血管紧张素原基因M235T分子变异与先兆子痫关系的研究
作者：李克深 毛东伟 孙延芝 陈黎明 王孝铭
单位：李克深 毛东伟 孙延芝 陈黎明:中国人民解放军第211医院(哈尔滨 150080)；王孝铭:哈尔滨医科大学病理生理教研室
关键词：
血管紧张素原基因M235T分子变异与先兆子痫关系的研究
先兆子痫即重度妊娠高血压综合症，是孕产妇死亡的重要原因之一，近年来，国外很多学者认为妊高症与血管活性物质调节失常有关。研究表明，血管紧张素Ⅱ水平的升高能导致蜕膜组织中螺旋动脉的纤维样坏死，因此血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)基因与先兆子痫的关系日益引起人们的重视。AGT基因位于染色体1q42-43处，国外的研究认为，AGT基因外显子2的704位碱基胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)置换(导致编码产物第235号氨基酸由蛋氨酸M变异为苏氨酸T)可使原发性高血压、冠心病和先兆子痫的发病风险增加。我们的研究旨在探讨血管紧张素原基因M235T分子变异与先兆子痫发生的关系。
, http://www.100md.com
对象与方法
一、研究对象：
先兆子痫组共58例，年龄22～37岁，平均27.6岁，孕周28～40周，平均35周。均按郑怀美主编的全国统一教材《妇产科学》提出的标准筛选。正常妊娠组共90例，均为随机选取的与严重先兆子痫组同期分娩的正常健康孕妇。
二、研究方法：
(一)人基因组DNA的抽提：抽取外周静脉血3～5 mL，肝素抗凝，用常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。
(二)聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)检测：PCR引物：P1：5’-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3’和P2：5’-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3’。反应体系为50 μL，包括基因组DNA 500 ng，P1和P2各60 pmol, Taq DNA聚合酶(Promega 1 U/μL)1.5 μL，dNTP 1.5 μL(2.5 mol/L)，10×Buffer 5 μL。反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，68℃退火50 s，72℃延伸50 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min，应用PE 2400型基因扩增仪。取PCR产物4 μL，加8 UTth 111 Ⅰ限制性内切酶，s10×Buffer 2 μL，ddH2O 13 μL，65℃水浴消化4 h。取消化后产物10 μL于4% nusieve 3:1胶(FMC，Rockland, Me.)上进行分离，120 V 1 h。EB染色照相。
, 百拇医药
结 果
由于AGT基因704位点T被C置换后可产生一个Tth 111 Ⅰ限制性酶切位点，因此应用PCR-RFLP方法可将3种基因型分开。纯合子235 MM由于无酶切位点，故只显示1条163 bp扩增片段；纯合子235 TT只显示1条140 bp片段；杂合子235 TM同时具有163 bp、140 bp两种片段。
在58例先兆子痫患者中235 TT基因型为36例，占62.07%，而90例对照组中235 TT基因型40例，占44.44%，二者间差异显著(χ2=4.39,P<0.05)。先兆子痫组中T235等位基因频率(0.76)亦显著高于对照组(0.64)(χ2=4.69,P<0.05)，见表1。
表1 先兆子痫组和对照组中AGT基因M235T基因型频率与等位基因频率的分布
, 百拇医药 Tab 1 Genotype and allelic distribution of M235T in the AGT gene in patients with preeclampsia and controls
n
No (frequency) of genotype
No (frequency) of allele
MM
MT
TT
M
T
Preeclampsia
, 百拇医药
58
6
16
36
28
88
(10.34%)
(27.59%)
(62.07%)
(24.14%)
(75.86)
Control
90
, 百拇医药
15
35
40
65
115
(16.67%)
(38.89%)
(44.44%)
36.11%)
(63.89%)
讨 论
AGT基因位于染色体1 q 42-43处，编码区由5个外显子和4个内含子构成。文献报道AGT基因存在多种分子变异，其中一种(M235T)位于外显子2核苷酸704处，胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)所代替，导致编码产物第235号氨基酸由蛋氨酸(M)变异为苏氨酸(T)。国外的研究认为这种变异与高加索人种和日本人的原发性高血压、冠心病、心肌梗塞和先兆子痫的发生有关。现已证明，AGT基因的T235变异与AGT基因启动子中的一个突变紧密连锁，这个突变能导致AGT表达量的升高，动物模型中升高的血管紧张肽可导致动脉的纤维样坏死。Biggs等的研究也证实了这一点，他们观察了53例先兆子痫孕妇的组织切片，21例出现螺旋动脉纤维样坏死的孕妇中，11例为235TT纯合基因型，占52.38%；而32例未出现螺旋动脉纤维样坏死的孕妇中，只有5例为235TT纯合基因型，占15.63%。在我们的研究中58例先兆子痫患者中235TT基因型为36例，占62.07%，显著高于对照组(40例，44.44%)；先兆子痫组中T235等位基因频率(0.76)亦显著高于对照组(0.64)。本研究的结果表明，AGT基因M235T分子变异可能是先兆子痫的一个遗传风险因素。 (1999年4月5日收稿，1999年6月17日修回), 百拇医药
单位：李克深 毛东伟 孙延芝 陈黎明:中国人民解放军第211医院(哈尔滨 150080)；王孝铭:哈尔滨医科大学病理生理教研室
关键词：
血管紧张素原基因M235T分子变异与先兆子痫关系的研究
先兆子痫即重度妊娠高血压综合症，是孕产妇死亡的重要原因之一，近年来，国外很多学者认为妊高症与血管活性物质调节失常有关。研究表明，血管紧张素Ⅱ水平的升高能导致蜕膜组织中螺旋动脉的纤维样坏死，因此血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)基因与先兆子痫的关系日益引起人们的重视。AGT基因位于染色体1q42-43处，国外的研究认为，AGT基因外显子2的704位碱基胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)置换(导致编码产物第235号氨基酸由蛋氨酸M变异为苏氨酸T)可使原发性高血压、冠心病和先兆子痫的发病风险增加。我们的研究旨在探讨血管紧张素原基因M235T分子变异与先兆子痫发生的关系。
, http://www.100md.com
对象与方法
一、研究对象：
先兆子痫组共58例，年龄22～37岁，平均27.6岁，孕周28～40周，平均35周。均按郑怀美主编的全国统一教材《妇产科学》提出的标准筛选。正常妊娠组共90例，均为随机选取的与严重先兆子痫组同期分娩的正常健康孕妇。
二、研究方法：
(一)人基因组DNA的抽提：抽取外周静脉血3～5 mL，肝素抗凝，用常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。
(二)聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)检测：PCR引物：P1：5’-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3’和P2：5’-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3’。反应体系为50 μL，包括基因组DNA 500 ng，P1和P2各60 pmol, Taq DNA聚合酶(Promega 1 U/μL)1.5 μL，dNTP 1.5 μL(2.5 mol/L)，10×Buffer 5 μL。反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，68℃退火50 s，72℃延伸50 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min，应用PE 2400型基因扩增仪。取PCR产物4 μL，加8 UTth 111 Ⅰ限制性内切酶，s10×Buffer 2 μL，ddH2O 13 μL，65℃水浴消化4 h。取消化后产物10 μL于4% nusieve 3:1胶(FMC，Rockland, Me.)上进行分离，120 V 1 h。EB染色照相。
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结 果
由于AGT基因704位点T被C置换后可产生一个Tth 111 Ⅰ限制性酶切位点，因此应用PCR-RFLP方法可将3种基因型分开。纯合子235 MM由于无酶切位点，故只显示1条163 bp扩增片段；纯合子235 TT只显示1条140 bp片段；杂合子235 TM同时具有163 bp、140 bp两种片段。
在58例先兆子痫患者中235 TT基因型为36例，占62.07%，而90例对照组中235 TT基因型40例，占44.44%，二者间差异显著(χ2=4.39,P<0.05)。先兆子痫组中T235等位基因频率(0.76)亦显著高于对照组(0.64)(χ2=4.69,P<0.05)，见表1。
表1 先兆子痫组和对照组中AGT基因M235T基因型频率与等位基因频率的分布
, 百拇医药 Tab 1 Genotype and allelic distribution of M235T in the AGT gene in patients with preeclampsia and controls
n
No (frequency) of genotype
No (frequency) of allele
MM
MT
TT
M
T
Preeclampsia
, 百拇医药
58
6
16
36
28
88
(10.34%)
(27.59%)
(62.07%)
(24.14%)
(75.86)
Control
90
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15
35
40
65
115
(16.67%)
(38.89%)
(44.44%)
36.11%)
(63.89%)
讨 论
AGT基因位于染色体1 q 42-43处，编码区由5个外显子和4个内含子构成。文献报道AGT基因存在多种分子变异，其中一种(M235T)位于外显子2核苷酸704处，胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)所代替，导致编码产物第235号氨基酸由蛋氨酸(M)变异为苏氨酸(T)。国外的研究认为这种变异与高加索人种和日本人的原发性高血压、冠心病、心肌梗塞和先兆子痫的发生有关。现已证明，AGT基因的T235变异与AGT基因启动子中的一个突变紧密连锁，这个突变能导致AGT表达量的升高，动物模型中升高的血管紧张肽可导致动脉的纤维样坏死。Biggs等的研究也证实了这一点，他们观察了53例先兆子痫孕妇的组织切片，21例出现螺旋动脉纤维样坏死的孕妇中，11例为235TT纯合基因型，占52.38%；而32例未出现螺旋动脉纤维样坏死的孕妇中，只有5例为235TT纯合基因型，占15.63%。在我们的研究中58例先兆子痫患者中235TT基因型为36例，占62.07%，显著高于对照组(40例，44.44%)；先兆子痫组中T235等位基因频率(0.76)亦显著高于对照组(0.64)。本研究的结果表明，AGT基因M235T分子变异可能是先兆子痫的一个遗传风险因素。 (1999年4月5日收稿，1999年6月17日修回), 百拇医药