高效毛细管电泳法用于不同居群大青叶药材的鉴别
作者：王寅 乔传卓 尹茶
单位：第二军医大学药学院 上海 200433
关键词：高效毛细管电泳法；大青叶；鉴别
中草药000737摘 要 以高效毛细管电泳法对不同居群大青叶药材的理化特征差异进 行研究，结果表明异地栽培的不同居群大青叶药材酸性提取部位的化学成分及含量有显著差 别，依据电泳图谱中特征峰的迁移时间和峰面积，能有效地鉴别不同居群大青叶药材。
Distinguishing Isatis indigotica from Diffevent Medicinal Herbs of Different Habitat by HPCE
Wang Yin
(School of Pharmacy, Second Military Medical University Shanghai 200433)
, http://www.100md.com
Qiao Chuanzhuo
(School of Pharmacy, Second Military Medical University Shanghai 200433)
Yin Cha
(School of Pharmacy, Second Military Medical University Shanghai 200433)
Abstract The physical and chemical features of Isati s indigotica Fortune from different habitat were characterized with HPCE . The results showed that their acid extract portions varies considerably in chemi cal compositions. Thus, with migration time and area of characteristic peak in t he capillary electrophorogram, I. indigotica from different habi tat could be distinguished.
, 百拇医药
Key words HPCE Isatis indigotica id entification of medicinal material
大青叶是常用中药材，其性味苦寒，具清热解毒、凉血消斑的功效，《中华 人民共和国药典》1995年版(一部)规定其植物来源为十字花科菘蓝Isatis indigot ica Fort.的干燥叶[1]。菘蓝在全国各地广泛栽种，种内变异和生态环境 的差异导致不同居群大青叶药材的品质有显著差别[2，3]。为探讨菘蓝种质资源因 素对大青叶药材质量的影响，将各地不同居群大青叶移栽于上海市崇明岛同一块试验田，考 察在相同生态环境下不同居群大青叶药材在药理作用及活性成分含量上的差异，并依据理化 及性状特征对其进行鉴别研究。
由于同种植物药材的形态性状区别不明显，内部组织构造特征也非常相似，加之在采收加工 后，药材均呈皱缩卷曲状，有的还破碎不完整，依据常规的药材性状特征及显微特征对不同 居群大青叶药材均难以鉴别。
, http://www.100md.com
文献报道从菘蓝中分离的几种酸性成分具有体外抗内毒素活性[4]，能较好地反映 药材清热解毒功效。通过比较测定不同居群大青叶酸性提取部位的化学成分及其含量，可对 药材质量作出评判。
高效毛细管电泳法(HPCE)，具有高效、快速、低耗、样品预处理简单、操作简便等优点 [5]。以药材化学成分的HPCE特征性指纹图谱作为依据鉴别中药材已有报道[6 ，7]，其结果与传统的扫描电镜和显微鉴别的结果一致。
本研究采用HPCE中常用的毛细管区带电泳(CZE)分离模式，以大青叶药材的酸性提取部位为 分析对象，对异地栽培的不同居群大青叶进行鉴别研究。
1 仪器和材料
Water Capillary Ion Analyzer, 熔融石英毛细管柱 60 cm×75 μm (河北永年光导纤维厂 )，所用试剂均为分析纯。异地栽培的不同居群大青叶药材，经作者鉴定为Isatis indigotica Fort., 见表1。
, 百拇医药
表1 不同居群大青叶的HPCE图谱数据 样品来源
出峰数
各峰的相对迁移时间(相对峰面积)
安徽阜阳
2
1.157(0.331)，2.682(5 .503)
安徽亳州
2
1.155(0.248)，2.769(8.010)
安徽泗县
3
, http://www.100md.com
1.179(0.182)，1.945(0.354)，2.500(3.084)
安徽临泉
2
1.160(0.286)，2.834(4.064)
江苏射阳
2
1.203(0.308)，2.910(2.967)
江苏泰兴
1
1.188(0.390)
河南禹州
, http://www.100md.com
5
1.159(0.070)，1.189(0.089)，1.396(0.078)，1.698(0 .187)，2.543(3.020)
山西太谷
6
1.146(0.449)，1.174(0.199)，1.581(0.640)，1.67 1(0.589)，1.821(0.482)，2.482(3.084)
陕西咸阳
8
1.161(0.176)，1.169(0.057)，1. 191(0.024)，1.614(0.253)，1.713(0.271)，1.984(0.293)，2.570(2.770)，2. 648(0.369)
, 百拇医药
内蒙赤峰
5
1.152(0.516)，1.696(0.691)，1.853(0.341)，2. 553(3.602)，2.636(0.992)
河北邢台
5
1.151(0.354)，1.181(0.164)，1.688(0.596)，2.383(0 .924)，2.508(2，179)
河北安国
5
1.103(0.095)，1.157(0.227)，1.185(0.129)，2.385(0 .629)，2.524(4.114)
, 百拇医药
辽宁沈阳
3
1.175(0.109)，1.475(0.138)，2.477(2.237)
2 方法
2.1 样品处理：将大青叶药材烘干，粉碎，过 60 目筛，称取 10 g，加 100 mL 70% 的 乙醇液，超声提取 1 h，过滤，加少量蒸馏水，回收乙醇至无醇味；以 1 mol/L HCl 调 pH 值为1， 以乙醚萃取多次，合并乙醚液，以无水 Na2SO4 脱水，过滤，回收乙醚，残 留物以甲醇溶解并定容至 10 mL 进样。
2.2 电泳工作条件：对 pH 值、工作电压、缓冲液离子强度、改性剂等影响因素进行了考 察：发现 pH 值小时，各组分峰重叠， pH值过大，迁移时间延长；电压增加使迁移时间减 少，柱效提高，利于组分分离，过高则产生大量焦耳热，使柱效下降；适当提高缓冲液的离 子强度，利于组分的分离；并综合考虑分离度、分析时间等因素，确定了电泳工作条件：缓 冲液为 25 mmol/L Na2B4O7-NaOH (pH 9.3)，检测波长 214 nm，工作电压 22 kV， 温度 25 ℃，所有样品以压差法进样，10 cm，5 s。
, 百拇医药
2.3 方法考察：在确定的电泳工作条件下，对大青叶药材 HPCE 图谱中的定性定量指标( 迁移时间与峰面积)进行重现性和稳定性考察。对同一个大青叶样品重复进样 5 次，迁移时 间 RSD为 0.64%～2.16%，峰面积 RSD为0.34%～2. 76%；将大青叶样品液避光冷藏，分别在不同时间进样，3 d内电泳图谱无明显变化，迁移时 间 RSD 为0.94%～3.21%，峰面积 RSD 为1.25%～4 .04%。基本满足定性要求。
3 结果
不同居群大青叶药材的 HPCE 图谱见图1。以峰宽10 s，峰面积 1 000 为阈值，对各个峰进 行积分，以 4 min 处的峰为基准(tR=1.00，面积计为 1.00)，计算 其它峰的相对迁移时间及相对峰面积。各峰的相对迁移时间和相对峰面积数据见表1。
图1 异地栽培的不同居群大青叶酸性成分的
, 百拇医药
HPCE 图谱
从电泳图谱及 HPCE 数据表中可以看出，不同居群大青叶的酸性提取部位的化学成分及其含 量差别较大。
来源于安徽阜阳、亳州、临泉，河北安国的大青叶药材，相对迁移时间 tR 在 2.5～2. 8 min间的峰的相对面积值较大。以标准品进样确证此为邻氨基苯甲酸样品峰，邻氨基苯甲 酸在大青叶药材酸性提取部位中含量最高[2]，其含量与大青叶的抗内毒素活性有 较好的相关性。此处相对峰面积值较大表明药材中邻氨基苯甲酸含量较高，药理实验结果显 示其体外抗内毒素作用比其他来源的大青叶药材要强。原因可能是上述地区为菘蓝主产区， 栽培历史悠久，长期的人工选育致使品种改良的结果。
来源于江苏泰兴大青叶的电泳图谱与其他居群的明显不同，tR 在 2.5 ～2.8 min 间的峰面积值未达阈值，其相对峰面积不能计算，表明药材中邻氨基苯甲酸含 量偏低，药理实验也证实其体外抗内毒素作用较差。
, 百拇医药
根据 3.8～11.5 min 区间内的特征性图谱及这些峰的定性差数，可以有效地鉴别不同居 群大青叶。HPCE 法具有分辨力强、重现性好、速度快等特点，为大青药材的鉴定提供了一 种新方法。
高效毛细管电泳结果显示异地栽培的不同居群大青叶药材酸性提取部分的电泳图谱有显著差 异。因样品溶液配制过程相同，进样条件相同，保证了加入样品的浓度和体积的一致，故所 得电泳图谱的变化反映了大青叶不同居群间的化学成分及含量的差异。在相同生态环境中， 不同居群大青叶存在显著的化学变异，表明菘蓝种质资源因素对大青叶药材的品质具有重要 影响作用。
国家自然科学基金资助项目，编号 NSFC 39670878；上海市科委星火计划项目，编号 98XH02028
参考文献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典.一部.广州：广 东科技出版社，北京：化学工业出版社，1995：15
, 百拇医药
2，王 寅，尹 茶，乔传卓，等.第二军医大学学报，1999，20(6)：370
3，刘 盛，乔传卓.中草药，1999，30(5)：368
4，Wu X Y, Liu Y H, Sheng W Y, et al. Planta Med, 1997, 63:55
5，房杏春.中国药科大学学报，1991，22(4)：249
6，胡 平，罗国安，王如骥，等.药学学报，1997，32(7)：549
7，张朝晖，范国荣，徐国钧，等.中国中药杂志，1998，23(5)：259
(1999-11-04收稿), http://www.100md.com
单位：第二军医大学药学院 上海 200433
关键词：高效毛细管电泳法；大青叶；鉴别
中草药000737摘 要 以高效毛细管电泳法对不同居群大青叶药材的理化特征差异进 行研究，结果表明异地栽培的不同居群大青叶药材酸性提取部位的化学成分及含量有显著差 别，依据电泳图谱中特征峰的迁移时间和峰面积，能有效地鉴别不同居群大青叶药材。
Distinguishing Isatis indigotica from Diffevent Medicinal Herbs of Different Habitat by HPCE
Wang Yin
(School of Pharmacy, Second Military Medical University Shanghai 200433)
, http://www.100md.com
Qiao Chuanzhuo
(School of Pharmacy, Second Military Medical University Shanghai 200433)
Yin Cha
(School of Pharmacy, Second Military Medical University Shanghai 200433)
Abstract The physical and chemical features of Isati s indigotica Fortune from different habitat were characterized with HPCE . The results showed that their acid extract portions varies considerably in chemi cal compositions. Thus, with migration time and area of characteristic peak in t he capillary electrophorogram, I. indigotica from different habi tat could be distinguished.
, 百拇医药
Key words HPCE Isatis indigotica id entification of medicinal material
大青叶是常用中药材，其性味苦寒，具清热解毒、凉血消斑的功效，《中华 人民共和国药典》1995年版(一部)规定其植物来源为十字花科菘蓝Isatis indigot ica Fort.的干燥叶[1]。菘蓝在全国各地广泛栽种，种内变异和生态环境 的差异导致不同居群大青叶药材的品质有显著差别[2，3]。为探讨菘蓝种质资源因 素对大青叶药材质量的影响，将各地不同居群大青叶移栽于上海市崇明岛同一块试验田，考 察在相同生态环境下不同居群大青叶药材在药理作用及活性成分含量上的差异，并依据理化 及性状特征对其进行鉴别研究。
由于同种植物药材的形态性状区别不明显，内部组织构造特征也非常相似，加之在采收加工 后，药材均呈皱缩卷曲状，有的还破碎不完整，依据常规的药材性状特征及显微特征对不同 居群大青叶药材均难以鉴别。
, http://www.100md.com
文献报道从菘蓝中分离的几种酸性成分具有体外抗内毒素活性[4]，能较好地反映 药材清热解毒功效。通过比较测定不同居群大青叶酸性提取部位的化学成分及其含量，可对 药材质量作出评判。
高效毛细管电泳法(HPCE)，具有高效、快速、低耗、样品预处理简单、操作简便等优点 [5]。以药材化学成分的HPCE特征性指纹图谱作为依据鉴别中药材已有报道[6 ，7]，其结果与传统的扫描电镜和显微鉴别的结果一致。
本研究采用HPCE中常用的毛细管区带电泳(CZE)分离模式，以大青叶药材的酸性提取部位为 分析对象，对异地栽培的不同居群大青叶进行鉴别研究。
1 仪器和材料
Water Capillary Ion Analyzer, 熔融石英毛细管柱 60 cm×75 μm (河北永年光导纤维厂 )，所用试剂均为分析纯。异地栽培的不同居群大青叶药材，经作者鉴定为Isatis indigotica Fort., 见表1。
, 百拇医药
表1 不同居群大青叶的HPCE图谱数据 样品来源
出峰数
各峰的相对迁移时间(相对峰面积)
安徽阜阳
2
1.157(0.331)，2.682(5 .503)
安徽亳州
2
1.155(0.248)，2.769(8.010)
安徽泗县
3
, http://www.100md.com
1.179(0.182)，1.945(0.354)，2.500(3.084)
安徽临泉
2
1.160(0.286)，2.834(4.064)
江苏射阳
2
1.203(0.308)，2.910(2.967)
江苏泰兴
1
1.188(0.390)
河南禹州
, http://www.100md.com
5
1.159(0.070)，1.189(0.089)，1.396(0.078)，1.698(0 .187)，2.543(3.020)
山西太谷
6
1.146(0.449)，1.174(0.199)，1.581(0.640)，1.67 1(0.589)，1.821(0.482)，2.482(3.084)
陕西咸阳
8
1.161(0.176)，1.169(0.057)，1. 191(0.024)，1.614(0.253)，1.713(0.271)，1.984(0.293)，2.570(2.770)，2. 648(0.369)
, 百拇医药
内蒙赤峰
5
1.152(0.516)，1.696(0.691)，1.853(0.341)，2. 553(3.602)，2.636(0.992)
河北邢台
5
1.151(0.354)，1.181(0.164)，1.688(0.596)，2.383(0 .924)，2.508(2，179)
河北安国
5
1.103(0.095)，1.157(0.227)，1.185(0.129)，2.385(0 .629)，2.524(4.114)
, 百拇医药
辽宁沈阳
3
1.175(0.109)，1.475(0.138)，2.477(2.237)
2 方法
2.1 样品处理：将大青叶药材烘干，粉碎，过 60 目筛，称取 10 g，加 100 mL 70% 的 乙醇液，超声提取 1 h，过滤，加少量蒸馏水，回收乙醇至无醇味；以 1 mol/L HCl 调 pH 值为1， 以乙醚萃取多次，合并乙醚液，以无水 Na2SO4 脱水，过滤，回收乙醚，残 留物以甲醇溶解并定容至 10 mL 进样。
2.2 电泳工作条件：对 pH 值、工作电压、缓冲液离子强度、改性剂等影响因素进行了考 察：发现 pH 值小时，各组分峰重叠， pH值过大，迁移时间延长；电压增加使迁移时间减 少，柱效提高，利于组分分离，过高则产生大量焦耳热，使柱效下降；适当提高缓冲液的离 子强度，利于组分的分离；并综合考虑分离度、分析时间等因素，确定了电泳工作条件：缓 冲液为 25 mmol/L Na2B4O7-NaOH (pH 9.3)，检测波长 214 nm，工作电压 22 kV， 温度 25 ℃，所有样品以压差法进样，10 cm，5 s。
, 百拇医药
2.3 方法考察：在确定的电泳工作条件下，对大青叶药材 HPCE 图谱中的定性定量指标( 迁移时间与峰面积)进行重现性和稳定性考察。对同一个大青叶样品重复进样 5 次，迁移时 间 RSD为 0.64%～2.16%，峰面积 RSD为0.34%～2. 76%；将大青叶样品液避光冷藏，分别在不同时间进样，3 d内电泳图谱无明显变化，迁移时 间 RSD 为0.94%～3.21%，峰面积 RSD 为1.25%～4 .04%。基本满足定性要求。
3 结果
不同居群大青叶药材的 HPCE 图谱见图1。以峰宽10 s，峰面积 1 000 为阈值，对各个峰进 行积分，以 4 min 处的峰为基准(tR=1.00，面积计为 1.00)，计算 其它峰的相对迁移时间及相对峰面积。各峰的相对迁移时间和相对峰面积数据见表1。
图1 异地栽培的不同居群大青叶酸性成分的, 百拇医药
HPCE 图谱
从电泳图谱及 HPCE 数据表中可以看出，不同居群大青叶的酸性提取部位的化学成分及其含 量差别较大。
来源于安徽阜阳、亳州、临泉，河北安国的大青叶药材，相对迁移时间 tR 在 2.5～2. 8 min间的峰的相对面积值较大。以标准品进样确证此为邻氨基苯甲酸样品峰，邻氨基苯甲 酸在大青叶药材酸性提取部位中含量最高[2]，其含量与大青叶的抗内毒素活性有 较好的相关性。此处相对峰面积值较大表明药材中邻氨基苯甲酸含量较高，药理实验结果显 示其体外抗内毒素作用比其他来源的大青叶药材要强。原因可能是上述地区为菘蓝主产区， 栽培历史悠久，长期的人工选育致使品种改良的结果。
来源于江苏泰兴大青叶的电泳图谱与其他居群的明显不同，tR 在 2.5 ～2.8 min 间的峰面积值未达阈值，其相对峰面积不能计算，表明药材中邻氨基苯甲酸含 量偏低，药理实验也证实其体外抗内毒素作用较差。
, 百拇医药
根据 3.8～11.5 min 区间内的特征性图谱及这些峰的定性差数，可以有效地鉴别不同居 群大青叶。HPCE 法具有分辨力强、重现性好、速度快等特点，为大青药材的鉴定提供了一 种新方法。
高效毛细管电泳结果显示异地栽培的不同居群大青叶药材酸性提取部分的电泳图谱有显著差 异。因样品溶液配制过程相同，进样条件相同，保证了加入样品的浓度和体积的一致，故所 得电泳图谱的变化反映了大青叶不同居群间的化学成分及含量的差异。在相同生态环境中， 不同居群大青叶存在显著的化学变异，表明菘蓝种质资源因素对大青叶药材的品质具有重要 影响作用。
国家自然科学基金资助项目，编号 NSFC 39670878；上海市科委星火计划项目，编号 98XH02028
参考文献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典.一部.广州：广 东科技出版社，北京：化学工业出版社，1995：15
, 百拇医药
2，王 寅，尹 茶，乔传卓，等.第二军医大学学报，1999，20(6)：370
3，刘 盛，乔传卓.中草药，1999，30(5)：368
4，Wu X Y, Liu Y H, Sheng W Y, et al. Planta Med, 1997, 63:55
5，房杏春.中国药科大学学报，1991，22(4)：249
6，胡 平，罗国安，王如骥，等.药学学报，1997，32(7)：549
7，张朝晖，范国荣，徐国钧，等.中国中药杂志，1998，23(5)：259
(1999-11-04收稿), http://www.100md.com