相关。细胞粘附是肿瘤转移过程的第一步，亦可能是始动因子，细胞粘附可促使恶性细胞基质蛋白水解酶表达增高，粘附蛋白的酶解片段亦促进恶性细胞的移行。因此，蛋白酶和其内源性抑制剂，不仅参与侵袭转移的基质降解，也可能参与粘附和移行过程。本实验发现，E-64和Cystatin A抑制两胃癌细胞的体外粘附力，尤其对低恶性度的MKN28细胞影响明显。Keil[6]等比较了LN、FN与Cystatin A的分子结构，发现它们之间氨基酸顺序有高度同源性，尤其是与细胞结合之分子片段。E-64和Cystatin A对胃癌细胞粘附力的抑制可能与此有关。而且Cystatin A是内源性抑制剂，作用较明显，对MKN28和MKN45细胞均有作用也证实这一点。其次，在肿瘤细胞有CB和内源性抑制剂的表达异常，尤其是细胞膜部分的异常，可能部分改变了细胞对LN、FN的识别和结合能力。低恶性度的MKN28细胞粘附力较易受抑制可能与其侵袭转移弱，较易干扰有关。Boike[7]等用巯基蛋白酶抑制剂在体外抑制B16恶性黑色瘤和W256癌肉瘤细胞的粘附能力与本研究结果相符。
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CB能降解LN、FN这些ECM和基膜成分和某些胶原分子，巯基蛋白酶参与肿瘤的侵袭转移过程可能主要与此作用有关。而且，它亦能激活基质金属蛋白酶MMP、尿激酶型纤溶酶原激活物uPA等参与肿瘤侵袭转移的主要蛋白水解酶[2]。以往的研究发现，在胃癌有CB的表达异常且与恶性度相关[8]，提示 CB可能参与胃癌的侵袭转移过程。最近，Navab[9]等发现E-64抑制结肠癌细胞的体内外侵袭转移能力，他们的体外侵袭试验也用Boyden小室模型，认为CB参与结肠癌侵袭转移过程。本实验观察到E-64和Cystatin A均抑制两胃癌细胞株体外对matrigel的侵袭能力：①E-64和Cystatin A抑制CB对LN、FN等matrigel主要成分的降解，从而证明CB参与胃癌侵袭转移的作用。②E-64和Cystatin A抑制了细胞的粘附力而影响了后继的降解过程。③通过干扰CB 对MMP等的激活而间接抑制降解过程。本实验未发现E-64、Cystatin A等巯基蛋白酶抑制剂对胃癌细胞体外的移行能力有影响。
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本实验结果提示，巯基蛋白酶抑制剂E-64和Cystatin A抑制胃癌细胞株体外的细胞粘附和细胞对基质的降解过程，表明CB参与胃癌的侵袭转移，巯基蛋白酶抑制剂有潜在的治疗、控制胃癌转移之作用。
作者简介：陈向荣(1965-)，男，浙江乐清人，医学博士，主治医师，主要从事消化内科临床和肿瘤侵袭转移的基础与应用研究。
参考文献
[1] Huang Y,Ti TK,Moochhala SM. Expression of matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-7)mRNA in human gastric cancer[J]. Med Sci Res,1997,25:405-407.
[2] Yan S, Sameni M, Sloane BF. Cathepsin B and human tumor progression[J].Bio Chem,1998,379(2):113-123.
, 百拇医药
[3] Daneker GW, Piazza A, Steele G,et al. Relationship between extracellular matrix interactions and degree of differentiation in human colon carcinoma cell lines[J].Cancer Res,1989,49:681-686.
[4] Albini A, Iwamoto Y, Kleinman HK, et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells[J]. Cancer Res,1987,47:3239-3245.
[5] Kuratomi Y, Nomiza M, Nielsen PK,et al. Identification of metastasis-promoting sequsences in the mouse laminin alpha I chain[J]. Exp Cell Res,1999,249(2):386-395.
, http://www.100md.com
[6] Keil D, Dlouha V, Turk V,et al. Structural analogies between adhesive proteins and cysteine proteinase inhibitors[J]. Biol Chem Hoppe-Seyler,1989,369:199-204.
[7] Boike G, Lab TT, Sloane BF, et al. Apossible role for cysteine proteinase and its inhibitors in motility of malignant melanoma and other cells[J]. Melanoma Res,1992，1:333-340.
[8] 沈洁，陈向荣.胃癌细胞巯基蛋白酶表达异常及意义[J].华人消化病杂志，1999，7(2)：147-149.
[9] Navab R, Mort JS, Brodt P. Inhibition of carcinoma cell invasion and liver metastases formation by cysteine proteinase inhibitor E-64[J]. Clin Exp Metastasic,1997,15(2):121-129.
收稿日期：2000-01-03
修回日期：2000-03-13, 百拇医药
单位：陈向荣 韩清锡(温州医学院附属第一医院 消化科，浙江 温州 325000)；任伟平 萧树东(上海第二医科大学附属仁济医院，上海消化疾病研究所，上海 200001)
关键词：巯基蛋白酶；胃癌；侵袭；转移
温州医学院学报000302 [摘要]目的:观察不同巯基蛋白酶抑制剂对不同恶性度胃癌细胞株体外侵袭转移力的影响。方法:用体外粘附法和Boyden小室模型法观察外源性巯基蛋白酶抑制剂E-64和内源性抑制剂胱蛋白A(Cystatin A)对高分化胃腺癌MKN28细胞株和低分化胃腺癌MKN45细胞株细胞体外的侵袭转移能力。结果:E-64和Cystatin A抑制二胃癌细胞株体外的细胞粘附力和细胞对基质胶(matrigel)的侵袭力，对MKN28细胞的作用较MKN45细胞明显。结论:巯基蛋白酶Cathepsin B参与胃癌的侵袭转移过程，巯基蛋白酶抑制剂有潜在治疗意义。
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[中图分类号]R730.54 [文献标识码]A
[文章编号]1000-2138(2000)03-0182-03
Inhibition of gartric carcinoma cell invasion and metastasis in vitro by cysteine proteinase inhibitors
CHEN Xiang-rong REN Wei-ping HAN Qing-xi et al
(Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000)
Abstract：Objective：To observe the effect of cysteine proteinase inhibitors(E-64 and cystatinA) on human gastric carcinoma cell lines(MKN 45 and MKN28) in terms of invasion and metastasis.Methods：To examine the cancer cell ability to interact with extracellular matrix components(laminin and fibronectin),and the ability to invasion to matrigel and motility in Boyden chamber.Results：E-64 and Cystatin A inhibit adherence of gastric cancer cells on laminin or fibronectin, also inhibit invasion of gastric cancer cells to metrigel, no effect on motility of cancer cells.Conclusion：Cysteine proteinase and cysteine proteinase inhibitor play an important role in the invasion and metastasis of gastric cancer cells.
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Key words：cysteine proteinase;gastric cancer; invasion; metastasis
胃癌的死因常与侵袭转移有关。蛋白水解酶在肿瘤侵袭转移中的作用现日益被关注[1]，但是，巯基蛋白酶(cysteine proteinase)与肿瘤侵袭转移的关系尚未深入了解。研究发现，在许多肿瘤中有巯基蛋白酶的主要成分Cathepsin B(简称CB)的表达异常，包括活性表达增高，细胞膜异常定位，mRNA 的剪切改变，内源性酶抑制剂表达的下降和酶/抑制剂平衡的改变[2]。尽管如此，这些改变与肿瘤侵袭转移有否直接联系仍不清，尤其是在胃癌中巯基蛋白酶和抑制剂的表达异常是否参与侵袭转移过程尚少见报道。我们用外源性巯基蛋白酶抑制剂和自行提取的内源性抑制剂,对不同胃癌细胞株体外侵袭转移等能力的干扰实验，探讨巯基蛋白酶抑制剂在胃癌侵袭转移中的作用。
1 材料和方法
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1.1 细胞株和酶抑制剂 MKN28胃高分化腺癌和MKN45胃低分化腺癌细胞株为上海消化病研究所保存，于5%CO2、37℃饱和湿度条件下常规培养于10%FCS-RPMI 1640培养液(GIBCO，USA)，2～3天换液，1周传代。供干预试验用细胞生长于25cm3培养瓶，达80%密度至对数生长期时，用
0.1%EDTA-PBS消化，0.5%BSA-RPMI 1640制成细胞悬液，计数并经苔盼兰拒染测活力大于95%，用于下一步实验。E-64，Sigma产品，系小分子特异性不可逆巯基蛋白酶抑制剂，从贴梗山海棠曲霉菌(Aspergilles Japonics)中提取，用二甲基亚砜(DMSO)溶解保存于-40℃备用，使用时于0.5%BSA-RPMI 1640释稀至所需浓度，DMSO在培养液中浓度小于0.1%，该浓度在预实验时证实对细胞无毒性和抑制剂增殖之作用。Cystatin A系内源性CB抑制剂，从人胃正常粘膜组织中提取，提取方法和鉴定另文发表，使用时用0.5% BSA-RPMI 1640稀释。
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1.2 体外侵袭转移能力的测定
1.2.1 条件培养液制备：选择出生时间少于1周的BALB/C小鼠(雌雄不限,上海第二医科大学动物房提供),脱颈处死后皮肤表面用75%酒精处理5分钟后，剥离皮肤并将其剪成1mm大小的组织块，于无血清RPMI 1640中泡一分钟, 按真皮面朝下将组织块放置于培养皿上，37℃、5%CO2静置1小时后再加入10%FCS-RPMI 1640培养液，37℃，5%CO2培养,数天后见小鼠成纤维细胞在组织块周围生长,无菌清除组织块后,成纤维细胞用胰酶消化传代达80%密度时换无血清RPMI 1640(50cm3瓶加10ml培养液)，37℃、5%CO2培养24小时，收集培养液。0.2μm滤膜过滤小管分装,-40℃保存备用。
1.2.2 细胞粘附力测定：按Daneker[3]方法并作改进测细胞粘附力的变化。板层素(laminin，LN)和纤维联接素(fibronectin，FN)(Sigma公司产品，USA)以20μg/ml浓度溶于PBS(pH7.2，20mmol/L)，以每孔2μg蛋白加入96孔细胞培养板(Corning公司产品，USA)，4℃，48小时包板，用前PBS洗二次，加RPMI 1640，37℃温育30分钟。胃癌细胞用EDTA消化，计数及测活力后，加E-64或Cystatin A(于RPMI 1640液中，浓度见表1)，37℃、5%CO2培养30分钟；而后以每孔3×104细胞数加入已包蛋白之孔板。37℃、5%CO2，饱和湿度培养75分钟。终止培养后未粘附细胞用温PBS轻洗二次洗去，粘附细胞用酸性磷酸酶法测定。在孔板上包BSA以测细胞的非特异性粘附力，对照组为不经E-64或Cystatin A处理的胃癌细胞。每组设三孔，计算平均值。
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1.2.3 细胞移动试验：按文献[4]所述方法进行。胃癌细胞于含10%FCS-RPMI 1640培养瓶内生长至80%密度时，弃液，经0.1%EDTA消化(PBS洗二次)，RPMI 1640培养液(含0.1%BSA)制单细胞悬液，经苔盼兰拒染测细胞活力大于95%后调整细胞浓度为2.5×105/ml。在每一Boyden小室(Millicell-PCF,直径12μm,Millipore,USA)上室中加悬液0.4ml，加细胞悬液前在下室加条件培养液0.6ml，且上下室均加酶抑制剂至所需浓度(见表2)。5%CO2,饱和湿度,37℃培养12小时后,倒置显微镜下计已穿透小室滤膜的细胞数(计标准显微镜计数格内细胞数，每格1mm×1mm，每孔随机计5格)，对照组不加E-64或Cystatin A。每一组设三室，计算平均值。
1.2.4 体外侵袭实验：方法与移动试验类似。但在加细胞悬液之前，在Boyden小室的滤膜上，4℃环境中加基质胶matrigel 30μl(Serva，USA)，并均匀铺满滤膜，37℃置30分钟，再置入条件培养液5分钟。细胞悬液加样量与移动试剂相同。培养72小时后于倒置显微镜下计数穿透滤膜的细胞数，每一组设三室,计算平均值。
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1.2.5 统计学处理：实验重复二次。各项指标进行Student't检验。
2 结果
2.1 酶抑制剂对胃癌细胞的增殖和活力之影响 在预试验时曾用酸性磷酸酶法观察试验所用的巯基蛋白酶抑制剂在实验浓度时，细胞培养1周，每天计数。它们对细胞的增殖无明显影响；同时，用苔盼兰拒染表明这种条件下该二酶抑制剂对细胞活力无影响(活力大于95%)。
2.2 酶抑制剂对胃癌细胞体外粘附力之影响 胃癌细胞在BSA上的细胞粘附率少于在LN和FN上的1%，提示二株细胞对LN和FN是特异的粘附。E-64不影响MKN45细胞在LN和FN上的粘附，但明显抑制MKN28细胞在LN和FN上的粘附，而且对FN粘附的影响较对LN粘附的影响大。Cystatin A均抑制二株胃癌细胞对LN和FN上的粘附(见表1)。
2.3 酶抑制剂对胃癌细胞体外移动性的影响 在所用工作浓度的酶抑制剂对两胃癌细胞株的体外移动能力无明显影响(见表2)。
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2.4 酶抑制剂对胃癌细胞体外侵袭力的影响 如
表1 酶抑制剂对胃癌细胞体外粘附力之影响 (
±s)n
MKN45
MKN28
LN
FN
LN
FN
对照组
6
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0.71±0.12
0.54±0.08
0.43±0.09
0.39±0.10
E-64(100μm)
6
0.69±0.03
0.58±0.10
0.27±0.12**
0.10±0.07**
Cystatin A(50μg/ml)
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0.58±0.13*
0.42±0.05*
0.33±0.05*
0.32±0.04*
数值为OD值，与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01表2 胃癌细胞体外移动性和体外侵袭力实验结果 (单位：细胞数/米2，
±s)n
体外移动性改变
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体外侵袭力改变
MKN 45
MKN 28
MKN 45
MKN 28
对照组
15
11.2±2.8
17.4±3.1
25.7±2.8
17.4±3.1
E-64(100μm)
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12.9±1.3
9.5±2.4
18.2±1.4*
10.2±2.9**
Cystatin A(50μg/ml)
15
9.8±1.5
9.9±0.9
19.3±3.7*
8.4±2.8**
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与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01表2所示，E-64和Cystatin A均抑制两细胞株体外对matrigel的侵袭，数据差异有显著性，而且对MKN28细胞的抑制作用较对MKN45细胞的抑制作用大。3 讨论
肿瘤的侵袭转移能力是其恶性行为的重要表现之一，是致死的主要原因，在胃癌也是一样。以Liotta所提出的理论，肿瘤侵袭转移存在肿瘤细胞与细胞外基质(extracellular matrix，简称ECM)和基膜成分的粘附，细胞对ECM和基膜的降解、以及细胞的移行这三个基础过程。肿瘤细胞和(或)周围细胞表达异常的生物大分子影响或参与这些过程。目前认为Boyden小室是最佳的体外侵袭转移模型，matrigel是较好的人工基膜材料[4]。为了较好地观察胃癌细胞体外的侵袭转移能力，我们用细胞对LN、FN的粘附，细胞在Boyden小室中的移行以及对matrigel的侵袭这一分室培养模型来模拟细胞的粘附、移行和侵袭过程。
LN和FN是ECM和基膜的主要成分和细胞粘附蛋白，其分子片段参与或影响肿瘤细胞的侵袭转移能力[5]。George[3]发现肿瘤细胞对他们的粘附力与恶性度和侵袭能力相关。细胞粘附是肿瘤转移过程的第一步，亦可能是始动因子，细胞粘附可促使恶性细胞基质蛋白水解酶表达增高，粘附蛋白的酶解片段亦促进恶性细胞的移行。因此，蛋白酶和其内源性抑制剂，不仅参与侵袭转移的基质降解，也可能参与粘附和移行过程。本实验发现，E-64和Cystatin A抑制两胃癌细胞的体外粘附力，尤其对低恶性度的MKN28细胞影响明显。Keil[6]等比较了LN、FN与Cystatin A的分子结构，发现它们之间氨基酸顺序有高度同源性，尤其是与细胞结合之分子片段。E-64和Cystatin A对胃癌细胞粘附力的抑制可能与此有关。而且Cystatin A是内源性抑制剂，作用较明显，对MKN28和MKN45细胞均有作用也证实这一点。其次，在肿瘤细胞有CB和内源性抑制剂的表达异常，尤其是细胞膜部分的异常，可能部分改变了细胞对LN、FN的识别和结合能力。低恶性度的MKN28细胞粘附力较易受抑制可能与其侵袭转移弱，较易干扰有关。Boike[7]等用巯基蛋白酶抑制剂在体外抑制B16恶性黑色瘤和W256癌肉瘤细胞的粘附能力与本研究结果相符。
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CB能降解LN、FN这些ECM和基膜成分和某些胶原分子，巯基蛋白酶参与肿瘤的侵袭转移过程可能主要与此作用有关。而且，它亦能激活基质金属蛋白酶MMP、尿激酶型纤溶酶原激活物uPA等参与肿瘤侵袭转移的主要蛋白水解酶[2]。以往的研究发现，在胃癌有CB的表达异常且与恶性度相关[8]，提示 CB可能参与胃癌的侵袭转移过程。最近，Navab[9]等发现E-64抑制结肠癌细胞的体内外侵袭转移能力，他们的体外侵袭试验也用Boyden小室模型，认为CB参与结肠癌侵袭转移过程。本实验观察到E-64和Cystatin A均抑制两胃癌细胞株体外对matrigel的侵袭能力：①E-64和Cystatin A抑制CB对LN、FN等matrigel主要成分的降解，从而证明CB参与胃癌侵袭转移的作用。②E-64和Cystatin A抑制了细胞的粘附力而影响了后继的降解过程。③通过干扰CB 对MMP等的激活而间接抑制降解过程。本实验未发现E-64、Cystatin A等巯基蛋白酶抑制剂对胃癌细胞体外的移行能力有影响。
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本实验结果提示，巯基蛋白酶抑制剂E-64和Cystatin A抑制胃癌细胞株体外的细胞粘附和细胞对基质的降解过程，表明CB参与胃癌的侵袭转移，巯基蛋白酶抑制剂有潜在的治疗、控制胃癌转移之作用。
作者简介：陈向荣(1965-)，男，浙江乐清人，医学博士，主治医师，主要从事消化内科临床和肿瘤侵袭转移的基础与应用研究。
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收稿日期：2000-01-03
修回日期：2000-03-13, 百拇医药