MK-801对缺氧缺血性大脑皮质神经细胞钙超载影响的研究
作者：李炜如 姚裕家 曾珍 陈永秀 杨凡
单位：610041 成都，华西医科大学附属第二医院儿科
关键词：地卓亚平马来酸盐；脑缺氧；脑缺血；钙；神经元
中华儿科杂志990206 【摘要】 目的 探讨MK-801对缺氧缺血性脑损伤的防治作用。方法 将体外培养的大鼠胚胎大脑皮质神经细胞分为正常对照、缺氧缺血性脑损伤、MK-801治疗三组，每组8例。检测各组神经细胞内总钙(TCa)及游离钙(Ca2+i)的变化。结果 缺氧缺血性脑损伤组TCa、Ca2+i明显高于正常对照组(P<0.01)，MK-801治疗组TCa、Ca2+i明显低于缺氧缺血性脑损伤组(P<0.01)。结论 缺氧缺血性脑损伤可引起神经细胞内钙超载，MK-801可有效阻止钙内流，有效保护神经细胞，避免缺氧缺血性脑损伤。
Effect of MK-801 on calcium overload of cerebral cortex nerve cells with hypoxic ischemic brain damage LI Weiru, YAO Yujia, ZENG Zhen, et al. The 2nd University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To study the protective and therapeutic effect of MK-801 on hypoxic ischemic brain damage. Methods The authors cultured the cerebral cortex nerve cells of fetal rats in vitro and divided them into normal control group, hypoxic ischemic brain damage group and MK-801 group, each consisting of 8 cases. The total calcium (TCa) and free calcium (Ca2+i) of nerve cells were detected. Results TCa and Ca2+i levels of hypoxic ischemic group were much higher than those of normal control group (P<0.01). TCa and Ca2+i levels of MK-801 group were much lower than those of hypoxic ischemic group (P<0.01). Conclusion Hypoxic ischemic brain damage can cause a calcium overload in nerve cells. MK-801 may protect nerve cells from damage by proventing influx of calcium into nerve cells.
【Key words】 Dizocilpine maleate Cerebral anoxia Cerebral ischemia Calcium Nerve cells
近年来研究表明，在缺氧缺血性脑损伤的众多发病机理中，神经细胞内钙超载而产生神经细胞损伤是其重要机理之一。阻止细胞内钙超载是防止脑损伤的重要措施。故应用神经细胞体外培养并制成缺氧缺血模型，并应用阻止阳离子进入细胞内药物MK-801(Dizocilpine)以阻止Ca2+i内流，达到对缺氧缺血性脑损伤患儿的保护作用。
对象及方法
一、对象
将培养12～14天大鼠胚胎大脑皮质神经细胞，随机分为三组；正常对照组8例，缺氧缺血性脑损伤组8例，MK-801治疗组8例。
二、实验方法
1.神经细胞培养：分离孕15～17天大鼠胚胎大脑皮质并剪碎，用0.025%胰酶在37℃消化30分钟，以含10%小牛血清的DMEM组织培养液终止胰酶作用，分离出细胞，用培养液调整细胞数至106/ml，分装至已包被多聚赖氨酸的有孔培养板中，置入CO2培养箱内培养5～7天，加入阿糖胞苷作用48小时(浓度为10-6mol)，继续培养至12～14天，待用。
2.样本制备：正常对照组：以DMEM培养液培养。缺氧缺血性脑损伤组：加入氰化钾(CNK)20 mmol，20分钟后，用Tris液冲洗3次，以无Ca2+、Na+的Tris液保持20分钟后，加入DMEM培养。MK-801治疗组：加入CNK 20 mmol 20分钟后用Tris液洗3次，以无Ca2+、Na2+Tris液保持20分钟后，加入含MK-801 12 μmol的DMEM培养液培养。
上述三组细胞培养24小时备检。
3.检测方法：
(1)神经细胞内TCa测定用原子吸收分光光度法测定[1]；
(2)神经细胞内Ca2+i用Ca2+荧光指示剂Fura-2AM法测定[2]。
4.统计学处理方法：采用方差分析，经F检验差异有显著意义者再做两两比较。
结 果
正常对照组、缺氧缺血性脑损伤组、MK-801治疗组神经细胞内TCa、Ca2+i浓度比较见表1。
表1 三组神经细胞TCa及Ca2+i测定结果(
±s) 组别例数
TCa(μg/L cell)
Ca2+i(F331.2/F382.4)
正常对照组
8
3.02±1.15
0.81±0.12
缺氧缺血性脑损伤组
8
6.70±1.45
1.08±0.14
MK-801治疗组
8
3.61±1.08
0.88±0.09
从表1可见MK-801治疗组TCa、Ca2+i(3.61±1.08、0.88±0.09)虽高于正常对照组(3.01±1.15、0.81±0.12)，但明显低于缺氧缺血性脑损伤组(6.70±1.45，1.08±0.14)；缺氧缺血性脑损伤组明显高于正常对照组，三组间TCa及Ca2+比较差异有显著意义(TCa F=4.31，P<0.01，Ca2+i比较F=8.677，P<0.01)。讨 论
大量体内外实验研究表明，缺氧缺血性脑损伤由多种作用机理引起，多种因素相互影响，而细胞内钙超载是目前认为最重要的作用机理之一[3]。当缺氧缺血时由于能量耗竭，使细胞膜表面Na+、K+-ATP酶活性降低，导致离子交换障碍，膜离子梯度不能维持，细胞膜去极化，钙通道开放，Ca2+进入细胞浆内；线粒体及内质网对Ca2+的隔离作用降低，使其内Ca2+进入细胞浆；另外，细胞间隙增加的谷氨酸作用于谷氨酸受体启动钙通道也可引起细胞外钙离子进入细胞内[3]。本研究也证明缺氧缺血时神经细胞内钙明显增高。
细胞内增高的Ca2+，引起Ca2+超载可使游离脂肪酸增多，而产生血管收缩物质，进一步造成缺血后低灌注：激活Ca2+依赖酶活性，进而破坏细胞结构完整性；抑制ATP的生成，导致细胞能量进一步衰竭；自由基生成过多，脑血流障碍等均与细胞内Ca2+超载有关。
由于细胞内钙超载引起细胞缺氧缺血性脑损伤在其发病机理中占有重要地位。故如何阻止细胞外Ca2+流入细胞内，是当前研究缺氧缺血性脑病治疗的重要方面。目前认为兴奋性氨基酸尤其是谷氨酸增多，刺激谷氨酸受体引起过度兴奋，在谷氨酸受体中N-甲基P-天门冬氨基酸受体(NMDA受体)对Ca2+i通道最为重要。它的过度兴奋可引起钙通道开放，Ca2+内流而导致神经细胞损伤[3]。
MK-801(Dizocilpine)能占领离子通道结合位点，具有专一性强、效能高等特点的非竞争拮抗剂。它通过“开放通道”机理，占领钙离子通道结合位点，阻止细胞外Ca2+通过NMDA受体门通道进入细胞内，从而阻止NMDA受体的反应，减少细胞外Ca2+进入细胞内所引起的进一步脑损伤。本研究表明，在应用MK-801后可使细胞内钙明显低于缺氧缺血模型组的细胞内钙。说明NK-801能有效的保护神经细胞，达到预防治疗缺氧缺血性脑损伤的目的。虽然近年来的研究表明该药在临床应用中有精神方面的副作用，但Olney等[4]发现，联合应用某些抗胆碱药物，如安定、巴比妥类药可防止其所致的精神症状和某些行为学上的损害。故此药作为有效的钙拮抗剂有着良好的前景。
本课题为国家博士点专项基金资助
参考文献
1 Shalev RS, Shalev O, Amir N, et al. Erythrocyte (Ca2++Mg2+)-ATP ase activity and calcium bemeostasis in duchenne muscular dystrophy. Neurol Sci, 1984, 63:325.
2 沈茂星，林慈，沈惟堂，等.呼吸衰竭患儿红细胞胞浆游离钙的观察.上海医学，1990，13：698-700.
3 李炜如.兴奋性氨基酸及钙内流在缺氧缺血性脑损伤中的作用.中国实用儿科杂志，1997，12：245-246.
4 母德志，姚裕家，李炜如.新生猪缺氧缺血脑损伤中谷氨酸受体变化的研究.新生儿杂志，1997，12：64-66.
5 Olney JW, Labruyere J, Wang G, et al. NMDA antagonist neurotoxicity. Management prevention Science, 1991, 254:1515-1518.
(收稿：1997-11-12 修回：1998-06-10)