大鼠β防御素rBD-1的cDNA克隆
作者：黄宁 唐彬 陈新年 吴琦 王伯瑶
单位：华西医科大学病生教研室、感染免疫研究室 (成都 610041)
关键词：
大鼠β防御素rBD 目前已在人体中证实有α、β两类防御素。尤其引人注目的是新近发现β-防御素在粘膜上皮广泛表达，其功能失活与病原微生物定植、集落于粘膜上皮而导致严重的粘膜感染关系密切。建立合适的动物模型以研究β-防御素在宿主粘膜屏障抵御病原微生物侵袭中的作用，意义重大。大鼠为常用的实验动物，本文报道大鼠β-防御素-1的cDNA克隆。根据Gene Bank大鼠rBD-1 cDNA序列(登录号为AF068860)设计特异引物：M15’
3’ACT CTG GAC CCT GAC TTC ACC G；M25’3’CCC TTG CTT GTC CTT TAT GTC C。从Wistar大鼠肾脏组织提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增大鼠β-防御素rBD-1 cDNA。RT-PCR反应条件如下：50℃保温30 min，使mRNA逆转录为cDNA；94℃预变性2 min，然后进行30个PCR循环：94℃ 30 s，58℃退火30 s，68℃延伸45 s；最后在68℃继续延伸7 min。RT-PCR扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检查有一约272 kb条带。其产物纯化后，用T4-DNA连接酶将其与pGEM-T easy载体连接，连接反应物转化宿主菌JM109感受态细胞，进行亚克隆筛选。然后用ABI PRISM 377 DNA自动测序仪测定其cDNA序列。根据其cDNA序列推导其氨基酸顺序，并与小鼠、人β-防御素氨基酸序列进行排列比较，显示三者均包含保守的氨基酸残基及典型的6个半胱氨酸残基。证明其克隆的大鼠cDNA片段为β-防御素-1。在PCR反应体系中，Taq DNA聚合酶常在扩增的PCR产物dsDNA每条链的3’末端多加上一个非模板依赖的dA碱基，使平端连接极为困难，解决这一难题的有效方法之一是构建T-载体。pGEM-T easy载体系统用EcoR V切割pGEM-T easy载体，并在dsDNA平端的3’再加上一个dT碱基，一方面阻止其自身环化，另一方面通过AT配对即可将载体与PCR产物直接连接。, http://www.100md.com
单位：华西医科大学病生教研室、感染免疫研究室 (成都 610041)
关键词：
大鼠β防御素rBD 目前已在人体中证实有α、β两类防御素。尤其引人注目的是新近发现β-防御素在粘膜上皮广泛表达，其功能失活与病原微生物定植、集落于粘膜上皮而导致严重的粘膜感染关系密切。建立合适的动物模型以研究β-防御素在宿主粘膜屏障抵御病原微生物侵袭中的作用，意义重大。大鼠为常用的实验动物，本文报道大鼠β-防御素-1的cDNA克隆。根据Gene Bank大鼠rBD-1 cDNA序列(登录号为AF068860)设计特异引物：M15’
3’ACT CTG GAC CCT GAC TTC ACC G；M25’3’CCC TTG CTT GTC CTT TAT GTC C。从Wistar大鼠肾脏组织提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增大鼠β-防御素rBD-1 cDNA。RT-PCR反应条件如下：50℃保温30 min，使mRNA逆转录为cDNA；94℃预变性2 min，然后进行30个PCR循环：94℃ 30 s，58℃退火30 s，68℃延伸45 s；最后在68℃继续延伸7 min。RT-PCR扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检查有一约272 kb条带。其产物纯化后，用T4-DNA连接酶将其与pGEM-T easy载体连接，连接反应物转化宿主菌JM109感受态细胞，进行亚克隆筛选。然后用ABI PRISM 377 DNA自动测序仪测定其cDNA序列。根据其cDNA序列推导其氨基酸顺序，并与小鼠、人β-防御素氨基酸序列进行排列比较，显示三者均包含保守的氨基酸残基及典型的6个半胱氨酸残基。证明其克隆的大鼠cDNA片段为β-防御素-1。在PCR反应体系中，Taq DNA聚合酶常在扩增的PCR产物dsDNA每条链的3’末端多加上一个非模板依赖的dA碱基，使平端连接极为困难，解决这一难题的有效方法之一是构建T-载体。pGEM-T easy载体系统用EcoR V切割pGEM-T easy载体，并在dsDNA平端的3’再加上一个dT碱基，一方面阻止其自身环化，另一方面通过AT配对即可将载体与PCR产物直接连接。, http://www.100md.com