β淀粉样多肽诱导培养大鼠神经元钙超载的实验研究
作者：叶静 张杰 李胜富 步宏 刘协和
单位：叶静(华西医科大学附属第一医院精神科)；张杰(移植免疫实验室 成都 610041)；李胜富(移植免疫实验室 成都 610041)；步宏(移植免疫实验室 成都 610041)；刘协和(华西医科大学附属第一医院精神科)
关键词：β淀粉样多肽；神经元；钙
华西医学000283
摘要：目的：观察人工合成的β淀粉样多肽(Aβ)对培养神经元细胞内游离钙([Ca2+]i)的影响以及褪黑素(Mel)的阻断作用。材料和方法：用激光扫描共聚焦显微镜技术，检测给予不同浓度(Aβ25～35和Mel后新生大鼠皮层培养神经元[Ca2+]i荧光强度。结果：神经元暴露Aβ25～350.5、1、10μmol/L环境后，[Ca2+]i荧光 与对照组比较均呈较有意义升高(P<0.05)；同时暴露Mel组，未见钙荧光强度升高。结论：Aβ25～35可诱导神经元[Ca2+]i升高，并呈剂量依赖性；预先给予Mel可部分阻断这种毒性作用。
, http://www.100md.com
[中图分类号]R329.2+6 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(2000)02-0247-02
The Experimental Study of Intracellular Calcium Overload in Cultured Neuron of Rats Induced by β-Amyloid
YE Jing，ZHANG Jie，LI Sheng-fu，et al.
(The first University Hospital，West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041)
Abstract：objective:To observe the effects of β-Amyloid protein(Aβ P)on the intracellular free calcium ([Ca2+]i)concentration of neurons,and the blocked effect of Melatonin(Mel).Materials and Methods:[Ca2+]i fluorescent intensity of culture cortical neurons derived from newborn rats were measured,after exposed Aβ25～35 and Mel,by using Laser Scanning Confocal microscopy (LSCM) technique.Results:The [Ca2+]i fluorescence intensity was increasing after expose Aβ25～350.5，1.0，10.0μ mol/L(P<0.05)，but while exposed Mel,observed [Ca2+]i fluorescence intensity was not increasing.Conclusion:Aβ25～35 can increase the intracellular free calcium level in cultured neurons derived from newborn rats,and were concentration dependent,Mel can block this effect.
, 百拇医药
Key words:β-Amyloid；Cultured Neuron；Calcium
β淀粉样多肽(Aβ Ρ)是Alzheimer病(AD)病理特征之一老年斑的核心物质，许多证据都支持Aβ对神经元的毒性作用，并且Aβ25～35是最具活性的片段，但Aβ究竟对神经元有哪些毒性，通过何种途径起作用尚不完全清楚。钙在神经精神活动中具有重要生理作用，作为细胞内第二信使与神经元的功能状态、细胞代谢和信号转导密切相关。钙参与神经的突触传递、递质释放、轴浆运输等。细胞内Ca2+平衡被打破，可引起一系列病理性级联反应，造成神经元损伤。褪黑素(Melatonin,Mel)是一种松果体激素，具有强大的抗自由基作用，老年人群和AD病人Mel分泌水平显著下降。由于Mel的抗衰老作用已被许多实验证实，Mel用于AD的治疗逐渐受到重视。但Mel的细胞生物学作用和在对抗AD神经元退行性变上所起的作用尚缺少更多的实验研究。本实验将培养新生大鼠皮层神经元暴露于Aβ25～35和Mel环境，用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术观察Aβ和Mel对神经元游离钙的影响，从而探讨Aβ毒性的可能机制和药物治疗途径。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 原代神经元培养 取生后24小时Wistar大鼠，75%乙醇消毒，分离大脑皮层，剪碎、吹打，胰蛋白酶消化，用含20%胎牛血清的DMEM培养基终止消化并洗涤，接种于铺有多聚赖氨酸的35MM培养皿，置于5%CO2培养箱37℃孵育；24小时后加阿糖胞苷(终浓度为10-5mol/L)，以抑制非神经元过度繁殖，每3天换液一次。
1.2 药物处理 将Aβ25～35(Sigma产品)稀释(250μl DMEM溶解250μg Aβ25～35)，37℃孵育24小时，可见白色纤维状物形成，即为聚集、老化的Aβ；Mel用100%乙醇溶解。按加入二种药物浓度分组(见表1)，孵育24小时。
1.3 胞浆钙荧光强度检测 细胞经DMEM洗涤后加荧光探针Fluo-3/AM，37℃孵育30分钟，再次洗涤后，LSCM检测。脂化成AM(乙酰羟甲基酯)的Fluo-3更易透过细胞膜，与Ca2+结合后发出荧光信号，经LSCM检测到的是胞浆游离钙荧光强度(F)，Fluo-3结合Ca2+越多，荧光信号值越高，由此判断胞浆游离钙水平。
, 百拇医药
1.4 统计学处理：用SPSS软件进行方差分析、t检验和配对t检验。
2 结果
各组药物终浓度和Ca2+的荧光强度如表1。
表1.各组药物终浓度和Ca2+的荧光强度
A
B
C
D
E
F
G
, http://www.100md.com H
Aβ
对照组
0.5
0.5
1
1
10
10
Mel
10
10
10
10
, http://www.100md.com
F
137.35±20.34
136.73±19.45
157.68±21.12
137.45±30.34
165.39±30.24
150.90±20.12
200.93±32.28＃
154.88±28.56
注：1.A组为空白对照，只加DMEM培养基。
2.B-H各组加入Aβ或Mel的终浓度单位为μmol/L。
, 百拇医药
3.F表示Ca2+的荧光信号值。
4.为与对照组比较P<0.05，＃为P<0.01。
经配对t检验，C组与D组、E组与F组、G组与H组比较P<0.05，均有较显著性差异，B组与A组比较无差异。说明正常状态下Mel对神经元胞浆Ca2+无影响，给予Aβ后胞浆Ca2+呈浓度依赖性升高，预先给予Mel可部分阻断这种毒性作用。
3 讨论
本实验获得了Aβ诱导神经元钙超载的直接证据，并观察到Mel的细胞保护作用。细胞钙稳态对维持正常神经元功能是重要的，一旦这种稳态平衡被打破，一时性细胞钙超载将促进不可逆的细胞死亡。迄今已有大量研究证明Aβ可诱导神经元死亡〔1〕，其毒性机理是复杂的，本实验观察到Aβ神经毒性作用的一个环节。细胞内游离钙增高可触发线粒体摄取Ca2+，从而抑制ATP合成，使能量生成障碍；Ca2+还可激活线粒体上磷脂酶，引起线粒体膜损伤，从而使线粒体对细胞氧化还原电位、渗透压、pH值和胞质内信号维持作用受损，最后导致细胞发生不可逆损伤〔2〕。Aβ导致细胞钙超载的机理目前认为是由于Aβ镶嵌于细胞膜脂质双层结构上，构成Ca2+通道，使Ca2+内流〔3〕。AβP的C末端105肽可形成非选择性离子通道，使Ca2+内流增加。活体研究发现，细胞内Ca2+持续性升高可导致神经元微管减少、丝状物聚集和tau蛋白增多、神经纤维缠结的免疫活性增加〔4〕。说明神经元Ca2+超载与Alzheimer病的病理密切相关。Mattson MP等〔5〕研究表明，Aβ的毒性作用是通过增加神经元对兴奋性氨基酸敏感性而实现，这依赖于Ca2+内流，因为这种作用不出现于缺少Ca2+的培养基。
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本实验还观察到褪黑素(Mel)可部分阻断Aβ诱导的神经元钙超载。Mel作为体内一种激素，与人类衰老的病理生理有关。老年人群的Mel分泌水平降低，在AD病人则更低。由于Mel有强大的抗自由基作用，本实验间接支持Aβ神经毒性与氧化损伤有关。Mel可通过直接清除自由基、抑制脂质过氧化反应、保护DNA免受自由基攻击、增强其他抗氧化酶活性而对细胞起保护作用〔6〕。自由基可通过直接促进钙通道开放、刺激三磷酸肌醇依赖性钙释放、抑制钙泵使胞质中Ca2+浓度上升。外源给予Mel可清除自由基，提高钙泵活性，从而防止胞浆钙超载。由于Mel的激素活性，系统注射可迅速透过血脑屏障并达到每个神经元空间，是一种理想的中枢神经系统疾病治疗药物。我们的实验提供了Mel对抗Aβ神经毒性作用的证据，其他学者的研究也提示，Mel可防止Aβ诱导的培养神经元死亡〔7〕。因此有必要深入研究Mel对抗AD的作用机理。
本课题由中国博士后科学基金资助，国家973项目资助(编号G2000057005)。
, 百拇医药
参考文献
1，Yan XZ,Qiao JT,Dou Y,et al.β-Amyloid peptide fragment 31～35 induces apoptosis in cultured cortical neurons.Neuroscience 1998;92∶177～184.
2，刘昌焕，江云：钙与细胞损伤。国外医学生理、病理科学与临床分册 1999；19(3)∶210～213。
3，Arispe N, Rojas E, Pollard HB, et al .Alzheimer＇s disease amyloid beta protein forms calcium channels in bilayer membranes∶blockade by tromethamine and aluminium.Pro Natl Acad Sci USA 1993;90∶567～571.
, http://www.100md.com
4，Pascale A,Etcheberrigaray R.Calcium alterations in Alzheimer＇s disease∶pathophysiology,models and therapeutic opportunities.Pharmacological Res 1999;39(2)∶81～18.
5，Mattson MP, Cheng B, Davis D, et al.β amyloid peptides destabilize calcium homeostasis and render human cortical neurons vulnerable to excitotoxicity.J Neurosci 1992;12(2)∶376～389.
6 李经才，张扬，徐峰：褪黑素与衰老。生理科学进展 1997；28(1)∶76～79。
7，Pappolla MA, Sos M, Omar RA, et al.Melatonin prevents death of neuroblastoma cells exposed to the Alzheimer amyloid peptide.J Neurosci 1997;17(5)∶183～1690.
(收稿日期：2000-04-12), 百拇医药
单位：叶静(华西医科大学附属第一医院精神科)；张杰(移植免疫实验室 成都 610041)；李胜富(移植免疫实验室 成都 610041)；步宏(移植免疫实验室 成都 610041)；刘协和(华西医科大学附属第一医院精神科)
关键词：β淀粉样多肽；神经元；钙
华西医学000283
摘要：目的：观察人工合成的β淀粉样多肽(Aβ)对培养神经元细胞内游离钙([Ca2+]i)的影响以及褪黑素(Mel)的阻断作用。材料和方法：用激光扫描共聚焦显微镜技术，检测给予不同浓度(Aβ25～35和Mel后新生大鼠皮层培养神经元[Ca2+]i荧光强度。结果：神经元暴露Aβ25～350.5、1、10μmol/L环境后，[Ca2+]i荧光 与对照组比较均呈较有意义升高(P<0.05)；同时暴露Mel组，未见钙荧光强度升高。结论：Aβ25～35可诱导神经元[Ca2+]i升高，并呈剂量依赖性；预先给予Mel可部分阻断这种毒性作用。
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[中图分类号]R329.2+6 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(2000)02-0247-02
The Experimental Study of Intracellular Calcium Overload in Cultured Neuron of Rats Induced by β-Amyloid
YE Jing，ZHANG Jie，LI Sheng-fu，et al.
(The first University Hospital，West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041)
Abstract：objective:To observe the effects of β-Amyloid protein(Aβ P)on the intracellular free calcium ([Ca2+]i)concentration of neurons,and the blocked effect of Melatonin(Mel).Materials and Methods:[Ca2+]i fluorescent intensity of culture cortical neurons derived from newborn rats were measured,after exposed Aβ25～35 and Mel,by using Laser Scanning Confocal microscopy (LSCM) technique.Results:The [Ca2+]i fluorescence intensity was increasing after expose Aβ25～350.5，1.0，10.0μ mol/L(P<0.05)，but while exposed Mel,observed [Ca2+]i fluorescence intensity was not increasing.Conclusion:Aβ25～35 can increase the intracellular free calcium level in cultured neurons derived from newborn rats,and were concentration dependent,Mel can block this effect.
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Key words:β-Amyloid；Cultured Neuron；Calcium
β淀粉样多肽(Aβ Ρ)是Alzheimer病(AD)病理特征之一老年斑的核心物质，许多证据都支持Aβ对神经元的毒性作用，并且Aβ25～35是最具活性的片段，但Aβ究竟对神经元有哪些毒性，通过何种途径起作用尚不完全清楚。钙在神经精神活动中具有重要生理作用，作为细胞内第二信使与神经元的功能状态、细胞代谢和信号转导密切相关。钙参与神经的突触传递、递质释放、轴浆运输等。细胞内Ca2+平衡被打破，可引起一系列病理性级联反应，造成神经元损伤。褪黑素(Melatonin,Mel)是一种松果体激素，具有强大的抗自由基作用，老年人群和AD病人Mel分泌水平显著下降。由于Mel的抗衰老作用已被许多实验证实，Mel用于AD的治疗逐渐受到重视。但Mel的细胞生物学作用和在对抗AD神经元退行性变上所起的作用尚缺少更多的实验研究。本实验将培养新生大鼠皮层神经元暴露于Aβ25～35和Mel环境，用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术观察Aβ和Mel对神经元游离钙的影响，从而探讨Aβ毒性的可能机制和药物治疗途径。
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1 材料和方法
1.1 原代神经元培养 取生后24小时Wistar大鼠，75%乙醇消毒，分离大脑皮层，剪碎、吹打，胰蛋白酶消化，用含20%胎牛血清的DMEM培养基终止消化并洗涤，接种于铺有多聚赖氨酸的35MM培养皿，置于5%CO2培养箱37℃孵育；24小时后加阿糖胞苷(终浓度为10-5mol/L)，以抑制非神经元过度繁殖，每3天换液一次。
1.2 药物处理 将Aβ25～35(Sigma产品)稀释(250μl DMEM溶解250μg Aβ25～35)，37℃孵育24小时，可见白色纤维状物形成，即为聚集、老化的Aβ；Mel用100%乙醇溶解。按加入二种药物浓度分组(见表1)，孵育24小时。
1.3 胞浆钙荧光强度检测 细胞经DMEM洗涤后加荧光探针Fluo-3/AM，37℃孵育30分钟，再次洗涤后，LSCM检测。脂化成AM(乙酰羟甲基酯)的Fluo-3更易透过细胞膜，与Ca2+结合后发出荧光信号，经LSCM检测到的是胞浆游离钙荧光强度(F)，Fluo-3结合Ca2+越多，荧光信号值越高，由此判断胞浆游离钙水平。
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1.4 统计学处理：用SPSS软件进行方差分析、t检验和配对t检验。
2 结果
各组药物终浓度和Ca2+的荧光强度如表1。
表1.各组药物终浓度和Ca2+的荧光强度
A
B
C
D
E
F
G
, http://www.100md.com H
Aβ
对照组
0.5
0.5
1
1
10
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Mel
10
10
10
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F
137.35±20.34
136.73±19.45
157.68±21.12
137.45±30.34
165.39±30.24
150.90±20.12
200.93±32.28＃
154.88±28.56
注：1.A组为空白对照，只加DMEM培养基。
2.B-H各组加入Aβ或Mel的终浓度单位为μmol/L。
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3.F表示Ca2+的荧光信号值。
4.为与对照组比较P<0.05，＃为P<0.01。
经配对t检验，C组与D组、E组与F组、G组与H组比较P<0.05，均有较显著性差异，B组与A组比较无差异。说明正常状态下Mel对神经元胞浆Ca2+无影响，给予Aβ后胞浆Ca2+呈浓度依赖性升高，预先给予Mel可部分阻断这种毒性作用。
3 讨论
本实验获得了Aβ诱导神经元钙超载的直接证据，并观察到Mel的细胞保护作用。细胞钙稳态对维持正常神经元功能是重要的，一旦这种稳态平衡被打破，一时性细胞钙超载将促进不可逆的细胞死亡。迄今已有大量研究证明Aβ可诱导神经元死亡〔1〕，其毒性机理是复杂的，本实验观察到Aβ神经毒性作用的一个环节。细胞内游离钙增高可触发线粒体摄取Ca2+，从而抑制ATP合成，使能量生成障碍；Ca2+还可激活线粒体上磷脂酶，引起线粒体膜损伤，从而使线粒体对细胞氧化还原电位、渗透压、pH值和胞质内信号维持作用受损，最后导致细胞发生不可逆损伤〔2〕。Aβ导致细胞钙超载的机理目前认为是由于Aβ镶嵌于细胞膜脂质双层结构上，构成Ca2+通道，使Ca2+内流〔3〕。AβP的C末端105肽可形成非选择性离子通道，使Ca2+内流增加。活体研究发现，细胞内Ca2+持续性升高可导致神经元微管减少、丝状物聚集和tau蛋白增多、神经纤维缠结的免疫活性增加〔4〕。说明神经元Ca2+超载与Alzheimer病的病理密切相关。Mattson MP等〔5〕研究表明，Aβ的毒性作用是通过增加神经元对兴奋性氨基酸敏感性而实现，这依赖于Ca2+内流，因为这种作用不出现于缺少Ca2+的培养基。
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本实验还观察到褪黑素(Mel)可部分阻断Aβ诱导的神经元钙超载。Mel作为体内一种激素，与人类衰老的病理生理有关。老年人群的Mel分泌水平降低，在AD病人则更低。由于Mel有强大的抗自由基作用，本实验间接支持Aβ神经毒性与氧化损伤有关。Mel可通过直接清除自由基、抑制脂质过氧化反应、保护DNA免受自由基攻击、增强其他抗氧化酶活性而对细胞起保护作用〔6〕。自由基可通过直接促进钙通道开放、刺激三磷酸肌醇依赖性钙释放、抑制钙泵使胞质中Ca2+浓度上升。外源给予Mel可清除自由基，提高钙泵活性，从而防止胞浆钙超载。由于Mel的激素活性，系统注射可迅速透过血脑屏障并达到每个神经元空间，是一种理想的中枢神经系统疾病治疗药物。我们的实验提供了Mel对抗Aβ神经毒性作用的证据，其他学者的研究也提示，Mel可防止Aβ诱导的培养神经元死亡〔7〕。因此有必要深入研究Mel对抗AD的作用机理。
本课题由中国博士后科学基金资助，国家973项目资助(编号G2000057005)。
, 百拇医药
参考文献
1，Yan XZ,Qiao JT,Dou Y,et al.β-Amyloid peptide fragment 31～35 induces apoptosis in cultured cortical neurons.Neuroscience 1998;92∶177～184.
2，刘昌焕，江云：钙与细胞损伤。国外医学生理、病理科学与临床分册 1999；19(3)∶210～213。
3，Arispe N, Rojas E, Pollard HB, et al .Alzheimer＇s disease amyloid beta protein forms calcium channels in bilayer membranes∶blockade by tromethamine and aluminium.Pro Natl Acad Sci USA 1993;90∶567～571.
, http://www.100md.com
4，Pascale A,Etcheberrigaray R.Calcium alterations in Alzheimer＇s disease∶pathophysiology,models and therapeutic opportunities.Pharmacological Res 1999;39(2)∶81～18.
5，Mattson MP, Cheng B, Davis D, et al.β amyloid peptides destabilize calcium homeostasis and render human cortical neurons vulnerable to excitotoxicity.J Neurosci 1992;12(2)∶376～389.
6 李经才，张扬，徐峰：褪黑素与衰老。生理科学进展 1997；28(1)∶76～79。
7，Pappolla MA, Sos M, Omar RA, et al.Melatonin prevents death of neuroblastoma cells exposed to the Alzheimer amyloid peptide.J Neurosci 1997;17(5)∶183～1690.
(收稿日期：2000-04-12), 百拇医药