大鼠骶尾腹内侧肌的运动神经分布——CB-HRP、CB-胶体金结合CGRP免疫组织化学双标法研究*
作者：陈幽婷** 石葛明 童江 万选才
单位：石葛明 童江 万选才(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)陈幽婷(江苏徐州医学院神经解剖学研究室，徐州)
关键词：骶尾腹内侧肌；神经分布；Onuf核；大鼠
解剖学报990107
【摘要】 目的 通过研究Onuf核靶肌肉的神经分布特点，探讨在某些运动神经元疾病中，Onuf核及其靶肌肉功能不受影响的生理机制。 方法 应用CB-HRP逆行示踪技术及CB-胶体金逆行示踪结合CGRP免疫组织化学双标技术，观察了支配大鼠骶尾腹内侧肌的运动神经元在脊髓内的定位分布。 结果 首次发现该肌的神经分布方式与会阴肌的神经分布相同，即同时接受脊髓前角躯体运动神经元和Onuf核神经元的双重支配。其中有63.40%位于L6～S3前角的腹侧群，22.30%位于Onuf核的背外侧群，14.30%位于Onuf核的背内侧群。各核群内支配该肌的神经元约50%为CGRP阳性神经元。另外，支配该肌的上述两种运动神经元在L6～S3节段软脊膜处特定部位形成丰富的软脊膜下树突丛。 结论 实验证实了骶尾腹内侧肌不但是Onuf核最大的靶肌肉，而且支配该肌的运动神经元具有丰富的软脊膜下树突丛，从而为深入探讨Onuf核的神经化学以及神经病理学提供了新的研究范围。
, 百拇医药
INNERVATION OF MUSCULUS SACROCOCCYGEUS VENTRALIS
MEDIALIS IN RAT——CB-HRP,CB-COLLOID GOLD ——CB-HRP,CB-COLLOID GOLD
COMBINED WITH CGRP IMMUNOCYTOCHEMISTRY
DOUBLE-LABELED TECHNIQUE*
Chen Youting**，Shi Geming，Tong Jiang，Wang Xuancai△
(Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing;
, 百拇医药
Deparment of Neuroanatomy,XuZhou Medical College,XuZhou Jiangsu)
【Abstract】 Objective To explore the mechanism of that Onuf's nucleus and its target muscles were not involoved in some motoneuronal diseases,the speciality of innervation in target muscle of Onuf's was studied.Methods Employing cholera toxin B-subunit combined horseradish peroxidase (CB-HRP) retrograde tracing technique and cholera toxin B-subunit combined colloid gold(CB-G)retrograde tracing with calcitonin gene-related peptide(CGRP)immunohistochemical double-labeled staining technique,the innervation of musculus sacrococcygeus ventralis medialis(SCVM)in rats was studied.Results We found firstly that the SCVM was innervated by both somatic motor neurons of ventral group and Onuf's nucleus in ventral horn of the spinal cord,which is similar as perineal muscles,that means double innervation.In all of the labeled-cells,63.40% of which were located in ventral group of ventral horn of L6-S3,22.30% in dorsal lateral group and 14.30% in dorsal medial group of Onuf's nucleus.About 50% of neurons innervating SCVM were CGRP positive in each group.On the side these labeled neurons formed rich dendritic plexes beneath pia mater in L6-S3 segment.Conclusion It proved that the SCVM is not only the largist of target muscles of Onuf's,but also it possesses rich sub-pia dendritic plexes,those specialities would prove a new research field for us exploring the special neurochemical and neuropathologic changes in some motoneuronal diseases.
, http://www.100md.com
【Key words】 Musculus sacrococcygsus ventralis medialis;Innervation;Onufs nucleus;Rat
大鼠骶尾腹内侧肌又称荐尾腹侧中肌(musculus sacrococcygeus ventralis medialis)或屈尾短肌(musculus floexor caudae brevis),是位于盆腔后壁、骶椎前方的一对梭形肌肉，属尾肌群，因其功能似乎仅为屈尾，故至今尚未引起人们的注意，而与该肌位置关系较密切的会阴肌因在某些运动神经元疾患时仍可保持其正常生理功能而一直受到神经工作者的关注，尤其是近年来有诸多文献报道了会阴肌的神经支配、相关神经元的细胞构筑、神经递质和神经调质的分布以及纤维联系特点[1～10]，藉以探讨运动神经元疾病的神经病理学。我们的实验发现了骶尾腹内侧肌的神经分布与会阴肌相同，即受脊髓腹侧角运动神经元腹侧群和Onuf核的双重神经支配，至今尚未见国内外有报道。
, 百拇医药
材料和方法
1.动物分组及试剂
实验用Wistar大鼠(中国医学科学院繁育场提供)20只，雄性，体重150～250g，分为3组，A组：骶尾腹内侧肌CB-HRP注射组(n=10);B组：骶尾背内侧肌CB-HRP注射组(n=4)；C组：骶尾腹内侧肌CB-胶体金注射复合CGRP免疫组织化学双标组(n=6)。
本实验所用CB-HRP和CB-胶体金(金颗粒平均直径7nm,CB含量1.47g/L)均为中国医学科学院基础医学研究所神经生物学教研室自制。
2.手术及取材
动物行戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg,腹腔注射)，A、C组仰卧位固定，做会阴部切口，经直肠后间隙找到位于骶骨腹侧的骶尾腹内侧肌，用微量注射器向一侧肌肉内行单针孔多点注射，A组注射CB-HRP10μl/只，C组注射CB-胶体金100μl/只，注射完毕留针5min后，针孔处作双重结扎，以免药液外漏。B组俯卧位固定，切开骶骨背侧皮肤，取上述相同进针方式，向一侧骶尾背内侧肌注射CB-HRP10μl/只。
, 百拇医药
A、B组存活72h，C组存活120h，戊巴比妥钠深麻下(60mg/kg,腹腔注射)行左心室-升主动脉穿心灌注。A、B组先灌注生理盐水150ml/只，继之以混合固定液(1%多聚甲醛、1.25%戊二醛，0.1mol/L PB配制，pH7.4)350ml/只；C组灌注生理盐水50ml/只，混合固定液(4% 多聚甲醛、0.25%戊二醛，0.1mol/L PB配制，pH7.4)300ml/只，灌毕取L3至全部骶髓，原液后固定2h(4℃)，然后入30%蔗糖磷酸缓冲液中过夜(4℃)，次日行冰冻连续切片，片厚40μm，收集于5%蔗糖磷酸缓冲液中备用。
3.显色反应及免疫组织化学反应
A、B组切片充分漂洗后行TMB-硝普钠反应显色[11]，顺序贴片、干燥、复染、透明封片，光镜下明、暗视野观察计数并摄片。
C组切片充分漂洗后先行银加强染色[12]，然后取L6～S3节段的加强后切片进行CGRP-免疫组织化学反应。CGRP一抗(Cambridge Research Biochemical Limited)稀释度1∶4 000，4℃孵育48h；生物素化二抗(DaKo Ltd.)稀释度1∶400，室温孵育4h；0.3%H2O2和甲醇混合液浸片30min，然后用1∶400过氧化物酶结合链球菌亲和素(peroxidase-conjugated streptavidin DaKo Ltd.)室温孵育2h;DAB/H2O2呈色5～10min。铬矾明胶贴片，干燥后脱水透明、封固。光镜下观察结果并计数、摄片。
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结 果
三组动物脊髓内逆行标记的神经元绝大多数位于L6～S3腹侧角。
1.骶尾腹内侧肌CB-HRP注射组(A组)
除腹侧角腹侧群(V群)大运动神经元被标记之外，Onuf核的两群——背内侧群(DM群)和背外侧群(DL群)神经元均被标记，各群标记神经元数目如表1所示。在横切面上，V群标记神经元树突呈放射状分布，显示出3种走向：a.行向外侧索前份，树突末端在外侧索前份软脊膜下形成树突丛(图1，2)；b.经白质前连合行向对侧前索，并有树突末端在前正中裂处软脊膜下形成树突丛(图3)；c.行向X板层和背连合核处，树突末端围绕在中央管周围(图3)。
表1 A组标记神经元的分布及数目
Table 1 The distribution and number of the labeled neurons in group A 鼠号
, 百拇医药
No.
腹侧群
V
背内侧群
DM
背外侧群
DL
合计
total
R-1
143
35
50
, 百拇医药 228
R-2
125
28
46
119
R-5
165
41
56
262
R-10
142
32
, http://www.100md.com
52
226
R-11
146
30
47
223
R-17
154
31
57
242
total
, http://www.100md.com
875
197
308
1 380
%
63.40
14.28
22.32
100
Onuf核DM群的树突一部分向背连合核的方向行走，一部分聚集成束行向V群和DL群的方向(图4)；DL群的树突束一部分行向背外侧，末端在外侧索后份的软脊膜下形成树突丛(图5)，一部分行向腹内侧与V群和DM群的树突束相混。
, http://www.100md.com 2.骶尾背内侧肌CB-HRP注射组(B组)
该组标记神经元所在脊髓节段虽与A组相同，但仅见腹侧角V群神经元被标记(表2)，且标记神经元树突向背侧呈放射状分布，其形式与A组明显不同，而且未见任何区域有软脊膜下树突丛形成(图6)。
表2 B组标记神经元的分布及数目
Table 2 The distribution and number of the labeled neurons in group B 鼠号
No.
腹侧群
V
背内侧群
DM
, 百拇医药
背外侧群
DL
合计
total
R-6
132
0
0
132
R-8
156
0
0
, 百拇医药 156
R-19
150
0
0
150
R-20
145
0
0
145
total
583
0
, 百拇医药
0
583
3.骶尾腹内侧肌CB-胶体金注射复合CGRP双标染色组(C组)
单纯CGRP免疫反应性神经元出现于腹侧角各核群内(图7)，CB-胶体金注射复合CGRP双标染色组内的CB-胶体金阳性神经元出现情况同A组，但标记树突短(图8～11)。计数该组大鼠的双标神经元出现率，发现各核群内CB-胶体金——CGRP双标神经元均约占该核胶体金标记神经元总数的50%。
讨 论
目前对大鼠脊髓腰骶段腹侧角运动神经元的细胞构筑研究较为清楚：大鼠L6～S2腹侧角运动神经元分化为4个独立的细胞群，即背内侧群(dorsomedial group DM)，又称为球海绵体肌脊核(spinal nucleus of bulbocavenous muscle)、背外侧群(dorsolateral group DL)、腹侧群(ventral group V)和背后外侧群(retrodorsal lateral group RD)，并已证明DL和DM与人的Onuf核或称Romanes Y核为同源核群[1～3]，支配着会阴部与排泄和生殖有关的横纹肌。在某些运动神经元疾病如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(myoatrophic lateral sclerosis)以及脊髓灰质炎(poliomyelitis)的病人，受侵段脊髓腹侧角运动神经元受损，躯体运动功能丧失，或完全被淋巴细胞浸润(急性)、胶质细胞代替(慢性、后遗症)，唯有Ounf核完好存在，不受累及且其靶肌肉仍能维持正常的排泄和生殖功能[1，4，13，14]。目前根据研究推测Ounf核可能是具有躯体运动和内脏运动双重功能的核团或其本身就是自主性核团[5]，而且大脑皮质对Onuf核的支配也不同于其他腹侧角躯体运动性神经元，从大脑皮质第4区下行的皮质脊髓束纤维直接投射到双侧的Onuf核[6]。用AChE和Timm重金属染色两种组织化学法观察到DM和DL内的神经纤维网与其他部位运动神经元的神经纤维网也不尽相同[2]。
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作为调质的降钙素基因相关肽(CGRP)为37个氨基酸的神经肽，主要位于脊髓腹侧角的运动神经元和交感及副交感神经元[7]，其生理机能虽然尚未完全明确，但可看做是运动神经元功能状态的一个指标[15]。本实验计数出支配骶尾腹内侧肌的运动神经元约有50%为CGRP阳性神经元，这同支配会阴肌神经元的CGRP阳性率完全一致[7]，因此推测两者不但在神经分布上相同，在功能上可能也有相似之处。
在我们的实验中，Onuf核及V群内标记神经元的树突走向同其他人观察到的会阴肌支配神经元的树突走向基本一致，但树突终末在脊髓特定部位所形成的软脊膜下树突丛却未见有报道。为了排除由于试剂、反应步骤等人为因素所造成的假象，本实验还同时选取趾长伸肌和胫骨前肌同时进行注射、取材、切片和反应，并未见支配上述两肌的标记神经元有明显的软脊膜下树突丛出现，而支配骶尾腹内侧肌的标记神经元则显示出特别丰富的软脊膜下树突丛，这些丰富的软脊膜下树突丛与脑脊液系统的位置关系极为密切，但其生理意义目前尚无详细的研究资料能解释。另外，三群核团间密切交织的树突束可能是各核团协调活动的形态学基础，这种树突束的连接方式及冲动的传导也有待进一步探讨。
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骶尾背内侧肌位于骶骨背面，也属尾肌群，与骶尾腹内侧肌在位置上相对应、功能上相拮抗、支配神经元所在脊髓节段相同，且脊髓腹侧角V群神经元对这两块肌肉的分布密度也无差异性(P>0.05)，但该肌的神经分布形式则与躯干四肢肌的一致，从神经元的分布到突起走向都不同于骶尾腹内侧肌及会阴肌，体现出两者的神经支配可能存在质的区别。这也可以推导骶尾腹内侧肌除对尾的运动外，可能在功能上与会阴肌有相同之处，而有别于其他躯干横纹肌。
鉴于骶尾腹内侧肌在神经分布上的特点，又是Onuf核所支配的一对最大的肌肉，从而为深入探讨Onuf核的神经化学以及神经病理学提供了新的研究范围。
图版说明
图1 S3吻侧端，A组V群CB-HRP阳性神经元树突在外侧索腹侧份边缘形成的软脊膜下树突丛(↑) ×375
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图2 S3尾侧端，A组V群CB-HRP阳性神经元树突在外侧索腹侧份边缘形成的软脊膜下树突丛(↑) ×375
图3 S3吻侧端，A组V群CB-HRP阳性神经元树突在前正中裂处形成的软脊膜下树突丛(↑)以及围绕在中央管(ñ)周围的树突终末 ×375
图4 S1节段，DM群内(a)CB-HRP阳性神经元树突走向(b:DL群 暗视野) ×120
图5 S1节段，DL群内CB-HRP阳性神经元树突在外侧索背侧份边缘形成的软脊膜下树突丛(↑) ×600
图6 S3节段，B组V群CB-HRP阳性神经元树突向背侧呈放射状分布 ×200
, http://www.100md.com 图7 S1节段，单纯CGRP免疫反应性神经元和纤维分布情况(a.DM群 b.DL群 c.RD群 V.V群) ×120
图8 S1节段，C组CB-胶体金-CGRP双标法切片腹侧角处神经元分布情况 ×375
图9 图8中DL群内的CGRP单标神经元(+)和胶体金单标神经元(*) ×1 500
图10 V群内的CB-胶体金-CGRP双标神经元 ×1 500
图11 DM群内的CB-胶体金单标神经元(*)(CC：中央管) ×1 500
Fig.1 oral end of S3,CB-HRP positive cells in V group formed sub-pia mater dendrits in margin of ventral part of lateral funiculus( ↑ )×375
, 百拇医药
Fig.2 caudal end of S\-3,CB-HRP positive cells in V group formed sub-pia mater dendrits in margin of ventral part of lateral funiculus( ↑ )×375
Fig.3 oral end of S\-3,CB-HRP positive cells in V group formed sub-mater dendrites in anterior median fissure( ↑ )and dendrites in around the central cencal (↑)×375
Fig.4 segnent S1,dendric distribution of CB-HRP positive cells on DM group(a)(b:DL group dark field)×120
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Fig.5 segment S1,CB-HRP positive cells in DL group formed sub-pia mater dendrits in margin of dorsal part of lateral funiculus.( ↑ )×600
Fig.6 segment S3,dentrites of CB-HRP positive cells in V group radiate towards the dorsal part of S3 in experimetnal group B×200
Fig.7 single CGRP immunorective positive cells and fibers in segment S1 (a:DM group,b:DM group,c:RD group,v:V grooup)×120
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Fig.8 segnent S1,DM,DL and V groups in ventral horn in CB-G-CGRP staining×375
Fig.9 CGRP positive cells (+) and CB-G positive cell(*) in DL group in Fig.8×1 500
Fig.10 CB-G-CGRP double-labled cell in V group ×1 500
Fig.11 CG-G pisitive cell in DM group(*)(CC:central cancal)×1 500
* 美国中华医学会CMB基金和江苏省中医药管理局科研基金资助课题(No.95015)
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△ Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005,China
参考文献
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收稿1997-06 修回1998-05, 百拇医药(陈幽婷** 石葛明 童江 万选才)
单位：石葛明 童江 万选才(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)陈幽婷(江苏徐州医学院神经解剖学研究室，徐州)
关键词：骶尾腹内侧肌；神经分布；Onuf核；大鼠
解剖学报990107
【摘要】 目的 通过研究Onuf核靶肌肉的神经分布特点，探讨在某些运动神经元疾病中，Onuf核及其靶肌肉功能不受影响的生理机制。 方法 应用CB-HRP逆行示踪技术及CB-胶体金逆行示踪结合CGRP免疫组织化学双标技术，观察了支配大鼠骶尾腹内侧肌的运动神经元在脊髓内的定位分布。 结果 首次发现该肌的神经分布方式与会阴肌的神经分布相同，即同时接受脊髓前角躯体运动神经元和Onuf核神经元的双重支配。其中有63.40%位于L6～S3前角的腹侧群，22.30%位于Onuf核的背外侧群，14.30%位于Onuf核的背内侧群。各核群内支配该肌的神经元约50%为CGRP阳性神经元。另外，支配该肌的上述两种运动神经元在L6～S3节段软脊膜处特定部位形成丰富的软脊膜下树突丛。 结论 实验证实了骶尾腹内侧肌不但是Onuf核最大的靶肌肉，而且支配该肌的运动神经元具有丰富的软脊膜下树突丛，从而为深入探讨Onuf核的神经化学以及神经病理学提供了新的研究范围。
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INNERVATION OF MUSCULUS SACROCOCCYGEUS VENTRALIS
MEDIALIS IN RAT——CB-HRP,CB-COLLOID GOLD ——CB-HRP,CB-COLLOID GOLD
COMBINED WITH CGRP IMMUNOCYTOCHEMISTRY
DOUBLE-LABELED TECHNIQUE*
Chen Youting**，Shi Geming，Tong Jiang，Wang Xuancai△
(Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing;
, 百拇医药
Deparment of Neuroanatomy,XuZhou Medical College,XuZhou Jiangsu)
【Abstract】 Objective To explore the mechanism of that Onuf's nucleus and its target muscles were not involoved in some motoneuronal diseases,the speciality of innervation in target muscle of Onuf's was studied.Methods Employing cholera toxin B-subunit combined horseradish peroxidase (CB-HRP) retrograde tracing technique and cholera toxin B-subunit combined colloid gold(CB-G)retrograde tracing with calcitonin gene-related peptide(CGRP)immunohistochemical double-labeled staining technique,the innervation of musculus sacrococcygeus ventralis medialis(SCVM)in rats was studied.Results We found firstly that the SCVM was innervated by both somatic motor neurons of ventral group and Onuf's nucleus in ventral horn of the spinal cord,which is similar as perineal muscles,that means double innervation.In all of the labeled-cells,63.40% of which were located in ventral group of ventral horn of L6-S3,22.30% in dorsal lateral group and 14.30% in dorsal medial group of Onuf's nucleus.About 50% of neurons innervating SCVM were CGRP positive in each group.On the side these labeled neurons formed rich dendritic plexes beneath pia mater in L6-S3 segment.Conclusion It proved that the SCVM is not only the largist of target muscles of Onuf's,but also it possesses rich sub-pia dendritic plexes,those specialities would prove a new research field for us exploring the special neurochemical and neuropathologic changes in some motoneuronal diseases.
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【Key words】 Musculus sacrococcygsus ventralis medialis;Innervation;Onufs nucleus;Rat
大鼠骶尾腹内侧肌又称荐尾腹侧中肌(musculus sacrococcygeus ventralis medialis)或屈尾短肌(musculus floexor caudae brevis),是位于盆腔后壁、骶椎前方的一对梭形肌肉，属尾肌群，因其功能似乎仅为屈尾，故至今尚未引起人们的注意，而与该肌位置关系较密切的会阴肌因在某些运动神经元疾患时仍可保持其正常生理功能而一直受到神经工作者的关注，尤其是近年来有诸多文献报道了会阴肌的神经支配、相关神经元的细胞构筑、神经递质和神经调质的分布以及纤维联系特点[1～10]，藉以探讨运动神经元疾病的神经病理学。我们的实验发现了骶尾腹内侧肌的神经分布与会阴肌相同，即受脊髓腹侧角运动神经元腹侧群和Onuf核的双重神经支配，至今尚未见国内外有报道。
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材料和方法
1.动物分组及试剂
实验用Wistar大鼠(中国医学科学院繁育场提供)20只，雄性，体重150～250g，分为3组，A组：骶尾腹内侧肌CB-HRP注射组(n=10);B组：骶尾背内侧肌CB-HRP注射组(n=4)；C组：骶尾腹内侧肌CB-胶体金注射复合CGRP免疫组织化学双标组(n=6)。
本实验所用CB-HRP和CB-胶体金(金颗粒平均直径7nm,CB含量1.47g/L)均为中国医学科学院基础医学研究所神经生物学教研室自制。
2.手术及取材
动物行戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg,腹腔注射)，A、C组仰卧位固定，做会阴部切口，经直肠后间隙找到位于骶骨腹侧的骶尾腹内侧肌，用微量注射器向一侧肌肉内行单针孔多点注射，A组注射CB-HRP10μl/只，C组注射CB-胶体金100μl/只，注射完毕留针5min后，针孔处作双重结扎，以免药液外漏。B组俯卧位固定，切开骶骨背侧皮肤，取上述相同进针方式，向一侧骶尾背内侧肌注射CB-HRP10μl/只。
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A、B组存活72h，C组存活120h，戊巴比妥钠深麻下(60mg/kg,腹腔注射)行左心室-升主动脉穿心灌注。A、B组先灌注生理盐水150ml/只，继之以混合固定液(1%多聚甲醛、1.25%戊二醛，0.1mol/L PB配制，pH7.4)350ml/只；C组灌注生理盐水50ml/只，混合固定液(4% 多聚甲醛、0.25%戊二醛，0.1mol/L PB配制，pH7.4)300ml/只，灌毕取L3至全部骶髓，原液后固定2h(4℃)，然后入30%蔗糖磷酸缓冲液中过夜(4℃)，次日行冰冻连续切片，片厚40μm，收集于5%蔗糖磷酸缓冲液中备用。
3.显色反应及免疫组织化学反应
A、B组切片充分漂洗后行TMB-硝普钠反应显色[11]，顺序贴片、干燥、复染、透明封片，光镜下明、暗视野观察计数并摄片。
C组切片充分漂洗后先行银加强染色[12]，然后取L6～S3节段的加强后切片进行CGRP-免疫组织化学反应。CGRP一抗(Cambridge Research Biochemical Limited)稀释度1∶4 000，4℃孵育48h；生物素化二抗(DaKo Ltd.)稀释度1∶400，室温孵育4h；0.3%H2O2和甲醇混合液浸片30min，然后用1∶400过氧化物酶结合链球菌亲和素(peroxidase-conjugated streptavidin DaKo Ltd.)室温孵育2h;DAB/H2O2呈色5～10min。铬矾明胶贴片，干燥后脱水透明、封固。光镜下观察结果并计数、摄片。
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结 果
三组动物脊髓内逆行标记的神经元绝大多数位于L6～S3腹侧角。
1.骶尾腹内侧肌CB-HRP注射组(A组)
除腹侧角腹侧群(V群)大运动神经元被标记之外，Onuf核的两群——背内侧群(DM群)和背外侧群(DL群)神经元均被标记，各群标记神经元数目如表1所示。在横切面上，V群标记神经元树突呈放射状分布，显示出3种走向：a.行向外侧索前份，树突末端在外侧索前份软脊膜下形成树突丛(图1，2)；b.经白质前连合行向对侧前索，并有树突末端在前正中裂处软脊膜下形成树突丛(图3)；c.行向X板层和背连合核处，树突末端围绕在中央管周围(图3)。
表1 A组标记神经元的分布及数目
Table 1 The distribution and number of the labeled neurons in group A 鼠号
, 百拇医药
No.
腹侧群
V
背内侧群
DM
背外侧群
DL
合计
total
R-1
143
35
50
, 百拇医药 228
R-2
125
28
46
119
R-5
165
41
56
262
R-10
142
32
, http://www.100md.com
52
226
R-11
146
30
47
223
R-17
154
31
57
242
total
, http://www.100md.com
875
197
308
1 380
%
63.40
14.28
22.32
100
Onuf核DM群的树突一部分向背连合核的方向行走，一部分聚集成束行向V群和DL群的方向(图4)；DL群的树突束一部分行向背外侧，末端在外侧索后份的软脊膜下形成树突丛(图5)，一部分行向腹内侧与V群和DM群的树突束相混。
, http://www.100md.com 2.骶尾背内侧肌CB-HRP注射组(B组)
该组标记神经元所在脊髓节段虽与A组相同，但仅见腹侧角V群神经元被标记(表2)，且标记神经元树突向背侧呈放射状分布，其形式与A组明显不同，而且未见任何区域有软脊膜下树突丛形成(图6)。
表2 B组标记神经元的分布及数目
Table 2 The distribution and number of the labeled neurons in group B 鼠号
No.
腹侧群
V
背内侧群
DM
, 百拇医药
背外侧群
DL
合计
total
R-6
132
0
0
132
R-8
156
0
0
, 百拇医药 156
R-19
150
0
0
150
R-20
145
0
0
145
total
583
0
, 百拇医药
0
583
3.骶尾腹内侧肌CB-胶体金注射复合CGRP双标染色组(C组)
单纯CGRP免疫反应性神经元出现于腹侧角各核群内(图7)，CB-胶体金注射复合CGRP双标染色组内的CB-胶体金阳性神经元出现情况同A组，但标记树突短(图8～11)。计数该组大鼠的双标神经元出现率，发现各核群内CB-胶体金——CGRP双标神经元均约占该核胶体金标记神经元总数的50%。
讨 论
目前对大鼠脊髓腰骶段腹侧角运动神经元的细胞构筑研究较为清楚：大鼠L6～S2腹侧角运动神经元分化为4个独立的细胞群，即背内侧群(dorsomedial group DM)，又称为球海绵体肌脊核(spinal nucleus of bulbocavenous muscle)、背外侧群(dorsolateral group DL)、腹侧群(ventral group V)和背后外侧群(retrodorsal lateral group RD)，并已证明DL和DM与人的Onuf核或称Romanes Y核为同源核群[1～3]，支配着会阴部与排泄和生殖有关的横纹肌。在某些运动神经元疾病如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(myoatrophic lateral sclerosis)以及脊髓灰质炎(poliomyelitis)的病人，受侵段脊髓腹侧角运动神经元受损，躯体运动功能丧失，或完全被淋巴细胞浸润(急性)、胶质细胞代替(慢性、后遗症)，唯有Ounf核完好存在，不受累及且其靶肌肉仍能维持正常的排泄和生殖功能[1，4，13，14]。目前根据研究推测Ounf核可能是具有躯体运动和内脏运动双重功能的核团或其本身就是自主性核团[5]，而且大脑皮质对Onuf核的支配也不同于其他腹侧角躯体运动性神经元，从大脑皮质第4区下行的皮质脊髓束纤维直接投射到双侧的Onuf核[6]。用AChE和Timm重金属染色两种组织化学法观察到DM和DL内的神经纤维网与其他部位运动神经元的神经纤维网也不尽相同[2]。
, 百拇医药
作为调质的降钙素基因相关肽(CGRP)为37个氨基酸的神经肽，主要位于脊髓腹侧角的运动神经元和交感及副交感神经元[7]，其生理机能虽然尚未完全明确，但可看做是运动神经元功能状态的一个指标[15]。本实验计数出支配骶尾腹内侧肌的运动神经元约有50%为CGRP阳性神经元，这同支配会阴肌神经元的CGRP阳性率完全一致[7]，因此推测两者不但在神经分布上相同，在功能上可能也有相似之处。
在我们的实验中，Onuf核及V群内标记神经元的树突走向同其他人观察到的会阴肌支配神经元的树突走向基本一致，但树突终末在脊髓特定部位所形成的软脊膜下树突丛却未见有报道。为了排除由于试剂、反应步骤等人为因素所造成的假象，本实验还同时选取趾长伸肌和胫骨前肌同时进行注射、取材、切片和反应，并未见支配上述两肌的标记神经元有明显的软脊膜下树突丛出现，而支配骶尾腹内侧肌的标记神经元则显示出特别丰富的软脊膜下树突丛，这些丰富的软脊膜下树突丛与脑脊液系统的位置关系极为密切，但其生理意义目前尚无详细的研究资料能解释。另外，三群核团间密切交织的树突束可能是各核团协调活动的形态学基础，这种树突束的连接方式及冲动的传导也有待进一步探讨。
, 百拇医药
骶尾背内侧肌位于骶骨背面，也属尾肌群，与骶尾腹内侧肌在位置上相对应、功能上相拮抗、支配神经元所在脊髓节段相同，且脊髓腹侧角V群神经元对这两块肌肉的分布密度也无差异性(P>0.05)，但该肌的神经分布形式则与躯干四肢肌的一致，从神经元的分布到突起走向都不同于骶尾腹内侧肌及会阴肌，体现出两者的神经支配可能存在质的区别。这也可以推导骶尾腹内侧肌除对尾的运动外，可能在功能上与会阴肌有相同之处，而有别于其他躯干横纹肌。
鉴于骶尾腹内侧肌在神经分布上的特点，又是Onuf核所支配的一对最大的肌肉，从而为深入探讨Onuf核的神经化学以及神经病理学提供了新的研究范围。
图版说明
图1 S3吻侧端，A组V群CB-HRP阳性神经元树突在外侧索腹侧份边缘形成的软脊膜下树突丛(↑) ×375
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图2 S3尾侧端，A组V群CB-HRP阳性神经元树突在外侧索腹侧份边缘形成的软脊膜下树突丛(↑) ×375
图3 S3吻侧端，A组V群CB-HRP阳性神经元树突在前正中裂处形成的软脊膜下树突丛(↑)以及围绕在中央管(ñ)周围的树突终末 ×375
图4 S1节段，DM群内(a)CB-HRP阳性神经元树突走向(b:DL群 暗视野) ×120
图5 S1节段，DL群内CB-HRP阳性神经元树突在外侧索背侧份边缘形成的软脊膜下树突丛(↑) ×600
图6 S3节段，B组V群CB-HRP阳性神经元树突向背侧呈放射状分布 ×200
, http://www.100md.com 图7 S1节段，单纯CGRP免疫反应性神经元和纤维分布情况(a.DM群 b.DL群 c.RD群 V.V群) ×120
图8 S1节段，C组CB-胶体金-CGRP双标法切片腹侧角处神经元分布情况 ×375
图9 图8中DL群内的CGRP单标神经元(+)和胶体金单标神经元(*) ×1 500
图10 V群内的CB-胶体金-CGRP双标神经元 ×1 500
图11 DM群内的CB-胶体金单标神经元(*)(CC：中央管) ×1 500
Fig.1 oral end of S3,CB-HRP positive cells in V group formed sub-pia mater dendrits in margin of ventral part of lateral funiculus( ↑ )×375
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Fig.2 caudal end of S\-3,CB-HRP positive cells in V group formed sub-pia mater dendrits in margin of ventral part of lateral funiculus( ↑ )×375
Fig.3 oral end of S\-3,CB-HRP positive cells in V group formed sub-mater dendrites in anterior median fissure( ↑ )and dendrites in around the central cencal (↑)×375
Fig.4 segnent S1,dendric distribution of CB-HRP positive cells on DM group(a)(b:DL group dark field)×120
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Fig.5 segment S1,CB-HRP positive cells in DL group formed sub-pia mater dendrits in margin of dorsal part of lateral funiculus.( ↑ )×600
Fig.6 segment S3,dentrites of CB-HRP positive cells in V group radiate towards the dorsal part of S3 in experimetnal group B×200
Fig.7 single CGRP immunorective positive cells and fibers in segment S1 (a:DM group,b:DM group,c:RD group,v:V grooup)×120
, 百拇医药
Fig.8 segnent S1,DM,DL and V groups in ventral horn in CB-G-CGRP staining×375
Fig.9 CGRP positive cells (+) and CB-G positive cell(*) in DL group in Fig.8×1 500
Fig.10 CB-G-CGRP double-labled cell in V group ×1 500
Fig.11 CG-G pisitive cell in DM group(*)(CC:central cancal)×1 500
* 美国中华医学会CMB基金和江苏省中医药管理局科研基金资助课题(No.95015)
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△ Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005,China
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收稿1997-06 修回1998-05, 百拇医药(陈幽婷** 石葛明 童江 万选才)