HPLC测定银杏愈伤组织内酯A的研究
作者：陈云龙 徐程 徐礼根 杨志竖
单位：陈云龙 徐程 徐礼根 杨志竖 浙江大学西溪校区生命科学学院(杭州310012)
关键词：银杏；愈伤组织；银杏内酯A；HPLC
HPLC测定银杏愈伤组织内酯A的研究 摘 要 建立了一种可用于银杏离体细胞培养物中内酯A含量分析的RP-HPLC方法。样品经低浓度甲醇提取后，用中性或酸性氧化铝固相萃取柱纯化，用示差检测器检测，银杏内酯A的最低检测限为0.012 μg，方法回收率为(96.0±2)%，RSD为3.1%。
Detection of Ginkgolide A in Ginkgo
(Ginkgo biloba) Callus Culture by HPLC
, 百拇医药
Chen Yunlong, Xu Cheng, Xu Ligen, et al.
(College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310012)
Abstract An analytical method was developed to confirm the production of ginkgolide A by Ginkgo biloba L. callus cultured in vitro. Biomass samples were selectively extracted with 10% methanol and the resulting extract was purified on aluminium oxide solid-phase extraction column. After concentration, the ginkgolide A was determined by HPLC on a C18 column with refractive index detection. The recovery of the method was 96.0±2%. The detection limit was around 0.012 μg, which was low enough for the determination of ginkgolides produced by Ginkgo biloba L. callus cultured in vitro.
, 百拇医药
Key words Ginkgo biloba L. callus ginkgolide A
银杏内酯(包括内酯A、B、C)作为一类特异有效的血小板活化因子(platelet-activating factor)受体拮抗剂，近年来受到了世界各国药学工作者的广泛关注。由于这类化合物分子立体结构复杂，人工合成的技术难度大，目前仍以银杏叶作为提取银杏内酯化合物的主要来源[1]。关于银杏离体培养产生内酯化合物的研究，尽管做了大量工作，但由于分析测试技术上的限制，银杏细胞培养中内酯含量分析尚有一定困难[2～4]。笔者通过采用细直径HPLC快速分析柱，检测到了愈伤组织培养物中银杏内酯A化合物。
1 仪器和材料
高效液相色谱仪：日本岛津，包括LC-6A型输液泵，RID-6A型示差检测器，SCL-6A型系统控制器，以及C-R3A型数据处理机。
, http://www.100md.com
银杏幼叶：1998年4月中旬采自浙江大学西溪校区，银杏种实(大佛手)购自浙江富阳。
银杏内酯A、B对照品由日本梅田诚一教授提供；中性氧化铝、聚酰胺为柱层析用；C18固相萃取柱，大连依利特科学仪器有限公司出产。甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯级。
2 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS2 3μ 2.0 mm (id)×100 mm；流动相：甲醇-水(33∶67)；柱温：30℃；流速：0.2 mL/min；示差检测器：1.0×10-6RIU。
3 愈伤组织诱导培养
银杏幼叶、种胚愈伤组织按文献[3]方法进行诱导，MS固体培养基中含 1.0 mg/L NAA、 0.1 mg/L KT、30 g/L蔗糖，调pH至6.0，培养温度(25±1)℃，每3周继代一次，继代两代后，将愈伤组织取出，冷冻干燥后供样品制备用。
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4 样品提取制备
参照姚渭溪等人方法[5]并作改进。称取1.0 g 干愈伤组织，置于50 mL圆底烧瓶中，加10%甲醇溶液10 mL和少量沸石，回流提取3次，每次60 min，趁热用布氏漏斗抽滤，合并滤液，用旋转蒸发器浓缩至干，残渣溶于5 mL甲醇中，将溶液加入装有5 g中性氧化铝的小层析柱上(预先用甲醇装柱并冲洗)，用甲醇洗脱，收集洗脱液25 mL,浓缩并用N2吹干后，再用0.2～0.5 mL甲醇溶液溶解，密封后置于50℃水浴中恒温60 min，取出，供HPLC分析用。
5 方法回收率试验和工作曲线制作
称取1 g干愈伤组织，加入30 μg银杏内酯A和20 μg银杏内酯B标样，按上述样品提取纯化过程制备分析样品，重复3次，计算各自方法回收率。
将银杏内酯A标准样品，稀释配制成0.024、0.036、0.048、0.060、0.070 μg/μL系列浓度，进样10 μL，以最小二乘法作线性回归处理，得回归方程 Y(峰高)=20.9122+3298.66C(μg),r=0.9934。
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6 结果与讨论
6.1 由于银杏内酯化合物是不挥发性的，在未衍生化前无法进行GC分析，同时它们在219 nm处的微弱紫外吸收系数，易受其它杂质干扰，故也难以用特异性的灵敏的HPLC-UV方法检测[1]，对于目前银杏内酯浓度仅为 μg范围的离体愈伤组织、细胞悬浮培养物来说，受方法最低检测量等灵敏度因素限制，尚无法用常规的HPLC-RI分析方法来监控银杏内酯的生物合成。
6.2 本试验通过采用直径为2.0 mm的快速RP-HPLC分析柱，可节约大量流动相(流速为0.2 mL/min)，分析时间不到常规柱的二分之一，银杏内酯A的最低检出限为0.012 μg，从而使 HPLC-RI方法分析检测离体愈伤组织、悬浮细胞培养物中的银杏内酯含量成为可能。
6.3 银杏内酯分析难度大，除了缺乏特异灵敏的检测器外，一个重要原因是样品纯化处理复杂[6，7]。
, 百拇医药
Ⅰ-银杏内酯A Ⅱ-幼叶愈伤组织
图1 样品的HPLC谱
有文献报道，使用硅胶柱来提纯样品的方法[4]，从理论上讲氧化铝对酚性杂质的去除效果要好于硅胶，但在 pH>7.5的碱性条件下，银杏萜内酯化合物易发生开环反应[8]，故必须选用中性或酸性氧化铝作固相提取柱。本试验在干愈伤组织中加入约50～70 nmol 内酯标准品，采取以上方法提取纯化，进行方法回收率试验，结果银杏内酯A、B回收率分别为(96.0±2)%，(93.1±3%)，RSD为3.1%，3.8%。表明该提取纯化方法是准确可行的。
6.4 按以上分析条件，经继代两代的银杏幼叶、种胚愈伤组织的高效液相色谱图上仍能看到明显的银杏内酯A峰，见图1，说明叶和种胚愈伤组织都能生物合成银杏内酯A化合物，其在叶愈伤组织中的含量要高于胚性愈伤组织，分别为48 和12 μg/g，见表1。至于银杏内酯B，本试验未能检测到，尚有待进一步深入研究。
, 百拇医药
表1 不同样品中银杏内酯的含量
内酯种类
A(mg/g)
B(mg/g)
银杏幼叶
0.54
0.63
银杏种实
-
-
幼叶愈伤
0.048
-
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种胚愈伤
0.012
-
参 考 文 献
1 Van Beek T A,et al. J Chromatogr, 1991,543:37
2 Nakanishi K,et al. J Am Chem Soc,1971,93:3546
3 Carrier D J,et al. Plant Cell Rep,1990,8:635
4 Nathalie Chauret. J Chromatogr, 1991,588:281
5 Yao Weixi,et al. Proceedings of 97 International Seminar on Ginkgo. Beijing,1997：182
6 Hoon Huh,et al.Planta Med,1993,59:232
7 Mee Hee Jeon,et al. Plant Cell Rep,1995,14:501
8 林启寿编著.中草药成分化学.北京：科学出版社，1977：244
(1998-11-16 收稿), 百拇医药
单位：陈云龙 徐程 徐礼根 杨志竖 浙江大学西溪校区生命科学学院(杭州310012)
关键词：银杏；愈伤组织；银杏内酯A；HPLC
HPLC测定银杏愈伤组织内酯A的研究 摘 要 建立了一种可用于银杏离体细胞培养物中内酯A含量分析的RP-HPLC方法。样品经低浓度甲醇提取后，用中性或酸性氧化铝固相萃取柱纯化，用示差检测器检测，银杏内酯A的最低检测限为0.012 μg，方法回收率为(96.0±2)%，RSD为3.1%。
Detection of Ginkgolide A in Ginkgo
(Ginkgo biloba) Callus Culture by HPLC
, 百拇医药
Chen Yunlong, Xu Cheng, Xu Ligen, et al.
(College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310012)
Abstract An analytical method was developed to confirm the production of ginkgolide A by Ginkgo biloba L. callus cultured in vitro. Biomass samples were selectively extracted with 10% methanol and the resulting extract was purified on aluminium oxide solid-phase extraction column. After concentration, the ginkgolide A was determined by HPLC on a C18 column with refractive index detection. The recovery of the method was 96.0±2%. The detection limit was around 0.012 μg, which was low enough for the determination of ginkgolides produced by Ginkgo biloba L. callus cultured in vitro.
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Key words Ginkgo biloba L. callus ginkgolide A
银杏内酯(包括内酯A、B、C)作为一类特异有效的血小板活化因子(platelet-activating factor)受体拮抗剂，近年来受到了世界各国药学工作者的广泛关注。由于这类化合物分子立体结构复杂，人工合成的技术难度大，目前仍以银杏叶作为提取银杏内酯化合物的主要来源[1]。关于银杏离体培养产生内酯化合物的研究，尽管做了大量工作，但由于分析测试技术上的限制，银杏细胞培养中内酯含量分析尚有一定困难[2～4]。笔者通过采用细直径HPLC快速分析柱，检测到了愈伤组织培养物中银杏内酯A化合物。
1 仪器和材料
高效液相色谱仪：日本岛津，包括LC-6A型输液泵，RID-6A型示差检测器，SCL-6A型系统控制器，以及C-R3A型数据处理机。
, http://www.100md.com
银杏幼叶：1998年4月中旬采自浙江大学西溪校区，银杏种实(大佛手)购自浙江富阳。
银杏内酯A、B对照品由日本梅田诚一教授提供；中性氧化铝、聚酰胺为柱层析用；C18固相萃取柱，大连依利特科学仪器有限公司出产。甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯级。
2 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS2 3μ 2.0 mm (id)×100 mm；流动相：甲醇-水(33∶67)；柱温：30℃；流速：0.2 mL/min；示差检测器：1.0×10-6RIU。
3 愈伤组织诱导培养
银杏幼叶、种胚愈伤组织按文献[3]方法进行诱导，MS固体培养基中含 1.0 mg/L NAA、 0.1 mg/L KT、30 g/L蔗糖，调pH至6.0，培养温度(25±1)℃，每3周继代一次，继代两代后，将愈伤组织取出，冷冻干燥后供样品制备用。
, http://www.100md.com
4 样品提取制备
参照姚渭溪等人方法[5]并作改进。称取1.0 g 干愈伤组织，置于50 mL圆底烧瓶中，加10%甲醇溶液10 mL和少量沸石，回流提取3次，每次60 min，趁热用布氏漏斗抽滤，合并滤液，用旋转蒸发器浓缩至干，残渣溶于5 mL甲醇中，将溶液加入装有5 g中性氧化铝的小层析柱上(预先用甲醇装柱并冲洗)，用甲醇洗脱，收集洗脱液25 mL,浓缩并用N2吹干后，再用0.2～0.5 mL甲醇溶液溶解，密封后置于50℃水浴中恒温60 min，取出，供HPLC分析用。
5 方法回收率试验和工作曲线制作
称取1 g干愈伤组织，加入30 μg银杏内酯A和20 μg银杏内酯B标样，按上述样品提取纯化过程制备分析样品，重复3次，计算各自方法回收率。
将银杏内酯A标准样品，稀释配制成0.024、0.036、0.048、0.060、0.070 μg/μL系列浓度，进样10 μL，以最小二乘法作线性回归处理，得回归方程 Y(峰高)=20.9122+3298.66C(μg),r=0.9934。
, http://www.100md.com
6 结果与讨论
6.1 由于银杏内酯化合物是不挥发性的，在未衍生化前无法进行GC分析，同时它们在219 nm处的微弱紫外吸收系数，易受其它杂质干扰，故也难以用特异性的灵敏的HPLC-UV方法检测[1]，对于目前银杏内酯浓度仅为 μg范围的离体愈伤组织、细胞悬浮培养物来说，受方法最低检测量等灵敏度因素限制，尚无法用常规的HPLC-RI分析方法来监控银杏内酯的生物合成。
6.2 本试验通过采用直径为2.0 mm的快速RP-HPLC分析柱，可节约大量流动相(流速为0.2 mL/min)，分析时间不到常规柱的二分之一，银杏内酯A的最低检出限为0.012 μg，从而使 HPLC-RI方法分析检测离体愈伤组织、悬浮细胞培养物中的银杏内酯含量成为可能。
6.3 银杏内酯分析难度大，除了缺乏特异灵敏的检测器外，一个重要原因是样品纯化处理复杂[6，7]。
, 百拇医药
Ⅰ-银杏内酯A Ⅱ-幼叶愈伤组织
图1 样品的HPLC谱
有文献报道，使用硅胶柱来提纯样品的方法[4]，从理论上讲氧化铝对酚性杂质的去除效果要好于硅胶，但在 pH>7.5的碱性条件下，银杏萜内酯化合物易发生开环反应[8]，故必须选用中性或酸性氧化铝作固相提取柱。本试验在干愈伤组织中加入约50～70 nmol 内酯标准品，采取以上方法提取纯化，进行方法回收率试验，结果银杏内酯A、B回收率分别为(96.0±2)%，(93.1±3%)，RSD为3.1%，3.8%。表明该提取纯化方法是准确可行的。
6.4 按以上分析条件，经继代两代的银杏幼叶、种胚愈伤组织的高效液相色谱图上仍能看到明显的银杏内酯A峰，见图1，说明叶和种胚愈伤组织都能生物合成银杏内酯A化合物，其在叶愈伤组织中的含量要高于胚性愈伤组织，分别为48 和12 μg/g，见表1。至于银杏内酯B，本试验未能检测到，尚有待进一步深入研究。
, 百拇医药
表1 不同样品中银杏内酯的含量
内酯种类
A(mg/g)
B(mg/g)
银杏幼叶
0.54
0.63
银杏种实
-
-
幼叶愈伤
0.048
-
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种胚愈伤
0.012
-
参 考 文 献
1 Van Beek T A,et al. J Chromatogr, 1991,543:37
2 Nakanishi K,et al. J Am Chem Soc,1971,93:3546
3 Carrier D J,et al. Plant Cell Rep,1990,8:635
4 Nathalie Chauret. J Chromatogr, 1991,588:281
5 Yao Weixi,et al. Proceedings of 97 International Seminar on Ginkgo. Beijing,1997：182
6 Hoon Huh,et al.Planta Med,1993,59:232
7 Mee Hee Jeon,et al. Plant Cell Rep,1995,14:501
8 林启寿编著.中草药成分化学.北京：科学出版社，1977：244
(1998-11-16 收稿), 百拇医药