维生素D和维生素K对结石大鼠肾脏骨桥蛋白mRNA表达的影响
作者：常连胜 冯 陶 姜长林 姜学军 窦长琪 黄有媛 郭应禄
单位：北京医科大学第一医院泌尿外科研究所，北京 100034
关键词：维生素D；药理学；维生素K；药理学；骨桥蛋白☆；RNA；信使；代谢；肾结石；代谢
北京医科大学学报990513 摘 要 目的：进一步明确维生素D和维生素K与肾结石的关系。方法：健康成年雄性SD大鼠36只随机分成6组，即对照组、单纯成石组、维生素D组、诱石剂+维生素D组、维生素K组和诱石剂+维生素K组，测定肾脏骨桥蛋白(osteopontin, OPN) mRNA的表达量和尿晶体成分的浓度。结果：维生素D和维生素K均可促进肾脏表达OPN mRNA；维生素D可升高尿钙，维生素K则抑制尿草酸的分泌，诱石剂有降低尿镁和柠檬酸的作用。结论：维生素D过多可促进肾结石形成，而维生素K有抑制结石形成的作用。
, 百拇医药 中国图书资料分类法分类号 R692.4
Effects of vitamin D3 and vitamin K3 on the expression
of osteopontin mRNA in rat kidney of stone model
CHANG Lian-Sheng＃, FENG Tao, JIANG Chang-Lin， JIANG Xue-Jun,DOU Chang-Qi, HUANG You-Yuan， GUO Ying-Lu
(＃Institute of Urology, the First Hospital, Beijing Medical University， Beijing 100034)
, 百拇医药
MeSH Vitamin D/pharmacol Vitamin K/pharmacol Osteopontin☆ RNA, messenger/metab Kidney calculi/metab
ABSTRACT Objective： To clarify the relationship between kidney calculi and vitamin D3 as well as vitamin K3 further. Methods： 36 adult male SD rats were randomized into control group， stone-forming group, vitamin D3 group，vitamin D3 with stone-forming group, vitamin K3 group and vitamin K3 with stone-forming group. The urine was collected on day 7, and osteopontin(OPN) mRNA of kidneys and the concentration of the crystal components in urine were detected. Results： Vitamin D3 and vitamin K3 could enhance the expression of OPN mRNA in rat kidneys of stone model. Vitamin D3 could increase the excretion of oxalate in urine, while vitamin K3 inhibited the excretion of oxalate. Stone-inducing agents could inhibit the excretion of magnesium and citrate in urine. Conclusion： The results indicate that vitamin D3 may promote stone formation, whereas vitamin K3 may inhibit this process.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:429-431)
维生素D和维生素K是维持人体正常生命活动的重要因素，并与肾结石的形成有着不同程度的联系。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是重要的尿大分子抑制物，我们测定了大鼠应用这两种维生素后肾脏 OPN mRNA 的表达量和尿晶体成分的变化 ，旨在进一步明确它们与肾结石的关系，探讨成石机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
实验动物由北京医科大学实验动物中心提供。取健康成年雄性SD大鼠36只，体重200～250 g，随机分成6组,每组6只。
1.2 方法
适应实验环境7 d后开始实验。诱石剂为含10 g.L-1乙二醇和10 g.L-1氯化铵的自来水。第1组(对照组)：普通饲料+自来水；第2组(单纯成石组)：普通饲料+诱石剂；第3组：普通饲料+自来水+维生素D3(皮下注射，每只大鼠10 000 U/d，连续用药1周)；第4组：普通饲料+诱石剂+维生素D3；第5组：普通饲料+自来水+维生素K3(皮下注射，每只大鼠4 mg/d，连续用药1周)；第6组：普通饲料+诱石剂+维生素K3；于实验第7天用代谢笼收集第1组、2组、4组和6组24 h尿，-20 ℃保存。然后断颈处死，取出肾脏立即置液氮中，用Northern Blot方法测定鼠肾OPN mRNA的表达，异硫氰酸胍法快速提取RNA, 12 g.L-1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳, 每泳道上样45 μg, 虹吸转膜24 h, 80 ℃烤膜2 h, BamH Ⅰ酶切含大鼠OPN cDNA片段的质粒p2B7(美国华盛顿大学医学院Kleinman博士惠赠), 随机引物法合成32P标记的cDNA探针, 42 ℃杂交36 h, 洗膜, -70 ℃条件下放射自显影24 h。
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1.3 观察指标
用Molecular Analyst软件对Northern Blot结果进行图像分析, 测条带的灰度值。EDTA滴定法测尿钙和尿镁，光电比色法(721分光光度计)测定尿磷、草酸、尿酸和柠檬酸。偏光显微镜观察鼠肾成石情况。
1.4 统计学分析
统计分析采用Graph PAD软件包进行t检验。
2 结果
2.1 Northern Blot结果(图1)
图1 维生素D3、维生素K3及诱石剂对鼠肾OPN mRNA表达的影响
, 百拇医药
Figure 1 Effects of vitamin D3, vitamin K3 and stone-inducing agent on expression of rat kidney OPN mRNA
与正常对照相比，大鼠应用维生素D3后可使鼠肾OPN mRNA表达量升高7倍(70.5/9.3)；与单独应用诱石剂的效果接近(64.9/9.3)；维生素K3可使鼠肾OPN mRNA表达量升高4倍(39.5/9.3)；诱石剂与维生素D3合用使鼠肾OPN mRNA表达量升高10倍(99.9/9.3)；诱石剂与维生素K3合用对鼠肾OPN mRNA表达量升高13倍(120.4/9.3)。
2.2 尿晶体成分的变化(表1)
表1 大鼠结石模型尿晶体成分的变化(c/mmol.L-1,
±s)
, 百拇医药
Table 1 Changes of crystal components of rat urine Groups
Calcium
Magnesium
Phosphorus
Oxalate
(μmol.L-1)
Citrate
Urate
Group 1
1.84±1.98
, 百拇医药
2.89±1.26
33.04±7.64
0.90±0.21
12.89±5.86
1.33±0.41
Group 2
2.67±0.38
0.51±0.45△
36.46±6.88
3.01±0.80△
2.85±0.78△
, 百拇医药
1.52±0.46
Group 4
7.15±3.56△*
0.77±0.45△
37.23±6.61
3.46±0.87△
5.10±3.62△
2.26±0.32△*
Group 6
2.74±0.35
, http://www.100md.com
0.69±0.54△
30.25±5.62
1.11±0.28*
3.99±0.50△
1.71±0.46
Group 1, control group; Group 2, stone-forming group; Group 4, vitamin D3 with stone-forming group; Group 6, vitamin K3 with stone-forming group. △P<0.05 vs group 1；*P<0.05 vs group 2. 大鼠应用诱石剂后尿草酸排泄增加，尿镁和柠檬酸浓度降低，诱石剂+维生素D3组尿钙显著高于单纯成石组，诱石剂+维生素K3组尿草酸盐浓度明显低于单纯成石组(P<0.05)。
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2.3 偏光显微镜
观察对照组鼠肾切面未见晶体沉积，单纯成石组和诱石剂+维生素D3组鼠肾均可见大量晶体，以后者更明显；诱石剂+维生素K3组大鼠肾脏仅有散在晶体分布(1～3个/高倍视野)。
3 讨论
尿液晶体成分经常处于过饱和状态，正常人之所以不产生肾结石，是因为尿中还存在着阻止晶体生长和聚集的抑制物，低分子的抑制物包括焦磷酸盐、镁和柠檬酸，大分子抑制物主要是葡胺聚糖、TH蛋白、肾钙素、尿凝血酶原片段-1、间-α-胰蛋白酶抑制因子及OPN。OPN是一种磷酸化糖蛋白，由亨利氏襻、近曲小管和肾乳头表面上皮分泌，相对分子质量约51 500。正常人尿OPN浓度为～6×10-8 mol.L-1，足以抑制草酸钙结晶，其在尿中的浓度在一定程度上反映了尿抑制结石形成的能力[1～3]。
, 百拇医药
维生素D与尿石症的关系： 维生素D的生理功能包括促进小肠上皮和肾小管上皮细胞吸收钙、磷，促进骨钙释放，从而升高血钙。维生素D对正常生物矿化有非常重要的意义，长期应用维生素D或内源性维生素D分泌过多可发生高血钙和高钙尿，促使肾钙化和肾结石的形成[1，2]。本次实验结果显示，诱石剂能提高尿草酸浓度，降低尿镁和柠檬酸的分泌量；大剂量维生素D虽然可使大鼠结石模型的尿OPN有一定程度升高，但由于由此产生的可能是抑制活性很低的非磷酸化OPN，而且尿钙的升高更显著，使尿钙与草酸易结合成为溶解度较低的草酸钙，在肾脏内形成大量晶体，通过生长和聚集而逐渐形成结石[4]。许多结石病人钙的吸收是通过维生素D依赖机制，约50%的吸收性高钙尿病人血维生素D浓度升高[2]。因此，维生素D过多是肾结石形成的重要危险因素。
维生素K与尿石症的关系： 维生素K是在胆汁和胰脂肪酶作用下由小肠吸收，临床发现部分消化道疾病伴有反复发生的草酸钙结石，这可能与肠道吸收草酸增加以及尿排泄草酸增加有关。我们过去的研究发现，给大鼠应用维生素K拮抗剂香豆素后，肾内草酸钙结晶数目及肾组织中草酸含量明显高于对照组，提示维生素K在肾结石形成中有重要意义[5]。本实验显示，同时应用维生素K和诱石剂的大鼠尿草酸明显低于单纯诱石组，而肾OPN mRNA的表达量明显升高，即可提高尿OPN浓度，从而发挥抗结石形成作用。此外，维生素K对羧化酶的活性至关重要，而γ-羧化谷氨酸的含量升高可提高尿大分子抑制物的活性[6]。因此，尿石症病人适当补充维生素K有一定积极意义。
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注：国家自然科学基金(39670722)资助课题；
姜长林 进修医师；
☆自由词。
参考文献
1 Jiang XJ, Feng T, Chang LS, et al. Expression of osteopontin mRNA in normal and stone-forming rat kidney. Urol Res, 1998, 26(6): 389-394
2 Balaji KC, Menon M. Mechanism of stone formation. Urol Clin North Am,1997,24:1-11
3 姜学军，冯 陶，常连胜，等. 骨桥蛋白在人肾和鼠肾中的表达. 中华医学杂志,1998,11:871-872
, http://www.100md.com
4 Chang PL, Prince CW. 1.25, α-Dihydroxyvitamin D3 stimulates synthesis and secretion of nonphosphorylated osteopontin (secreted phosphoprotein 1 ) in mouse JB6 epidermal cells. Cancer Res， 1991,51:2114-2150
5 安瑞华,冯 陶,郭应禄,等. 香豆素对实验性大鼠草酸钙结石形成的影响. 中华泌尿外科杂志,1994,15:209-211
6 Hauschka PV, Friedman PA, Traverso HP, et al. Vitamin K dependent r-carboxyglutamic acid formation by kidney microsomes in vitro. Biochem Biophys Res Com, 1976,71:1207-1213
(1998-10-27收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学第一医院泌尿外科研究所，北京 100034
关键词：维生素D；药理学；维生素K；药理学；骨桥蛋白☆；RNA；信使；代谢；肾结石；代谢
北京医科大学学报990513 摘 要 目的：进一步明确维生素D和维生素K与肾结石的关系。方法：健康成年雄性SD大鼠36只随机分成6组，即对照组、单纯成石组、维生素D组、诱石剂+维生素D组、维生素K组和诱石剂+维生素K组，测定肾脏骨桥蛋白(osteopontin, OPN) mRNA的表达量和尿晶体成分的浓度。结果：维生素D和维生素K均可促进肾脏表达OPN mRNA；维生素D可升高尿钙，维生素K则抑制尿草酸的分泌，诱石剂有降低尿镁和柠檬酸的作用。结论：维生素D过多可促进肾结石形成，而维生素K有抑制结石形成的作用。
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Effects of vitamin D3 and vitamin K3 on the expression
of osteopontin mRNA in rat kidney of stone model
CHANG Lian-Sheng＃, FENG Tao, JIANG Chang-Lin， JIANG Xue-Jun,DOU Chang-Qi, HUANG You-Yuan， GUO Ying-Lu
(＃Institute of Urology, the First Hospital, Beijing Medical University， Beijing 100034)
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MeSH Vitamin D/pharmacol Vitamin K/pharmacol Osteopontin☆ RNA, messenger/metab Kidney calculi/metab
ABSTRACT Objective： To clarify the relationship between kidney calculi and vitamin D3 as well as vitamin K3 further. Methods： 36 adult male SD rats were randomized into control group， stone-forming group, vitamin D3 group，vitamin D3 with stone-forming group, vitamin K3 group and vitamin K3 with stone-forming group. The urine was collected on day 7, and osteopontin(OPN) mRNA of kidneys and the concentration of the crystal components in urine were detected. Results： Vitamin D3 and vitamin K3 could enhance the expression of OPN mRNA in rat kidneys of stone model. Vitamin D3 could increase the excretion of oxalate in urine, while vitamin K3 inhibited the excretion of oxalate. Stone-inducing agents could inhibit the excretion of magnesium and citrate in urine. Conclusion： The results indicate that vitamin D3 may promote stone formation, whereas vitamin K3 may inhibit this process.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:429-431)
维生素D和维生素K是维持人体正常生命活动的重要因素，并与肾结石的形成有着不同程度的联系。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是重要的尿大分子抑制物，我们测定了大鼠应用这两种维生素后肾脏 OPN mRNA 的表达量和尿晶体成分的变化 ，旨在进一步明确它们与肾结石的关系，探讨成石机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
实验动物由北京医科大学实验动物中心提供。取健康成年雄性SD大鼠36只，体重200～250 g，随机分成6组,每组6只。
1.2 方法
适应实验环境7 d后开始实验。诱石剂为含10 g.L-1乙二醇和10 g.L-1氯化铵的自来水。第1组(对照组)：普通饲料+自来水；第2组(单纯成石组)：普通饲料+诱石剂；第3组：普通饲料+自来水+维生素D3(皮下注射，每只大鼠10 000 U/d，连续用药1周)；第4组：普通饲料+诱石剂+维生素D3；第5组：普通饲料+自来水+维生素K3(皮下注射，每只大鼠4 mg/d，连续用药1周)；第6组：普通饲料+诱石剂+维生素K3；于实验第7天用代谢笼收集第1组、2组、4组和6组24 h尿，-20 ℃保存。然后断颈处死，取出肾脏立即置液氮中，用Northern Blot方法测定鼠肾OPN mRNA的表达，异硫氰酸胍法快速提取RNA, 12 g.L-1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳, 每泳道上样45 μg, 虹吸转膜24 h, 80 ℃烤膜2 h, BamH Ⅰ酶切含大鼠OPN cDNA片段的质粒p2B7(美国华盛顿大学医学院Kleinman博士惠赠), 随机引物法合成32P标记的cDNA探针, 42 ℃杂交36 h, 洗膜, -70 ℃条件下放射自显影24 h。
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1.3 观察指标
用Molecular Analyst软件对Northern Blot结果进行图像分析, 测条带的灰度值。EDTA滴定法测尿钙和尿镁，光电比色法(721分光光度计)测定尿磷、草酸、尿酸和柠檬酸。偏光显微镜观察鼠肾成石情况。
1.4 统计学分析
统计分析采用Graph PAD软件包进行t检验。
2 结果
2.1 Northern Blot结果(图1)
图1 维生素D3、维生素K3及诱石剂对鼠肾OPN mRNA表达的影响
, 百拇医药
Figure 1 Effects of vitamin D3, vitamin K3 and stone-inducing agent on expression of rat kidney OPN mRNA
与正常对照相比，大鼠应用维生素D3后可使鼠肾OPN mRNA表达量升高7倍(70.5/9.3)；与单独应用诱石剂的效果接近(64.9/9.3)；维生素K3可使鼠肾OPN mRNA表达量升高4倍(39.5/9.3)；诱石剂与维生素D3合用使鼠肾OPN mRNA表达量升高10倍(99.9/9.3)；诱石剂与维生素K3合用对鼠肾OPN mRNA表达量升高13倍(120.4/9.3)。
2.2 尿晶体成分的变化(表1)
表1 大鼠结石模型尿晶体成分的变化(c/mmol.L-1,
±s), 百拇医药
Table 1 Changes of crystal components of rat urine Groups
Calcium
Magnesium
Phosphorus
Oxalate
(μmol.L-1)
Citrate
Urate
Group 1
1.84±1.98
, 百拇医药
2.89±1.26
33.04±7.64
0.90±0.21
12.89±5.86
1.33±0.41
Group 2
2.67±0.38
0.51±0.45△
36.46±6.88
3.01±0.80△
2.85±0.78△
, 百拇医药
1.52±0.46
Group 4
7.15±3.56△*
0.77±0.45△
37.23±6.61
3.46±0.87△
5.10±3.62△
2.26±0.32△*
Group 6
2.74±0.35
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0.69±0.54△
30.25±5.62
1.11±0.28*
3.99±0.50△
1.71±0.46
Group 1, control group; Group 2, stone-forming group; Group 4, vitamin D3 with stone-forming group; Group 6, vitamin K3 with stone-forming group. △P<0.05 vs group 1；*P<0.05 vs group 2. 大鼠应用诱石剂后尿草酸排泄增加，尿镁和柠檬酸浓度降低，诱石剂+维生素D3组尿钙显著高于单纯成石组，诱石剂+维生素K3组尿草酸盐浓度明显低于单纯成石组(P<0.05)。
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2.3 偏光显微镜
观察对照组鼠肾切面未见晶体沉积，单纯成石组和诱石剂+维生素D3组鼠肾均可见大量晶体，以后者更明显；诱石剂+维生素K3组大鼠肾脏仅有散在晶体分布(1～3个/高倍视野)。
3 讨论
尿液晶体成分经常处于过饱和状态，正常人之所以不产生肾结石，是因为尿中还存在着阻止晶体生长和聚集的抑制物，低分子的抑制物包括焦磷酸盐、镁和柠檬酸，大分子抑制物主要是葡胺聚糖、TH蛋白、肾钙素、尿凝血酶原片段-1、间-α-胰蛋白酶抑制因子及OPN。OPN是一种磷酸化糖蛋白，由亨利氏襻、近曲小管和肾乳头表面上皮分泌，相对分子质量约51 500。正常人尿OPN浓度为～6×10-8 mol.L-1，足以抑制草酸钙结晶，其在尿中的浓度在一定程度上反映了尿抑制结石形成的能力[1～3]。
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维生素D与尿石症的关系： 维生素D的生理功能包括促进小肠上皮和肾小管上皮细胞吸收钙、磷，促进骨钙释放，从而升高血钙。维生素D对正常生物矿化有非常重要的意义，长期应用维生素D或内源性维生素D分泌过多可发生高血钙和高钙尿，促使肾钙化和肾结石的形成[1，2]。本次实验结果显示，诱石剂能提高尿草酸浓度，降低尿镁和柠檬酸的分泌量；大剂量维生素D虽然可使大鼠结石模型的尿OPN有一定程度升高，但由于由此产生的可能是抑制活性很低的非磷酸化OPN，而且尿钙的升高更显著，使尿钙与草酸易结合成为溶解度较低的草酸钙，在肾脏内形成大量晶体，通过生长和聚集而逐渐形成结石[4]。许多结石病人钙的吸收是通过维生素D依赖机制，约50%的吸收性高钙尿病人血维生素D浓度升高[2]。因此，维生素D过多是肾结石形成的重要危险因素。
维生素K与尿石症的关系： 维生素K是在胆汁和胰脂肪酶作用下由小肠吸收，临床发现部分消化道疾病伴有反复发生的草酸钙结石，这可能与肠道吸收草酸增加以及尿排泄草酸增加有关。我们过去的研究发现，给大鼠应用维生素K拮抗剂香豆素后，肾内草酸钙结晶数目及肾组织中草酸含量明显高于对照组，提示维生素K在肾结石形成中有重要意义[5]。本实验显示，同时应用维生素K和诱石剂的大鼠尿草酸明显低于单纯诱石组，而肾OPN mRNA的表达量明显升高，即可提高尿OPN浓度，从而发挥抗结石形成作用。此外，维生素K对羧化酶的活性至关重要，而γ-羧化谷氨酸的含量升高可提高尿大分子抑制物的活性[6]。因此，尿石症病人适当补充维生素K有一定积极意义。
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注：国家自然科学基金(39670722)资助课题；
姜长林 进修医师；
☆自由词。
参考文献
1 Jiang XJ, Feng T, Chang LS, et al. Expression of osteopontin mRNA in normal and stone-forming rat kidney. Urol Res, 1998, 26(6): 389-394
2 Balaji KC, Menon M. Mechanism of stone formation. Urol Clin North Am,1997,24:1-11
3 姜学军，冯 陶，常连胜，等. 骨桥蛋白在人肾和鼠肾中的表达. 中华医学杂志,1998,11:871-872
, http://www.100md.com
4 Chang PL, Prince CW. 1.25, α-Dihydroxyvitamin D3 stimulates synthesis and secretion of nonphosphorylated osteopontin (secreted phosphoprotein 1 ) in mouse JB6 epidermal cells. Cancer Res， 1991,51:2114-2150
5 安瑞华,冯 陶,郭应禄,等. 香豆素对实验性大鼠草酸钙结石形成的影响. 中华泌尿外科杂志,1994,15:209-211
6 Hauschka PV, Friedman PA, Traverso HP, et al. Vitamin K dependent r-carboxyglutamic acid formation by kidney microsomes in vitro. Biochem Biophys Res Com, 1976,71:1207-1213
(1998-10-27收稿), http://www.100md.com