HPLC测定银杏愈伤组织内酯A的研究

http://www.100md.com 《中草药》 1999年第6期

     作者：陈云龙 徐程 徐礼根 杨志竖

    单位：陈云龙 徐程 徐礼根 杨志竖 浙江大学西溪校区生命科学学院(杭州310012)

    关键词：银杏；愈伤组织；银杏内酯A；HPLC

    HPLC测定银杏愈伤组织内酯A的研究 摘 要 建立了一种可用于银杏离体细胞培养物中内酯A含量分析的RP-HPLC方法。样品经低浓度甲醇提取后，用中性或酸性氧化铝固相萃取柱纯化，用示差检测器检测，银杏内酯A的最低检测限为0.012 μg，方法回收率为(96.0±2)%，RSD为3.1%。

    Detection of Ginkgolide A in Ginkgo

    (Ginkgo biloba) Callus Culture by HPLC

    Chen Yunlong, Xu Cheng, Xu Ligen, et al.

    (College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310012)

    Abstract An analytical method was developed to confirm the production of ginkgolide A by Ginkgo biloba L. callus cultured in vitro. Biomass samples were selectively extracted with 10% methanol and the resulting extract was purified on aluminium oxide solid-phase extraction column. After concentration, the ginkgolide A was determined by HPLC on a C₁₈ column with refractive index detection. The recovery of the method was 96.0±2%. The detection limit was around 0.012 μg, which was low enough for the determination of ginkgolides produced by Ginkgo biloba L. callus cultured in vitro.

    Key words Ginkgo biloba L. callus ginkgolide A

    银杏内酯(包括内酯A、B、C)作为一类特异有效的血小板活化因子(platelet-activating factor)受体拮抗剂，近年来受到了世界各国药学工作者的广泛关注。由于这类化合物分子立体结构复杂，人工合成的技术难度大，目前仍以银杏叶作为提取银杏内酯化合物的主要来源^[1]。关于银杏离体培养产生内酯化合物的研究，尽管做了大量工作，但由于分析测试技术上的限制，银杏细胞培养中内酯含量分析尚有一定困难^[2～4]。笔者通过采用细直径HPLC快速分析柱，检测到了愈伤组织培养物中银杏内酯A化合物。

    1 仪器和材料

    高效液相色谱仪：日本岛津，包括LC-6A型输液泵，RID-6A型示差检测器，SCL-6A型系统控制器，以及C-R3A型数据处理机。

    银杏幼叶：1998年4月中旬采自浙江大学西溪校区，银杏种实(大佛手)购自浙江富阳。

    银杏内酯A、B对照品由日本梅田诚一教授提供；中性氧化铝、聚酰胺为柱层析用；C₁₈固相萃取柱，大连依利特科学仪器有限公司出产。甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯级。

    2 色谱条件

    色谱柱：Hypersil ODS₂ 3μ 2.0 mm (id)×100 mm；流动相：甲醇-水(33∶67)；柱温：30℃；流速：0.2 mL/min；示差检测器：1.0×10^-6RIU。

    3 愈伤组织诱导培养

    银杏幼叶、种胚愈伤组织按文献^[3]方法进行诱导，MS固体培养基中含 1.0 mg/L NAA、 0.1 mg/L KT、30 g/L蔗糖，调pH至6.0，培养温度(25±1)℃，每3周继代一次，继代两代后，将愈伤组织取出，冷冻干燥后供样品制备用。

    4 样品提取制备

    参照姚渭溪等人方法^[5]并作改进。称取1.0 g 干愈伤组织，置于50 mL圆底烧瓶中，加10%甲醇溶液10 mL和少量沸石，回流提取3次，每次60 min，趁热用布氏漏斗抽滤，合并滤液，用旋转蒸发器浓缩至干，残渣溶于5 mL甲醇中，将溶液加入装有5 g中性氧化铝的小层析柱上(预先用甲醇装柱并冲洗)，用甲醇洗脱，收集洗脱液25 mL,浓缩并用N₂吹干后，再用0.2～0.5 mL甲醇溶液溶解，密封后置于50℃水浴中恒温60 min，取出，供HPLC分析用。

    5 方法回收率试验和工作曲线制作

    称取1 g干愈伤组织，加入30 μg银杏内酯A和20 μg银杏内酯B标样，按上述样品提取纯化过程制备分析样品，重复3次，计算各自方法回收率。

    将银杏内酯A标准样品，稀释配制成0.024、0.036、0.048、0.060、0.070 μg/μL系列浓度，进样10 μL，以最小二乘法作线性回归处理，得回归方程 Y(峰高)=20.9122+3298.66C(μg),r=0.9934。

    6 结果与讨论

    6.1 由于银杏内酯化合物是不挥发性的，在未衍生化前无法进行GC分析，同时它们在219 nm处的微弱紫外吸收系数，易受其它杂质干扰，故也难以用特异性的灵敏的HPLC-UV方法检测^[1]，对于目前银杏内酯浓度仅为 μg范围的离体愈伤组织、细胞悬浮培养物来说，受方法最低检测量等灵敏度因素限制，尚无法用常规的HPLC-RI分析方法来监控银杏内酯的生物合成。

    6.2 本试验通过采用直径为2.0 mm的快速RP-HPLC分析柱，可节约大量流动相(流速为0.2 mL/min)，分析时间不到常规柱的二分之一，银杏内酯A的最低检出限为0.012 μg，从而使 HPLC-RI方法分析检测离体愈伤组织、悬浮细胞培养物中的银杏内酯含量成为可能。

    6.3 银杏内酯分析难度大，除了缺乏特异灵敏的检测器外，一个重要原因是样品纯化处理复杂^[6，7]。

    Ⅰ-银杏内酯A Ⅱ-幼叶愈伤组织

    图1 样品的HPLC谱

    有文献报道，使用硅胶柱来提纯样品的方法^[4]，从理论上讲氧化铝对酚性杂质的去除效果要好于硅胶，但在 pH>7.5的碱性条件下，银杏萜内酯化合物易发生开环反应^[8]，故必须选用中性或酸性氧化铝作固相提取柱。本试验在干愈伤组织中加入约50～70 nmol 内酯标准品，采取以上方法提取纯化，进行方法回收率试验，结果银杏内酯A、B回收率分别为(96.0±2)%，(93.1±3%)，RSD为3.1%，3.8%。表明该提取纯化方法是准确可行的。

    6.4 按以上分析条件，经继代两代的银杏幼叶、种胚愈伤组织的高效液相色谱图上仍能看到明显的银杏内酯A峰，见图1，说明叶和种胚愈伤组织都能生物合成银杏内酯A化合物，其在叶愈伤组织中的含量要高于胚性愈伤组织，分别为48 和12 μg/g，见表1。至于银杏内酯B，本试验未能检测到，尚有待进一步深入研究。

    表1 不同样品中银杏内酯的含量

    内酯种类

    A(mg/g)

    B(mg/g)

    银杏幼叶

    0.54

    0.63

    银杏种实

    -

    -

    幼叶愈伤

    0.048

    -

    种胚愈伤

    0.012

    -

    参 考 文 献

    1 Van Beek T A,et al. J Chromatogr, 1991,543:37

    2 Nakanishi K,et al. J Am Chem Soc,1971,93:3546

    3 Carrier D J,et al. Plant Cell Rep,1990,8:635

    4 Nathalie Chauret. J Chromatogr, 1991,588:281

    5 Yao Weixi,et al. Proceedings of 97 International Seminar on Ginkgo. Beijing,1997：182

    6 Hoon Huh,et al.Planta Med,1993,59:232

    7 Mee Hee Jeon,et al. Plant Cell Rep,1995,14:501

    8 林启寿编著.中草药成分化学.北京：科学出版社，1977：244

    (1998-11-16 收稿)

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