全脑缺血再灌注大鼠血液中血小板激活因子测定研究
作者：谢景文 王荣 张新江 胡晓丽 李爱萍
单位：谢景文(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；王荣(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；张新江(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；胡晓丽(解放军医学高等专科学校，甘肃 兰州 730020)；李爱萍(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
关键词：脑缺血；再灌注；血小板激活因子；大鼠
西北国防医学杂志000324 摘要：目的：研究血小板激活因子(PAF)在急性脑缺血过程中的作用。方法：用高效薄层层析法测定大鼠全脑缺血后再灌注1、3、6、72 h时血液中PAF的含量。结果：再灌注后3 h血液PAF较对照组明显升高(1.61±0.56 μg.L-1和1.05±0.31 μg.L-1，P<0.05)，6 h时达高峰(1.90±0.61 μg.L-1，P<0.01)，72 h时仍高于正常(1.46±0.31 μg.L-1，P<0.05)。结论：PAF在脑缺血再灌注的病理生理过程中起一定作用。
, http://www.100md.com
中图分类号：R 651.1 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)03-0221-02
Study on measuring of blood platelet activating factor concentration in rats after complet cerebral ischemia and reperfusion
XIE Jing-wen,WANG Rong,ZHANG Xin-jiang,et al.
(Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Objective:To determine the changes of platelet activating factor(PAF) in rats after complete cerebral ischemia and reperfusion.Methods:After given complete cerebral ischemia for 10 min and reperfused for 1,3,6 and 72 h(n＝6，respectively),rats were killed and their blood PAF concentrations were measured with high performance thin-layer chromatography.Results:3h after reperfusion,rats'blood PAF concentration was significantly higher than that of controls (1.61±0.56 μg.L-1vs 1.05±0.31 μg.L-1，P<0.05)，After 6h,PAF concentration reached the highest (1.90±0.61 μg.L-1，P<0.01),and after 72 h,it was still higher than controls，too (1.46±0.31 μg.L-1，P<0.05).Conclusion:PAF may play certain role in the pathologic process of cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words:Cerebral ischemia； Reperfusion； Platelet activating factor(PAF)； Rat
近年来血小板激活因子(PAF)与脑缺血的关系受到重视[1，2]。文献[3]曾对蛛网膜下腔出血患者脑脊液中的PAF进行了测定，其结果有较重要的临床指导意义。鉴于PAF与脑缺血的关系及文献[5]所建立的方法，本文运用高效薄层扫描法(HPTLC)对大鼠全脑缺血性脑卒中的血液PAF含量进行了测定研究，目的在于阐明缺血性脑卒中的某些病理机制。
1 材料和方法
1.1 动物：30只雄性Wistar大鼠购自兰州医学院动物实验中心，体重250～300 g，随机分为缺血后再灌注1、3、6、72 h和假手术组，每组各6只。
, 百拇医药
1.2 动物模型及标本处理：按Pulsinell[4]法制成全脑缺血模型，用硫喷妥钠50 mg.kg-1体重腹腔注射麻醉，烧灼双侧椎动脉后颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，置线备用。次日，在动物清醒状态下夹闭双侧颈总动脉10 min，假手术组不烧闭双侧椎动脉，不夹闭双侧颈总动脉。分别在不同时期断头取血，EDTA-2Na抗凝，立即吸2 ml血液，注入已盛有10 ml甲醇溶液的小瓶内，振摇，离心后取上清液，按Bligh-Dye法萃取。取氯仿相密封后-30℃冻存，将剩余的3 ml血液离心，取血浆-30℃冻存。
1.3 仪器药品：CS-920型薄层扫描仪：日本岛津U-135C型岛津积分仪；PAF标准对照品购自美国Sigma公司；高效硅胶G板：青岛海洋化工厂；其余试剂均为分析纯。
1.4 色谱条件：高效硅胶G板；展开剂：氯仿-甲醇-水(65∶35∶6)，摇匀，放置过夜，下层液展开；显色剂：10%磷钼酸溶液，展开距10 cm；扫描波长630 nm；点样3 μl，测定峰面积，PAF的Rf值为0.23～0.26。
, 百拇医药
1.5 检测方法：将萃取后的氯仿标本用真空抽干，再用氯仿溶解，高效板点样，同板有PAF标准品同行，测定峰面积，在标准品工作曲线上查得样品PAF含量。
1.6 色谱方法
1.6.1 标准曲线：于同一块高效板上，用PAF标准对照品点样6个点，求得其回归方程为Y＝0.294C+406.000，相关系数r＝0.9990，最小测得浓度50 ng.L-1。
1.6.2 方法精密度及回收率：在同一块高效板上，点同一浓度，同样体积的PAF标准对照品，共6个点，按上述方法展开，显色，扫描，测定其日内(每隔0.5 小时)、日间误差。回收率是在同一块高效板上，分别点上一定的量的血液提取液及标准对照品，按上述方法展开，显色，扫描，计算PAF的量，测得回收率为98.7%(n＝5)。从结果可知该方法精密度好，说明扫描仪和点样等操作基本可保持较好的精密度和良好的重复性，日内误差为1.94%，日间误差为2.03%。该方法回收率高，平均回收率98.7%。
, 百拇医药
1.6.3 稳定性试验：PAF稳定性试验包括：一部分是PAF从血液中提取后在冰箱中-30℃冷冻保存不同时间的稳定性，分别于1 d、5 d、10 d、30 d取出按试验方法测定3份，RSD为3.4%，表明PAF样品在-30℃下至少可保存一个月。另一部分是PAF提取液配制成氯仿溶液后放置不同时间的稳定性。将上述保存于-30℃冰箱下的血液提取液配置成氯仿溶液，容量瓶密封放置于室温，分别于立即、2 d、5 d点样，RSD为2.3%，说明配制成氯仿的PAF溶液可在5 d内稳定密封存放于室温。
1.7 统计学方法：方差分析[5]和卡方检验。
2 结果
按上述色谱条件进行样品测定，计算大鼠血液中的PAF含量，结果见图1。
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图1 全脑缺血大鼠血液中PAF的动态变化
3 讨论
3.1 本文研究结果发现(见图1)，全脑缺血再灌注后3 h PAF的含量为1.61±0.56 μg.L-1，6 h时达到高峰1.90±0.61 μg.L-1，但较3 h时无明显差异(P<0.05)，72 h时仍高于正常时大鼠血液中PAF含量(1.46±0.31 μg.L-1和1.05±0.31 μg.L-1，P<0.05)。本文研究表明PAF与脑缺血再灌注的病理和生理过程有关。
3.2 基础研究表明，神经细胞、血管内皮细胞、血小板及中性白细胞等在缺氧、钙离子、白介素的刺激作用下均可释放PAF。文献表明[6]脑缺血大鼠组织内PAF的变化较为短暂，表明缺血早期血液中PAF可能来自于缺血的神经元。脑缺血后血脑屏障破坏，脑组织内PAF进入血液可能是脑缺血再灌注早期血液PAF含量升高的主要原因。脑缺血时产生大量PAF的机制尚不清楚，可能与磷脂酶A2的激活、大量花氢四烯酸的形成、PAF乙酰转移酶的激活有关。本文研究发现1、3、6、72 h时PAF含量高于正常，其结果与文献报道一致，与测定脑梗塞患者血液PAF的含量一致，可能是缺血早期血液中PAF来自缺血的神经元；脑缺血后血脑屏障破坏，脑组织内PAF进入血液。从而可以解释引起脑缺血再灌注早期血液PAF含量升高的原因。同时实验结果与临床观察脑梗塞患者症状相吻合。有关机理有待于进一步研究。
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作者简介：谢景文(1945—)，男，主任药师
参考文献：
[1]姜建东，杨春水，综述.中枢神经系统PAF的实验临床研究[J].国外医学神经病学.神经外科学分册，1994，21(4)：68-70.
[2]Nishida K,Markey SP.Platelet-activating factor in brain regions after transcent ischema in gerbils[J].Stroke,1996,27:514-516.
[3]王 荣，张新江，胡晓丽，等.高效薄层扫描法(HPTLC)定量分析蛛网膜下腔出血(SAH)患者脑脊液中PAF含量[J].药物分析杂志，1998，18(增刊)：278-279.
[4]Pulsinelli WA,Brierley JB,Plum F.Temporal profile of neuronal damage in a model of transient for brain ischemia[J].Ann Nerval,1982，11：491-493.
[5]刘 金，金泊泉，董邦权，等.6株抗RH IL-8单克隆抗体识别表位的鉴定及双单克隆抗体夹心法ELISA检测IL-8方法的建立[J].中国免疫学杂志，1994，10(5)：131-133.
[6]Sator KI,Maizumi T,Troshida H,et al.Increased levels of blood PAF and PAF-like lipids in-patients with ischemic stroke[J].Acta Nerval Scan,1992,85:122-124.
收稿日期：1999-10-12 修回：2000-03-20, http://www.100md.com
单位：谢景文(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；王荣(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；张新江(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；胡晓丽(解放军医学高等专科学校，甘肃 兰州 730020)；李爱萍(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
关键词：脑缺血；再灌注；血小板激活因子；大鼠
西北国防医学杂志000324 摘要：目的：研究血小板激活因子(PAF)在急性脑缺血过程中的作用。方法：用高效薄层层析法测定大鼠全脑缺血后再灌注1、3、6、72 h时血液中PAF的含量。结果：再灌注后3 h血液PAF较对照组明显升高(1.61±0.56 μg.L-1和1.05±0.31 μg.L-1，P<0.05)，6 h时达高峰(1.90±0.61 μg.L-1，P<0.01)，72 h时仍高于正常(1.46±0.31 μg.L-1，P<0.05)。结论：PAF在脑缺血再灌注的病理生理过程中起一定作用。
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中图分类号：R 651.1 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)03-0221-02
Study on measuring of blood platelet activating factor concentration in rats after complet cerebral ischemia and reperfusion
XIE Jing-wen,WANG Rong,ZHANG Xin-jiang,et al.
(Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Objective:To determine the changes of platelet activating factor(PAF) in rats after complete cerebral ischemia and reperfusion.Methods:After given complete cerebral ischemia for 10 min and reperfused for 1,3,6 and 72 h(n＝6，respectively),rats were killed and their blood PAF concentrations were measured with high performance thin-layer chromatography.Results:3h after reperfusion,rats'blood PAF concentration was significantly higher than that of controls (1.61±0.56 μg.L-1vs 1.05±0.31 μg.L-1，P<0.05)，After 6h,PAF concentration reached the highest (1.90±0.61 μg.L-1，P<0.01),and after 72 h,it was still higher than controls，too (1.46±0.31 μg.L-1，P<0.05).Conclusion:PAF may play certain role in the pathologic process of cerebral ischemia.
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Key words:Cerebral ischemia； Reperfusion； Platelet activating factor(PAF)； Rat
近年来血小板激活因子(PAF)与脑缺血的关系受到重视[1，2]。文献[3]曾对蛛网膜下腔出血患者脑脊液中的PAF进行了测定，其结果有较重要的临床指导意义。鉴于PAF与脑缺血的关系及文献[5]所建立的方法，本文运用高效薄层扫描法(HPTLC)对大鼠全脑缺血性脑卒中的血液PAF含量进行了测定研究，目的在于阐明缺血性脑卒中的某些病理机制。
1 材料和方法
1.1 动物：30只雄性Wistar大鼠购自兰州医学院动物实验中心，体重250～300 g，随机分为缺血后再灌注1、3、6、72 h和假手术组，每组各6只。
, 百拇医药
1.2 动物模型及标本处理：按Pulsinell[4]法制成全脑缺血模型，用硫喷妥钠50 mg.kg-1体重腹腔注射麻醉，烧灼双侧椎动脉后颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，置线备用。次日，在动物清醒状态下夹闭双侧颈总动脉10 min，假手术组不烧闭双侧椎动脉，不夹闭双侧颈总动脉。分别在不同时期断头取血，EDTA-2Na抗凝，立即吸2 ml血液，注入已盛有10 ml甲醇溶液的小瓶内，振摇，离心后取上清液，按Bligh-Dye法萃取。取氯仿相密封后-30℃冻存，将剩余的3 ml血液离心，取血浆-30℃冻存。
1.3 仪器药品：CS-920型薄层扫描仪：日本岛津U-135C型岛津积分仪；PAF标准对照品购自美国Sigma公司；高效硅胶G板：青岛海洋化工厂；其余试剂均为分析纯。
1.4 色谱条件：高效硅胶G板；展开剂：氯仿-甲醇-水(65∶35∶6)，摇匀，放置过夜，下层液展开；显色剂：10%磷钼酸溶液，展开距10 cm；扫描波长630 nm；点样3 μl，测定峰面积，PAF的Rf值为0.23～0.26。
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1.5 检测方法：将萃取后的氯仿标本用真空抽干，再用氯仿溶解，高效板点样，同板有PAF标准品同行，测定峰面积，在标准品工作曲线上查得样品PAF含量。
1.6 色谱方法
1.6.1 标准曲线：于同一块高效板上，用PAF标准对照品点样6个点，求得其回归方程为Y＝0.294C+406.000，相关系数r＝0.9990，最小测得浓度50 ng.L-1。
1.6.2 方法精密度及回收率：在同一块高效板上，点同一浓度，同样体积的PAF标准对照品，共6个点，按上述方法展开，显色，扫描，测定其日内(每隔0.5 小时)、日间误差。回收率是在同一块高效板上，分别点上一定的量的血液提取液及标准对照品，按上述方法展开，显色，扫描，计算PAF的量，测得回收率为98.7%(n＝5)。从结果可知该方法精密度好，说明扫描仪和点样等操作基本可保持较好的精密度和良好的重复性，日内误差为1.94%，日间误差为2.03%。该方法回收率高，平均回收率98.7%。
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1.6.3 稳定性试验：PAF稳定性试验包括：一部分是PAF从血液中提取后在冰箱中-30℃冷冻保存不同时间的稳定性，分别于1 d、5 d、10 d、30 d取出按试验方法测定3份，RSD为3.4%，表明PAF样品在-30℃下至少可保存一个月。另一部分是PAF提取液配制成氯仿溶液后放置不同时间的稳定性。将上述保存于-30℃冰箱下的血液提取液配置成氯仿溶液，容量瓶密封放置于室温，分别于立即、2 d、5 d点样，RSD为2.3%，说明配制成氯仿的PAF溶液可在5 d内稳定密封存放于室温。
1.7 统计学方法：方差分析[5]和卡方检验。
2 结果
按上述色谱条件进行样品测定，计算大鼠血液中的PAF含量，结果见图1。
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图1 全脑缺血大鼠血液中PAF的动态变化
3 讨论
3.1 本文研究结果发现(见图1)，全脑缺血再灌注后3 h PAF的含量为1.61±0.56 μg.L-1，6 h时达到高峰1.90±0.61 μg.L-1，但较3 h时无明显差异(P<0.05)，72 h时仍高于正常时大鼠血液中PAF含量(1.46±0.31 μg.L-1和1.05±0.31 μg.L-1，P<0.05)。本文研究表明PAF与脑缺血再灌注的病理和生理过程有关。
3.2 基础研究表明，神经细胞、血管内皮细胞、血小板及中性白细胞等在缺氧、钙离子、白介素的刺激作用下均可释放PAF。文献表明[6]脑缺血大鼠组织内PAF的变化较为短暂，表明缺血早期血液中PAF可能来自于缺血的神经元。脑缺血后血脑屏障破坏，脑组织内PAF进入血液可能是脑缺血再灌注早期血液PAF含量升高的主要原因。脑缺血时产生大量PAF的机制尚不清楚，可能与磷脂酶A2的激活、大量花氢四烯酸的形成、PAF乙酰转移酶的激活有关。本文研究发现1、3、6、72 h时PAF含量高于正常，其结果与文献报道一致，与测定脑梗塞患者血液PAF的含量一致，可能是缺血早期血液中PAF来自缺血的神经元；脑缺血后血脑屏障破坏，脑组织内PAF进入血液。从而可以解释引起脑缺血再灌注早期血液PAF含量升高的原因。同时实验结果与临床观察脑梗塞患者症状相吻合。有关机理有待于进一步研究。
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作者简介：谢景文(1945—)，男，主任药师
参考文献：
[1]姜建东，杨春水，综述.中枢神经系统PAF的实验临床研究[J].国外医学神经病学.神经外科学分册，1994，21(4)：68-70.
[2]Nishida K,Markey SP.Platelet-activating factor in brain regions after transcent ischema in gerbils[J].Stroke,1996,27:514-516.
[3]王 荣，张新江，胡晓丽，等.高效薄层扫描法(HPTLC)定量分析蛛网膜下腔出血(SAH)患者脑脊液中PAF含量[J].药物分析杂志，1998，18(增刊)：278-279.
[4]Pulsinelli WA,Brierley JB,Plum F.Temporal profile of neuronal damage in a model of transient for brain ischemia[J].Ann Nerval,1982，11：491-493.
[5]刘 金，金泊泉，董邦权，等.6株抗RH IL-8单克隆抗体识别表位的鉴定及双单克隆抗体夹心法ELISA检测IL-8方法的建立[J].中国免疫学杂志，1994，10(5)：131-133.
[6]Sator KI,Maizumi T,Troshida H,et al.Increased levels of blood PAF and PAF-like lipids in-patients with ischemic stroke[J].Acta Nerval Scan,1992,85:122-124.
收稿日期：1999-10-12 修回：2000-03-20, http://www.100md.com