TNF-α参与消炎痛诱导大鼠胃粘膜损伤机制的探讨
作者：李国平 邓长生 杜意平 黄梅芳 郑文
单位：湖北医科大学第二医院消化内科(武汉 430071)
关键词：肿瘤坏死因子；吲噌美辛；胃粘膜
中国病理生理杂志990913 摘 要 目的：探讨消炎痛诱导大鼠胃粘膜损伤与血浆TNF-α活性的关系。方法与结果：随着消炎痛灌胃剂量的加大，胃粘膜损伤程度、中性粒细胞浸润程度、脂质过氧化程度加重，血浆TNF-α活性升高。预先给予TNF-α单克隆抗体在抑制20 mg/kg消炎痛诱导的血浆TNF-α活性升高，同时胃粘膜损伤程度及中性粒细胞浸润程度下降，但粘膜脂质过氧化改变不明显。结论：在消炎痛损伤胃粘膜过程中血浆TNF-α活性升高，TNF-α可能与中性粒细胞的激活、促进其浸润至胃粘膜组织有关。拮抗TNF-α可减轻由消炎痛诱导的实验性胃粘膜损伤。
A study of tumor necrosis factor-α involvement in the pathogenesis of gastric mucosal injury induced by indomethacin in rats
, http://www.100md.com
LI Guo-Ping, DENG Chang-Sheng, DU Yi-Ping, HUANG Mei-Fang, ZHENG Wen
Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan (430071)
Abstract AIM:To investigate the relations of gastric mucosal injury by indomethacin and plasma TNF-α activity in rats. METHODS and RESULTS：Leukocyte infiltration, lipid peroxidation, plasma TNF-α activity were increased with the dosage of indomethacin administration. Pretreatment with McAb-TNF-α produced a significant improvement in damage, leukocyte infiltration when compared with pretreatment with placebo in administration of indomethacin 20 mg/kg. In addition, the activity of TNF-α was reduced significantly, however lipid peroxidation was not changed significantly. CONCLUSIONS：TNF-α which activates leukocyte, stimulates the infiltration of leukocyte may involve the pathogenesis of indomethacin induced gastric mucosal injury. Neutralization of TNF-α ameliorates acute experimental gastric mucosal injury induced by indomethacin in rats.
, 百拇医药
MeSH Tumor necrosis factor; Indomethacin; Gastric mucosa
消炎痛(indomethacin, INDO)等非甾体类抗炎药(NSAIDs)能诱导胃粘膜损伤早已为人们所熟知，其机制常归因于此类药物强大的抑制内源性前列腺素生物合成。近来有报道消炎痛灌胃可引起大鼠血浆TNF-α活性升高，且调节TNF-α合成与释放影响消炎痛损伤胃粘膜能力[1]。消炎痛损伤胃粘膜也与循环中的中性粒细胞关系密切[2]。为进一步探讨TNF-α与消炎痛损伤胃粘膜的关系，本实验应用不同剂量消炎痛灌胃，研究其剂量与胃粘膜损伤程度、中性粒细胞浸润及脂质过氧化程度、血浆TNF-α活性的关系，以及预先给予TNF-α单克隆抗体对消炎痛损伤胃粘膜的影响。
材料与方法
一、药品与实验动物：
, http://www.100md.com
重组TNF-α(rhTNF-α),比活性6×106 U/mg蛋白、TNF-α单克隆抗体(McAb-TNF-α, IgG类)，非特异性鼠IgG为军事医学科学院基础医学研究所产品，消炎痛注射液，武汉市第四医院产品，批号970548，临用前用5% NaHCO3稀释；成年雄性SD大鼠，体重170～200 g，本校动物室提供，实验前24～28 h禁食、4 h禁水。
二、实验方法：
实验Ⅰ：不同剂量消炎痛灌胃对胃粘膜及血浆TNF-α活性的影响：大鼠随机分成4组。每组6只，对照组经口灌胃5% NaHCO3 0.5 mL/100 g，其余3组作为实验组分别予以10、20、30 mg/kg消炎痛灌胃，总体积数均为0.5 mL/100 g。灌胃后5 h，乙醚麻醉下无菌操作，自心脏抽血2～3 mL，肝素抗凝，分离出血浆，置于-20℃保存待测。将胃迅速取出，沿大弯侧剪开，固定在平台上照像后取大弯侧腺胃部小块粘膜组织(3 mm×10 mm),石蜡包埋，切片(厚5 μm)，常规HE染色。用钝刀片刮取适量粘膜组织，用20 mmol/L PBS(pH7.4)制备成10%匀浆，经1000 r/min离心10 min,弃上清，沉渣重新在等体积的50 mmol/LPBS (pH6.0,含0.5% HETAB， 10 mmol/L EDTA)中匀浆，-20℃保存待测。
, 百拇医药
实验Ⅱ：TNF-α单克隆抗体(McAb-TNF-α)预处理对消炎痛损伤胃粘膜的影响：大鼠随机分成2组，每组5只，对照组经尾静脉注射非特异性鼠IgG(nonspecific murine IgG)2 mg/kg,5 min后经口灌胃消炎痛20 mg/kg，处理组经尾静脉注射McAb-TNF-α 2 mg/kg,5 min后经口灌胃消炎痛20 mg/kg,其余处理过程同实验Ⅰ。
三、测定指标：
(一)胃粘膜损伤指数：在IBAS图像分析系统(德国Tontron公司)上测定每个损伤区最大径(DMAX)并积分，作为胃粘膜损伤指数。
(二)胃粘膜损伤的组织学评价及中性粒细胞浸润程度评价：每份标本随机选择2个视野，胃粘膜损伤的组织学评价按下列主观分级标准处理[3]：0级，无损伤；Ⅰ级，损伤区局限于表面粘膜上皮细胞；Ⅱ级，广泛的表面粘膜上皮损伤伴显著的胃小凹损伤；Ⅲ级，损伤超过胃小凹，但小于50%粘膜厚度；Ⅳ级，损伤大于50%粘膜厚度。中性粒细胞浸润程度按下列标准处理[4]：0级，无；Ⅰ级，局限于浅表上皮区血管；Ⅱ级，扩展到胃腺底部；Ⅲ级，扩展到粘膜下层和(或)粘膜肌层的血管外。
, http://www.100md.com
(三)粘膜MPO活性及脂质过氧化测定：髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)主要位于中性粒细胞嗜苯胺蓝体中，其活性常被用作中性粒细胞组织浸润程度的标志，测定方法是改进的四甲基联苯胺法[5]。脂质过氧化产物丙二醛(MDA)测定采用TAB法。
(四)血浆TNF-α活性测定采用L929细胞毒方法[6]。
(五)McAb-TNF-α对rh TNF-α的细胞毒中和能力[7]及相对亲和力测定[8]。
四、统计学处理：
数据采用x±s表示，多组资料间比较采用方差分析和q检验，两组资料间比较采用小样本t检验。计数资料间比较用秩和检验(Nemenyi法)。
, http://www.100md.com 结果
(一)不同剂量消炎痛灌胃对胃粘膜及血浆TNF-α活性的影响：见表1。10、20、30 mg/kg消炎痛灌胃后胃粘膜大体标本可见不同程度点、线样出血、溃疡状损伤，主要位于腺胃部皱褶区。胃粘膜切片可见表面粘液层破坏，表面上皮细胞不同程度坏死，上皮连续性破坏，部分损伤到达胃小凹或胃腺底部。粘膜层、粘膜下层充血，不同程度中性粒细胞浸润，以上组织学表现随着消炎痛剂量加大而加重。正常对照组粘膜上皮未见损伤，粘膜浅层偶见中性粒细胞浸润。消炎痛灌胃可引起血浆TNF-α活性、粘膜MPO活性及MDA含量呈剂量依赖性增高。
表1 不同剂量消炎痛灌胃对胃粘膜及血浆TNF-α活性的影响
Tab 1 The effects of the dose of indomethacin (Indo) administration on the gastric mucosa and plasma TNF-α activity (x±s, n=6) Group
, 百拇医药
Plasma TNF-αactivity(U/ml)
Gastric mucosa
Damage score(mm)
Damage under
Light microscope
Leukocyte
infiltration
MPO activity
(U/g protein)
MDA content
, 百拇医药 (mol/mg protein)
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Vehicle control
3.4±1.3
0
, 百拇医药
12
0
0
0
0
8
4
0
0
13.3±1.4
0.371±0.011
10mg/kg Indo
16.7±4.5
, 百拇医药
4.75±1.32
0
4
7
1
0
0
6
4
2
17.14±2.3
0.398±0.035
20mg/kg Indo
, 百拇医药
30.2±6.1**
28.36±7.28
0
0
5
5
2
0
1
6
5**
28.6±7.3*
0.627±0.052*
, 百拇医药
30mg/kg Indo
34.8±7.9**
31.24±9.56
0
0
2
6
4
0
0
6
6**
31.2±6.1*
, http://www.100md.com
0.648±0.069*
*P<0.05, * *P<0.01, vs vehicle control
(二)应用McAb-TNF-α对消炎痛损伤胃粘膜的影响：见表2。预先应用McAb-TNF-α 2 mg/kg与对照组相比，20 mg/kg消炎痛灌胃5 h后血浆TNF-α活性明显下降；与此同时，胃粘膜大体损伤也明显减轻，粘膜MPO活性下降，但MDA下降不明显。组织学观察表明，两组胃粘膜粘液层均消失，但McAb组比对照组的组织学损伤程度较轻，表现在上皮结构、腺体破坏及中性粒细胞浸润程度等均减轻。表2 拮抗TNF-α对20 mg/kg消炎痛灌胃的影响
Tab 2 The effects of neutralization of TNF-α on 20 mg/kg indomethacin administration (x±s, n=5) Group
, 百拇医药
Plasma TNF-α activity(U/mL)
Gastric mucosa
Damage score
(mm)
MPO activity
(U/g protein)
MDA content
(nmol/mg protein)
Control
33.2±4.8
34.17±7.43
, http://www.100md.com
24.5±7.1
0.633±0.067
McAb
19.7±6.5*
19.66±5.68*
15.8±5.4*
0.601±0.085
*P<0.05,vs control
(三)McAb-TNF-α对rh TNF-α细胞毒的中和能力及相对亲和常数：McAb-TNF-α经连续稀释至1.25 μg/mL时仍对培养体系中的10 U rh TNF-α的L929细胞毒具有中和能力，进一步稀释则中和能力消失。McAb-TNF-α自4 μg/mL起经128倍稀释后其A 490 nm值才低于对照值，由此计算出相对亲和常数是1.95×10-10 NM。
, 百拇医药
讨论
文献报道消炎痛导致血浆TNF-α活性增高与前列腺素E2(PGE2)合成被抑制有关。因为PGE2是调节TNF-α合成和释放的一条重要途径，它可明显降低TNF-α基因的转录，故PGE2合成被抑制能促使巨噬细胞合成和释放TNF-α[9]。另外，消炎痛也能对小肠、结肠粘膜造成点、线状损伤，肠粘膜通透性的增高使肠道内细菌内毒素有机会进入体内诱生TNF-α。TNF-α是与炎症反应关系最为密切的前炎症细胞因子(proinflammatory cytokine)之一，预先使用IL-2、LPS或G-CSF、地塞米松、己酮可可碱等调节TNF-α的合成和释放能显著影响消炎痛损伤胃粘膜的能力[1]。本文实验结果也显示，消炎痛灌胃可引起血浆TNF-α性活呈剂量依赖性地升高，使用TNF-α单克隆抗体直接拮抗TNF-α在显著降低循环中TNF-α活性同时，能显著减轻消炎痛诱导的胃粘膜损伤，胃粘膜中性粒细胞浸润程度也下降，说明TNF-α参与了消炎痛诱导的胃粘膜损伤过程，并且与中性粒细胞浸润有关。
, http://www.100md.com
在消炎痛诱导的胃粘膜损伤过程中，引发粘膜脂质过氧化的氧自由基除了来源于中性粒细胞外，还有另一个来源即NSAIDS抑制氧化磷酸化，产生一磷酸腺苷，后者激活黄嘌呤氧化通路(Xanthine Oxidase pathway)从而产生自由基[10]。另外，NSAIDs可减少前列腺素依赖的粘膜粘液分泌，而粘液是一种重要的自由基天然清除剂(scavenger)。故使用TNF-α单克隆抗体尽管能降低粘膜中性粒细胞浸润程度，但粘膜脂质过氧化改善并不明显。
本实验所使用的TNF-α单克隆抗体是经杂交瘤技术从BALB/c小鼠腹水中提取纯化的。实验证明其对天然及重组TNF-α具有一定细胞毒中和能力和亲和力。亲和力表示抗原抗体结合的紧密程度，本文采用ABC-ELISA所测得的是相对亲和力，本方法与其它方法比较具有简便、迅速、可靠、不需标记抗原抗体，无放射性危害等优点。
参考文献
, 百拇医药
1 Santucci L, Fiorucci S, Matteo FM, et al. Role of tumor necrosis factor-α release and leukocyte margination in indomethacin induced gastric injury in rats. Gastroenterology, 1995, 108:393.
2 Wallace JL, Keenan CM, Granger DN. Gastric ulceration in-duced by nonsteroidal anti-inflammatory drugs is a neutrophil-dependent process. Am J Physiol, 1990, 285:G462.
3 Ogletree ML, O'keefe EH, Durham SK, et al. Gastroprotective effects of thromboxane receptor. J Pharmacol Exp There, 1992, 263(1):374.
, 百拇医药
4 Santucci L, Fiorucci S, Giansanti M, et al. Pentoxifylline prevents indomethacin induced acute gastric mucosal damage in rats: role of tumor necrosis factor alpha. Gut, 1994, 35:909.
5 Suzuki K, Ota H, Sasagawa S, et al. Assay method for myelope-roxidase in human polymorphonuclear leukocytes. Anal Biochem, 1983, 132:345.
6 Fick DA, Gifford GE. Comparison of in vitro cell cytoxic assays for tumor necrosis factor. J Immunol Methods, 1984, 68:167.
, 百拇医药
7 徐 军，徐贤秀，朱剑琴，等.肿瘤坏死因子作用部位的初步分析.中华微生物学和免疫学杂志，1991， 11：378.
8 马世英，刘尼培，陈晓琳，等.一组抗肿瘤单克隆抗体相对亲和常数的测定.免疫学杂志，1991，7(4)：265.
9 孙耕耘，毛宝龄.白介素-1、肿瘤坏死因子与炎症.生理科学进展，1993，24：23.
10 张万岱.幽门螺杆菌与非类固醇抗炎药诱发的胃十二指肠损伤.见：周殿元，杨海涛，张万岱，主编.幽门螺杆菌与胃十二肠疾病.第1版.上海：上海科学技术文献出版社，1992.314.
(1998年2月15日收稿，1998年6月26日修回), http://www.100md.com
单位：湖北医科大学第二医院消化内科(武汉 430071)
关键词：肿瘤坏死因子；吲噌美辛；胃粘膜
中国病理生理杂志990913 摘 要 目的：探讨消炎痛诱导大鼠胃粘膜损伤与血浆TNF-α活性的关系。方法与结果：随着消炎痛灌胃剂量的加大，胃粘膜损伤程度、中性粒细胞浸润程度、脂质过氧化程度加重，血浆TNF-α活性升高。预先给予TNF-α单克隆抗体在抑制20 mg/kg消炎痛诱导的血浆TNF-α活性升高，同时胃粘膜损伤程度及中性粒细胞浸润程度下降，但粘膜脂质过氧化改变不明显。结论：在消炎痛损伤胃粘膜过程中血浆TNF-α活性升高，TNF-α可能与中性粒细胞的激活、促进其浸润至胃粘膜组织有关。拮抗TNF-α可减轻由消炎痛诱导的实验性胃粘膜损伤。
A study of tumor necrosis factor-α involvement in the pathogenesis of gastric mucosal injury induced by indomethacin in rats
, http://www.100md.com
LI Guo-Ping, DENG Chang-Sheng, DU Yi-Ping, HUANG Mei-Fang, ZHENG Wen
Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan (430071)
Abstract AIM:To investigate the relations of gastric mucosal injury by indomethacin and plasma TNF-α activity in rats. METHODS and RESULTS：Leukocyte infiltration, lipid peroxidation, plasma TNF-α activity were increased with the dosage of indomethacin administration. Pretreatment with McAb-TNF-α produced a significant improvement in damage, leukocyte infiltration when compared with pretreatment with placebo in administration of indomethacin 20 mg/kg. In addition, the activity of TNF-α was reduced significantly, however lipid peroxidation was not changed significantly. CONCLUSIONS：TNF-α which activates leukocyte, stimulates the infiltration of leukocyte may involve the pathogenesis of indomethacin induced gastric mucosal injury. Neutralization of TNF-α ameliorates acute experimental gastric mucosal injury induced by indomethacin in rats.
, 百拇医药
MeSH Tumor necrosis factor; Indomethacin; Gastric mucosa
消炎痛(indomethacin, INDO)等非甾体类抗炎药(NSAIDs)能诱导胃粘膜损伤早已为人们所熟知，其机制常归因于此类药物强大的抑制内源性前列腺素生物合成。近来有报道消炎痛灌胃可引起大鼠血浆TNF-α活性升高，且调节TNF-α合成与释放影响消炎痛损伤胃粘膜能力[1]。消炎痛损伤胃粘膜也与循环中的中性粒细胞关系密切[2]。为进一步探讨TNF-α与消炎痛损伤胃粘膜的关系，本实验应用不同剂量消炎痛灌胃，研究其剂量与胃粘膜损伤程度、中性粒细胞浸润及脂质过氧化程度、血浆TNF-α活性的关系，以及预先给予TNF-α单克隆抗体对消炎痛损伤胃粘膜的影响。
材料与方法
一、药品与实验动物：
, http://www.100md.com
重组TNF-α(rhTNF-α),比活性6×106 U/mg蛋白、TNF-α单克隆抗体(McAb-TNF-α, IgG类)，非特异性鼠IgG为军事医学科学院基础医学研究所产品，消炎痛注射液，武汉市第四医院产品，批号970548，临用前用5% NaHCO3稀释；成年雄性SD大鼠，体重170～200 g，本校动物室提供，实验前24～28 h禁食、4 h禁水。
二、实验方法：
实验Ⅰ：不同剂量消炎痛灌胃对胃粘膜及血浆TNF-α活性的影响：大鼠随机分成4组。每组6只，对照组经口灌胃5% NaHCO3 0.5 mL/100 g，其余3组作为实验组分别予以10、20、30 mg/kg消炎痛灌胃，总体积数均为0.5 mL/100 g。灌胃后5 h，乙醚麻醉下无菌操作，自心脏抽血2～3 mL，肝素抗凝，分离出血浆，置于-20℃保存待测。将胃迅速取出，沿大弯侧剪开，固定在平台上照像后取大弯侧腺胃部小块粘膜组织(3 mm×10 mm),石蜡包埋，切片(厚5 μm)，常规HE染色。用钝刀片刮取适量粘膜组织，用20 mmol/L PBS(pH7.4)制备成10%匀浆，经1000 r/min离心10 min,弃上清，沉渣重新在等体积的50 mmol/LPBS (pH6.0,含0.5% HETAB， 10 mmol/L EDTA)中匀浆，-20℃保存待测。
, 百拇医药
实验Ⅱ：TNF-α单克隆抗体(McAb-TNF-α)预处理对消炎痛损伤胃粘膜的影响：大鼠随机分成2组，每组5只，对照组经尾静脉注射非特异性鼠IgG(nonspecific murine IgG)2 mg/kg,5 min后经口灌胃消炎痛20 mg/kg，处理组经尾静脉注射McAb-TNF-α 2 mg/kg,5 min后经口灌胃消炎痛20 mg/kg,其余处理过程同实验Ⅰ。
三、测定指标：
(一)胃粘膜损伤指数：在IBAS图像分析系统(德国Tontron公司)上测定每个损伤区最大径(DMAX)并积分，作为胃粘膜损伤指数。
(二)胃粘膜损伤的组织学评价及中性粒细胞浸润程度评价：每份标本随机选择2个视野，胃粘膜损伤的组织学评价按下列主观分级标准处理[3]：0级，无损伤；Ⅰ级，损伤区局限于表面粘膜上皮细胞；Ⅱ级，广泛的表面粘膜上皮损伤伴显著的胃小凹损伤；Ⅲ级，损伤超过胃小凹，但小于50%粘膜厚度；Ⅳ级，损伤大于50%粘膜厚度。中性粒细胞浸润程度按下列标准处理[4]：0级，无；Ⅰ级，局限于浅表上皮区血管；Ⅱ级，扩展到胃腺底部；Ⅲ级，扩展到粘膜下层和(或)粘膜肌层的血管外。
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(三)粘膜MPO活性及脂质过氧化测定：髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)主要位于中性粒细胞嗜苯胺蓝体中，其活性常被用作中性粒细胞组织浸润程度的标志，测定方法是改进的四甲基联苯胺法[5]。脂质过氧化产物丙二醛(MDA)测定采用TAB法。
(四)血浆TNF-α活性测定采用L929细胞毒方法[6]。
(五)McAb-TNF-α对rh TNF-α的细胞毒中和能力[7]及相对亲和力测定[8]。
四、统计学处理：
数据采用x±s表示，多组资料间比较采用方差分析和q检验，两组资料间比较采用小样本t检验。计数资料间比较用秩和检验(Nemenyi法)。
, http://www.100md.com 结果
(一)不同剂量消炎痛灌胃对胃粘膜及血浆TNF-α活性的影响：见表1。10、20、30 mg/kg消炎痛灌胃后胃粘膜大体标本可见不同程度点、线样出血、溃疡状损伤，主要位于腺胃部皱褶区。胃粘膜切片可见表面粘液层破坏，表面上皮细胞不同程度坏死，上皮连续性破坏，部分损伤到达胃小凹或胃腺底部。粘膜层、粘膜下层充血，不同程度中性粒细胞浸润，以上组织学表现随着消炎痛剂量加大而加重。正常对照组粘膜上皮未见损伤，粘膜浅层偶见中性粒细胞浸润。消炎痛灌胃可引起血浆TNF-α活性、粘膜MPO活性及MDA含量呈剂量依赖性增高。
表1 不同剂量消炎痛灌胃对胃粘膜及血浆TNF-α活性的影响
Tab 1 The effects of the dose of indomethacin (Indo) administration on the gastric mucosa and plasma TNF-α activity (x±s, n=6) Group
, 百拇医药
Plasma TNF-αactivity(U/ml)
Gastric mucosa
Damage score(mm)
Damage under
Light microscope
Leukocyte
infiltration
MPO activity
(U/g protein)
MDA content
, 百拇医药 (mol/mg protein)
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Vehicle control
3.4±1.3
0
, 百拇医药
12
0
0
0
0
8
4
0
0
13.3±1.4
0.371±0.011
10mg/kg Indo
16.7±4.5
, 百拇医药
4.75±1.32
0
4
7
1
0
0
6
4
2
17.14±2.3
0.398±0.035
20mg/kg Indo
, 百拇医药
30.2±6.1**
28.36±7.28
0
0
5
5
2
0
1
6
5**
28.6±7.3*
0.627±0.052*
, 百拇医药
30mg/kg Indo
34.8±7.9**
31.24±9.56
0
0
2
6
4
0
0
6
6**
31.2±6.1*
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0.648±0.069*
*P<0.05, * *P<0.01, vs vehicle control
(二)应用McAb-TNF-α对消炎痛损伤胃粘膜的影响：见表2。预先应用McAb-TNF-α 2 mg/kg与对照组相比，20 mg/kg消炎痛灌胃5 h后血浆TNF-α活性明显下降；与此同时，胃粘膜大体损伤也明显减轻，粘膜MPO活性下降，但MDA下降不明显。组织学观察表明，两组胃粘膜粘液层均消失，但McAb组比对照组的组织学损伤程度较轻，表现在上皮结构、腺体破坏及中性粒细胞浸润程度等均减轻。表2 拮抗TNF-α对20 mg/kg消炎痛灌胃的影响
Tab 2 The effects of neutralization of TNF-α on 20 mg/kg indomethacin administration (x±s, n=5) Group
, 百拇医药
Plasma TNF-α activity(U/mL)
Gastric mucosa
Damage score
(mm)
MPO activity
(U/g protein)
MDA content
(nmol/mg protein)
Control
33.2±4.8
34.17±7.43
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24.5±7.1
0.633±0.067
McAb
19.7±6.5*
19.66±5.68*
15.8±5.4*
0.601±0.085
*P<0.05,vs control
(三)McAb-TNF-α对rh TNF-α细胞毒的中和能力及相对亲和常数：McAb-TNF-α经连续稀释至1.25 μg/mL时仍对培养体系中的10 U rh TNF-α的L929细胞毒具有中和能力，进一步稀释则中和能力消失。McAb-TNF-α自4 μg/mL起经128倍稀释后其A 490 nm值才低于对照值，由此计算出相对亲和常数是1.95×10-10 NM。
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讨论
文献报道消炎痛导致血浆TNF-α活性增高与前列腺素E2(PGE2)合成被抑制有关。因为PGE2是调节TNF-α合成和释放的一条重要途径，它可明显降低TNF-α基因的转录，故PGE2合成被抑制能促使巨噬细胞合成和释放TNF-α[9]。另外，消炎痛也能对小肠、结肠粘膜造成点、线状损伤，肠粘膜通透性的增高使肠道内细菌内毒素有机会进入体内诱生TNF-α。TNF-α是与炎症反应关系最为密切的前炎症细胞因子(proinflammatory cytokine)之一，预先使用IL-2、LPS或G-CSF、地塞米松、己酮可可碱等调节TNF-α的合成和释放能显著影响消炎痛损伤胃粘膜的能力[1]。本文实验结果也显示，消炎痛灌胃可引起血浆TNF-α性活呈剂量依赖性地升高，使用TNF-α单克隆抗体直接拮抗TNF-α在显著降低循环中TNF-α活性同时，能显著减轻消炎痛诱导的胃粘膜损伤，胃粘膜中性粒细胞浸润程度也下降，说明TNF-α参与了消炎痛诱导的胃粘膜损伤过程，并且与中性粒细胞浸润有关。
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在消炎痛诱导的胃粘膜损伤过程中，引发粘膜脂质过氧化的氧自由基除了来源于中性粒细胞外，还有另一个来源即NSAIDS抑制氧化磷酸化，产生一磷酸腺苷，后者激活黄嘌呤氧化通路(Xanthine Oxidase pathway)从而产生自由基[10]。另外，NSAIDs可减少前列腺素依赖的粘膜粘液分泌，而粘液是一种重要的自由基天然清除剂(scavenger)。故使用TNF-α单克隆抗体尽管能降低粘膜中性粒细胞浸润程度，但粘膜脂质过氧化改善并不明显。
本实验所使用的TNF-α单克隆抗体是经杂交瘤技术从BALB/c小鼠腹水中提取纯化的。实验证明其对天然及重组TNF-α具有一定细胞毒中和能力和亲和力。亲和力表示抗原抗体结合的紧密程度，本文采用ABC-ELISA所测得的是相对亲和力，本方法与其它方法比较具有简便、迅速、可靠、不需标记抗原抗体，无放射性危害等优点。
参考文献
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(1998年2月15日收稿，1998年6月26日修回), http://www.100md.com