毛细管区带电泳法测定三磷酸腺苷制剂含量
作者：康鲁平 尹茶 慈薇 刘荔荔 柴逸峰 吴玉田
单位：
关键词：毛细管区带电泳；三磷酸腺苷；二磷酸腺苷；一磷酸腺苷
第二军医大学学报000831 [中图分类号] R 917 [文献标识码] B
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0794-02
三磷酸腺苷(ATP)为辅酶类药物，是机体能量的重要来源，临床上用于肌萎缩、脑溢血后遗症等多种疾病的治疗。ATP制剂在生产和贮存过程中易带进或产生二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)，因而目前卫生部部颁及地方标准中多采用纸层析或纸电泳分离ATP后分光光度法测定。该法繁琐费时，且只能测定ATP含量。近年有用HPLC法测定的报道[1]，但其仅对ATP进行了定量分析。Shao等[2]曾用毛细管电泳法(CE)分析生物体内ATP，ADP，AMP等核苷酸。本实验采用毛细管区带电泳法(CZE)，以对氨基苯磺酸钠为内标(IS)，同时分析ATP制剂中ATP，ADP，AMP含量，方法简便，结果准确。
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1 材料和方法
1.1 仪器和试药 自动毛细管电泳仪 Capillary Ion Analyzer(美国Waters 公司)。熔融石英毛细管40 cm× 75 μm(河北永年光导纤维厂)，有效长度33 cm，未涂渍。一磷酸腺苷钠(AMP，Sigma公司)，二磷酸腺苷钠(ADP，中国科学院上海生物化学研究所东风生化技术公司)，三磷酸腺苷钠(ATP，上海伯奥生物科技公司)，对氨基苯磺酸钠(上海试剂三厂)，三磷酸腺苷二钠注射液(江苏江化制药厂，20 mg/2 ml，批号97012511，97090511)，注射用三磷酸腺苷二钠(粉针剂，上海第一生化药业公司上海生物化学制药厂，20 mg，批号9901191)，水为重蒸水， 所有试剂均为分析纯。
1.2 电泳条件 柱温20℃；运行电压12 kV；虹吸法进样，高度差10 cm，5 s；检测波长214 nm；灵敏度0.01 AUFS。运行缓冲液：50 mmol/L磷酸盐缓冲液，0.1 mol/L NaOH 调节 pH为9.0，0.45 μm微孔滤膜过滤。两次进样之间用1 mol/L NaOH、双蒸水及运行缓冲液各冲洗3 min。
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1.3 标准贮备液制备 精确称取ATP，ADP，AMP及对氨基苯磺酸钠对照品253.5，57.4，50.0，279.6 mg，分别以水定容于50 ml容量瓶，则各标准贮备液质量浓度依次为5.07，1.15，1.00，5.59 g/L。ATP易分解，应即用即配。
2 结 果
2.1 标准曲线 精确吸取ATP标准贮备液0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml，ADP标准贮备液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.50，4.50 ml，AMP标准贮备液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50 ml，置于25 ml容量瓶内，分别加入内标液2.00 ml，加水至刻度，摇匀。以校正峰面积[(A′=(A待测.tIS)/(AIS.t待测)]对对照品浓度绘制标准曲线。结果见表1。
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2.2 精密度 在本文1.2所述电泳条件下，取一对照品溶液连续进样4次，计算校正峰面积的RSD，结果见表1。
2.3 加样回收率 向已知含量样品中加入适当对照品，连续进样5次，测定含量，计算加样回收率，结果见表2。
2.4 样品测定 精密称取样品适量(相当于ATP 20 mg)，置于25 ml容量瓶，加入内标标准液2 ml，加水至刻度，摇匀，测定含量，结果见表3和图1。
表 1 标准曲线特征参数(n=7) 成 分
线性范围
(ρB/mg.L-1)
回归方程
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r
RSD(%)
ATP
50.7～1 014
Y=0.023+
0.995 5
2.90
5.29×10-4X
ADP
22.9～206.6
Y=-0.030+
0.998 8
, 百拇医药
2.87
2.16×10-3X
AMP
20～140
Y=0.003+
0.990 6
1.67
1.75×10-3X
Y：校正峰面积； X：待测组分浓度表 2 ATP,ADP和AMP的加样回收率(n=5) 成 分
加入浓度(ρB/mg*L-1)
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测得浓度
(ρB/mg*L-1)
回收率(%)
RSD(%)
ATP
202.80
202.1±1.5
99.64±0.74
0.737 8
ADP
45.92
46.49±1.19
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101.3±2.6
2.558
AMP
5.00
4.960±0.062
99.21±1.24
1.251
表 3 样品分析结果(n=3) 样 品
AMP(m/mg)
ADP
(m/mg)
ATP
, 百拇医药
(m/mg)
含量
(%)
97012511
0.52
4.01
19.79
98.93
(20 mg/2 ml)
97090511
0.39
3.26
22.39
, 百拇医药
111.9
(20 mg/2 ml)
9901191
0.48
1.50
23.18
115.9
(20 mg)
图 1 标准品(A)和样品(B)的毛细管电泳图谱
1:AMP; 2:IS; 3: ADP; 4: ATP
, 百拇医药
3 讨 论
在CZE法中，缓冲溶液pH值及浓度对选择性的影响最为突出[3]。本研究中待测的3组分均为酸性，在碱性条件下可解离而带负电荷。
本研究考察了pH 6.2～10.6 时的分离情况，发现各组分在此范围内皆可分离，但pH值较低时峰形前延或拖尾现象严重，pH>8.6时峰形对称。另外，也考察了25～100 mmol/L磷酸盐缓冲液的分离情况，发现缓冲液浓度提高，组分出峰顺序改变，峰形改善，迁移时间延长，焦耳热增多。经筛选确定分离条件为pH=9.0的50 mmol/L磷酸盐缓冲液。因为样品溶液中多种添加剂的影响，导致样品与标准品出峰时间有所差别。
[参 考 文 献]
[1] 李治洪，刘克江. 高效液相色谱法测定ATP制剂含量[J]. 药物分析杂志, 1997, 17(4)：245-247.
[2] Shao XW，O′Neill K, Zhao ZX, et al. Analysis of nucleotide pools in human lymphoma cells by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A, 1994，680(2)：463-468.
[3] 林炳承 主编. 毛细管电泳导论[M]. 北京：科学出版社， 1996. 87-92.
[收稿日期] 2000-01-10
[修回日期] 2000-05-31, http://www.100md.com
单位：
关键词：毛细管区带电泳；三磷酸腺苷；二磷酸腺苷；一磷酸腺苷
第二军医大学学报000831 [中图分类号] R 917 [文献标识码] B
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0794-02
三磷酸腺苷(ATP)为辅酶类药物，是机体能量的重要来源，临床上用于肌萎缩、脑溢血后遗症等多种疾病的治疗。ATP制剂在生产和贮存过程中易带进或产生二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)，因而目前卫生部部颁及地方标准中多采用纸层析或纸电泳分离ATP后分光光度法测定。该法繁琐费时，且只能测定ATP含量。近年有用HPLC法测定的报道[1]，但其仅对ATP进行了定量分析。Shao等[2]曾用毛细管电泳法(CE)分析生物体内ATP，ADP，AMP等核苷酸。本实验采用毛细管区带电泳法(CZE)，以对氨基苯磺酸钠为内标(IS)，同时分析ATP制剂中ATP，ADP，AMP含量，方法简便，结果准确。
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1 材料和方法
1.1 仪器和试药 自动毛细管电泳仪 Capillary Ion Analyzer(美国Waters 公司)。熔融石英毛细管40 cm× 75 μm(河北永年光导纤维厂)，有效长度33 cm，未涂渍。一磷酸腺苷钠(AMP，Sigma公司)，二磷酸腺苷钠(ADP，中国科学院上海生物化学研究所东风生化技术公司)，三磷酸腺苷钠(ATP，上海伯奥生物科技公司)，对氨基苯磺酸钠(上海试剂三厂)，三磷酸腺苷二钠注射液(江苏江化制药厂，20 mg/2 ml，批号97012511，97090511)，注射用三磷酸腺苷二钠(粉针剂，上海第一生化药业公司上海生物化学制药厂，20 mg，批号9901191)，水为重蒸水， 所有试剂均为分析纯。
1.2 电泳条件 柱温20℃；运行电压12 kV；虹吸法进样，高度差10 cm，5 s；检测波长214 nm；灵敏度0.01 AUFS。运行缓冲液：50 mmol/L磷酸盐缓冲液，0.1 mol/L NaOH 调节 pH为9.0，0.45 μm微孔滤膜过滤。两次进样之间用1 mol/L NaOH、双蒸水及运行缓冲液各冲洗3 min。
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1.3 标准贮备液制备 精确称取ATP，ADP，AMP及对氨基苯磺酸钠对照品253.5，57.4，50.0，279.6 mg，分别以水定容于50 ml容量瓶，则各标准贮备液质量浓度依次为5.07，1.15，1.00，5.59 g/L。ATP易分解，应即用即配。
2 结 果
2.1 标准曲线 精确吸取ATP标准贮备液0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml，ADP标准贮备液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.50，4.50 ml，AMP标准贮备液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50 ml，置于25 ml容量瓶内，分别加入内标液2.00 ml，加水至刻度，摇匀。以校正峰面积[(A′=(A待测.tIS)/(AIS.t待测)]对对照品浓度绘制标准曲线。结果见表1。
, http://www.100md.com
2.2 精密度 在本文1.2所述电泳条件下，取一对照品溶液连续进样4次，计算校正峰面积的RSD，结果见表1。
2.3 加样回收率 向已知含量样品中加入适当对照品，连续进样5次，测定含量，计算加样回收率，结果见表2。
2.4 样品测定 精密称取样品适量(相当于ATP 20 mg)，置于25 ml容量瓶，加入内标标准液2 ml，加水至刻度，摇匀，测定含量，结果见表3和图1。
表 1 标准曲线特征参数(n=7) 成 分
线性范围
(ρB/mg.L-1)
回归方程
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r
RSD(%)
ATP
50.7～1 014
Y=0.023+
0.995 5
2.90
5.29×10-4X
ADP
22.9～206.6
Y=-0.030+
0.998 8
, 百拇医药
2.87
2.16×10-3X
AMP
20～140
Y=0.003+
0.990 6
1.67
1.75×10-3X
Y：校正峰面积； X：待测组分浓度表 2 ATP,ADP和AMP的加样回收率(n=5) 成 分
加入浓度(ρB/mg*L-1)
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测得浓度
(ρB/mg*L-1)
回收率(%)
RSD(%)
ATP
202.80
202.1±1.5
99.64±0.74
0.737 8
ADP
45.92
46.49±1.19
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101.3±2.6
2.558
AMP
5.00
4.960±0.062
99.21±1.24
1.251
表 3 样品分析结果(n=3) 样 品
AMP(m/mg)
ADP
(m/mg)
ATP
, 百拇医药
(m/mg)
含量
(%)
97012511
0.52
4.01
19.79
98.93
(20 mg/2 ml)
97090511
0.39
3.26
22.39
, 百拇医药
111.9
(20 mg/2 ml)
9901191
0.48
1.50
23.18
115.9
(20 mg)
图 1 标准品(A)和样品(B)的毛细管电泳图谱
1:AMP; 2:IS; 3: ADP; 4: ATP
, 百拇医药
3 讨 论
在CZE法中，缓冲溶液pH值及浓度对选择性的影响最为突出[3]。本研究中待测的3组分均为酸性，在碱性条件下可解离而带负电荷。
本研究考察了pH 6.2～10.6 时的分离情况，发现各组分在此范围内皆可分离，但pH值较低时峰形前延或拖尾现象严重，pH>8.6时峰形对称。另外，也考察了25～100 mmol/L磷酸盐缓冲液的分离情况，发现缓冲液浓度提高，组分出峰顺序改变，峰形改善，迁移时间延长，焦耳热增多。经筛选确定分离条件为pH=9.0的50 mmol/L磷酸盐缓冲液。因为样品溶液中多种添加剂的影响，导致样品与标准品出峰时间有所差别。
[参 考 文 献]
[1] 李治洪，刘克江. 高效液相色谱法测定ATP制剂含量[J]. 药物分析杂志, 1997, 17(4)：245-247.
[2] Shao XW，O′Neill K, Zhao ZX, et al. Analysis of nucleotide pools in human lymphoma cells by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A, 1994，680(2)：463-468.
[3] 林炳承 主编. 毛细管电泳导论[M]. 北京：科学出版社， 1996. 87-92.
[收稿日期] 2000-01-10
[修回日期] 2000-05-31, http://www.100md.com