角膜与三叉神经节内HSV-1潜伏相关转录启动子的核苷酸序列分析
作者：谢立信 姜忠良 董晓光 袁凤波 史伟云
单位：266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所
关键词：单纯疱疹病毒Ⅰ型；潜伏相关转录；启动子序列
眼科研究000203 摘要 目的比较角膜与三叉神经节(TG)内单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)潜伏相关转录(LAT)启动子序列，进一步证实角膜为HSV-1的另一潜伏地。方法用新西兰白兔建立HSV-1潜伏感染动物模型，提取并PCR扩增角膜及TG LAT启动子，比较LAT启动子序列。结果66.7%(4/6)的角膜组织扩增出HSV-1 LAT启动子，且与TG的电泳位置相同(216 bp)；其在-2～-161间的核苷酸序列完全相同。结论HSV-1潜伏期的角膜组织存在LAT启动子，并与TG内的序列相同，表明角膜在很大程度上与TG一样，是HSV-1的另一潜伏点。
分类号 R 772.2
, http://www.100md.com
Sequences analysis of the herpes simplex virus type 1 latency associated
transcripts promoter region in corneal and trigeminal ganglion cells
Xie Lixin，Jiang Zhongliang，Dong Xiaoguang，et al.
Institute of Ophthalmology，Shandong Academy of Medical Science，Qingdao 266071
Abstract ObjectiveTo determine if cornea is another harboring latent of herpes simplex virus type 1(HSV-1)，by sequences analysis of HSV-1 latency associated promoter in cornea and in trigeminal ganglion(TG).MethodsTotal DNA of cornea and TG from rabbits with quiescent herpes simplex keratitis (HSK) was extracted for PCR amplification followed by DNA sequencing.ResultsHSV-1 latency associated transcript(LAT)promoter was identified in 4 out of 6 corneas (66.7%)，and its locations in ethidium bromide-stained gels that from TG(216bp) DNA sequences between 2～-161 nucleotides in cornea was identical to that in TG.ConclusionThe results suggest that the sequences of HSV-1 LAT promoter in cornea is identical to that in TG and both do not undergo rearrangement，giving further support to the concept of corneal latency.
, 百拇医药
Key word sherpes simplex virus type 1 latency associated transcripts promoter region sequencing
单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)原发感染角膜后，可在三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)内长期潜伏下来的理论早已公认。HSV-1在角膜形成潜伏感染的观点虽已提出，但其机理仍未阐明[1]。最近，国外报道了有关HSV-1在角膜内形成潜伏感染的潜伏相关转录(latency associated transcripts，LAT)启动子和TG内LAT启动子调节功能比较的文章[2]。但有关研究此两处LAT启动子结构比较的文献未见报道。针对此问题，我们利用PCR技术和DNA序列分析技术对角膜及TG内LAT启动子的结构进行了分析、比较，报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 潜伏感染动物模型的建立
1.1.1 实验动物
新西兰白兔15只，健康纯种，体重1.5～2.5 kg，由山东省医学科学院实验动物中心提供。
1.1.2 病毒
HSV-1 Mckrae株，滴度为2.5×106 PFU/ml。
1.1.3 实验过程
取9只兔，右眼结膜囊内滴入病毒50 μl。4天后，均出现了典型的单纯疱疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)，2只兔死于脑炎，取其右眼角膜，作为检测HSV-1抗原的阳性对照。在接种病毒60天后，剩下的7只兔随机取1只处死，取右眼角膜检测，HAS-1抗原阴性，证明HSV-1已进入潜伏期[3]。接种病毒的6只兔作为供体与6只未接种病毒的同种系健康兔右眼进行交叉PKP[4]。术后2周全部处死，取受体兔右眼1/2角膜植片，按上述方法检测HSV-1抗原；另外1/2角膜植片及供体兔右侧TG取出后，提取DNA。
, 百拇医药
1.2 HSV-1 LAT启动子PCR扩增及检测
1.2.1 PCR引物的选择
LAT启动子引物1(P1，序列5’CgCCggTCCATTAAggg3’)和2(P2，序列5’AgTCTTTCgCACCACCCg3’)选在LAT基因-196～20核苷酸区[2，6]，扩增片段为216 bp。
1.2.2 PCR反应及检测[5]
分别取角膜植片及TG DNA 10 μl(约含DNA 100 μg)，10×缓冲液10 μl(10 mmol/L TrisHCl，pH 9.0；50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L，MgCl2，0.1%明胶)，10×dNTP 10 μl(200 μmol/L)，P1，P2各2 μl(25 pmol/L)加灭菌三蒸水至50 μl。混匀，滴加灭菌石蜡油两滴，94℃变性5 min，然后加Taq DNA聚合酶2 U，按94℃ 30 s →55℃ 30 s→72℃ 30 s扩增35个循环后，72℃延伸5 min。扩增反应同时设阳性、阴性对照[7]。
, 百拇医药
取PCR产物9 μl，经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线透射仪上观察结果，与DNA Marker(分子量标准)比较，摄像记录。
1.3 角膜及TG内HSV-1 LAT启动子序列分析
PCR产物(来自角膜植片及TG)用低溶点软琼脂凝胶电泳法纯化后，分别上样于DNA序列自动分析仪(Model 373 A Beckman Co.USA)进行序列分析。
2 结果
接种病毒的兔右眼角膜均发生典型的HSK。2只兔死于脑炎，接种病毒后60天的1个兔角膜和PKP术后2周的6个受体兔角膜HSV-1抗原检测均为阴性；作为阳性对照的急性期的兔角膜检出了HSV-1抗原。
6个兔TG及角膜植片(1/2)的PCR产物，经电泳后，除2个受体兔角膜未出现结果外，其余的均在216 bp处出现了特异性电泳条带(见图1)。阳性PCR产物序列分析表明，在-196～20 bp处的DNA序列(启动子)完全相同。
, 百拇医药
图1 角膜、TG PCR产物电泳结果 (A：分子量标志 B：阳性对照 C：阴性对照 D～I为测定样本) Fig.1 Cornea and TG PCR product electrophor esis result(A：molecular weig h t marker B：positive contrast C：negative contrast D～I：samples)
3 讨论
单疱病毒潜伏感染时，潜伏相关转录(LAT)基因不断进行转录，虽然LAT不是HSV-1潜伏感染建立的决定因素，但检测LAT可作为潜伏感染的分子标志[8]。LAT基因的转录依赖于LAT启动子的启动，它能起始mRNA的合成，LAT转录起始点(+1)位于其5′末端，相当于HSV-1基因组中118808位置，LAT启动子位于其上游-2～-161核苷酸序列[2，6]，由于LAT启动子核苷酸序列是其发挥功能的结构基础，因此，研究LAT启动子有助于阐明HSV-1在角膜内潜伏和活化的分子机制。
, 百拇医药
在本研究中，6个受体TG和4个受体角膜(4/6)DNA中检测到了HSV-1 LAT启动子，说明角膜中存在病毒DNA。它可能是缺陷的、无功能的病毒DNA，也可能是真正的潜伏于角膜内的HSV-DNA，即角膜为HSV-1的另一潜伏地。另外，角膜PCR产物电泳结果与TG的一致，表明两者的分子量相同，因此，可初步断定两者的结构相同或相似。
由于在潜伏状态TG中的HSV-1基因不完整，且多发生重排[9]，因此，所检出的TG和角膜内的LAT启动子不知是否也发生了重排 核苷酸序列分析结果表明，TG内的HSV-1 LAT启动子区域的核苷酸并未发生重排，与Perry[6]的研究结果一致。通过比较发现，角膜内HSV-1 LAT启动子区域的核苷酸序列与TG内的完全一致。但它们在-89～-95核苷酸序列间均多了一个碱基(A)，此碱基可能是在PCR扩增时掺入的，也可能是由于病毒株保存时间过长而发生的点突变，还可能是在潜伏状态即发生碱基A的插入。此点突变说明了两个问题，第1，在-89～-95核苷酸序列间易插入碱基A；第2，可能对HSV-1的潜伏有影响。本研究序列分析结果一致，说明了HSV-1在角膜内类似于在神经元内的潜伏。这不但为其调节功能相同或相似提供可靠的结构基础，而且为HSV-1可在角膜内形成潜伏感染的论点提供了重要的理论依据，具有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1，Cook SD，Batra SK，Broon SM.Recovery of herpes simplex virus from the corneas of experimentally infected rabbits.J Gen Virol，68∶2013
2，Perng GC，Zwaagstra JC，Ghiasi H，et al.Similarities in regulation of the HSV-1 LAT promoter in corneal and neuronal cells.Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35∶2981
3，梁风岐，董晓光，谢立信.单纯疱疹病毒Ⅰ型潜伏感染的研究—兔角膜HSV-1抗原的检测.眼科研究，1991，9∶134
4，董晓光，谢立信，史伟云.复发性单疱病毒性角膜炎稳定期角膜内潜伏病毒活化的研究.中华眼科杂志，1994，30∶360
, http://www.100md.com
5，姜泊，张亚历，周殿元，等.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.66-67
6，Perry LJ ，McGeoch DJ.The DNA sequences of the long repeat region and adjoining parts of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1.J Gen Virol，1988，69∶2831
7，Mullis KB，Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymeras-catalyzed chain reaction.Methods Enzymol，1987，155∶335
8，Cook SD，Hill JM，Lynas C，et al.Latency-associated transcripts in corneas and ganglia of HSV-1 infected rabbits.Br J Ophthalmol，1991，75∶644
9，Puga A，Cantin EM，Wohlenberg C，et al.Different sizes of restriction endomuclease fragments from the terminal repetitions of the herpes simplex virus type 1 genome latent in trigemiral ganglia of mice.J Gen Virol，1984，65∶437
(收稿：1999-01-15 修回：1999-11-16), 百拇医药
单位：266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所
关键词：单纯疱疹病毒Ⅰ型；潜伏相关转录；启动子序列
眼科研究000203 摘要 目的比较角膜与三叉神经节(TG)内单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)潜伏相关转录(LAT)启动子序列，进一步证实角膜为HSV-1的另一潜伏地。方法用新西兰白兔建立HSV-1潜伏感染动物模型，提取并PCR扩增角膜及TG LAT启动子，比较LAT启动子序列。结果66.7%(4/6)的角膜组织扩增出HSV-1 LAT启动子，且与TG的电泳位置相同(216 bp)；其在-2～-161间的核苷酸序列完全相同。结论HSV-1潜伏期的角膜组织存在LAT启动子，并与TG内的序列相同，表明角膜在很大程度上与TG一样，是HSV-1的另一潜伏点。
分类号 R 772.2
, http://www.100md.com
Sequences analysis of the herpes simplex virus type 1 latency associated
transcripts promoter region in corneal and trigeminal ganglion cells
Xie Lixin，Jiang Zhongliang，Dong Xiaoguang，et al.
Institute of Ophthalmology，Shandong Academy of Medical Science，Qingdao 266071
Abstract ObjectiveTo determine if cornea is another harboring latent of herpes simplex virus type 1(HSV-1)，by sequences analysis of HSV-1 latency associated promoter in cornea and in trigeminal ganglion(TG).MethodsTotal DNA of cornea and TG from rabbits with quiescent herpes simplex keratitis (HSK) was extracted for PCR amplification followed by DNA sequencing.ResultsHSV-1 latency associated transcript(LAT)promoter was identified in 4 out of 6 corneas (66.7%)，and its locations in ethidium bromide-stained gels that from TG(216bp) DNA sequences between 2～-161 nucleotides in cornea was identical to that in TG.ConclusionThe results suggest that the sequences of HSV-1 LAT promoter in cornea is identical to that in TG and both do not undergo rearrangement，giving further support to the concept of corneal latency.
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Key word sherpes simplex virus type 1 latency associated transcripts promoter region sequencing
单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)原发感染角膜后，可在三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)内长期潜伏下来的理论早已公认。HSV-1在角膜形成潜伏感染的观点虽已提出，但其机理仍未阐明[1]。最近，国外报道了有关HSV-1在角膜内形成潜伏感染的潜伏相关转录(latency associated transcripts，LAT)启动子和TG内LAT启动子调节功能比较的文章[2]。但有关研究此两处LAT启动子结构比较的文献未见报道。针对此问题，我们利用PCR技术和DNA序列分析技术对角膜及TG内LAT启动子的结构进行了分析、比较，报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 潜伏感染动物模型的建立
1.1.1 实验动物
新西兰白兔15只，健康纯种，体重1.5～2.5 kg，由山东省医学科学院实验动物中心提供。
1.1.2 病毒
HSV-1 Mckrae株，滴度为2.5×106 PFU/ml。
1.1.3 实验过程
取9只兔，右眼结膜囊内滴入病毒50 μl。4天后，均出现了典型的单纯疱疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)，2只兔死于脑炎，取其右眼角膜，作为检测HSV-1抗原的阳性对照。在接种病毒60天后，剩下的7只兔随机取1只处死，取右眼角膜检测，HAS-1抗原阴性，证明HSV-1已进入潜伏期[3]。接种病毒的6只兔作为供体与6只未接种病毒的同种系健康兔右眼进行交叉PKP[4]。术后2周全部处死，取受体兔右眼1/2角膜植片，按上述方法检测HSV-1抗原；另外1/2角膜植片及供体兔右侧TG取出后，提取DNA。
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1.2 HSV-1 LAT启动子PCR扩增及检测
1.2.1 PCR引物的选择
LAT启动子引物1(P1，序列5’CgCCggTCCATTAAggg3’)和2(P2，序列5’AgTCTTTCgCACCACCCg3’)选在LAT基因-196～20核苷酸区[2，6]，扩增片段为216 bp。
1.2.2 PCR反应及检测[5]
分别取角膜植片及TG DNA 10 μl(约含DNA 100 μg)，10×缓冲液10 μl(10 mmol/L TrisHCl，pH 9.0；50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L，MgCl2，0.1%明胶)，10×dNTP 10 μl(200 μmol/L)，P1，P2各2 μl(25 pmol/L)加灭菌三蒸水至50 μl。混匀，滴加灭菌石蜡油两滴，94℃变性5 min，然后加Taq DNA聚合酶2 U，按94℃ 30 s →55℃ 30 s→72℃ 30 s扩增35个循环后，72℃延伸5 min。扩增反应同时设阳性、阴性对照[7]。
, 百拇医药
取PCR产物9 μl，经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线透射仪上观察结果，与DNA Marker(分子量标准)比较，摄像记录。
1.3 角膜及TG内HSV-1 LAT启动子序列分析
PCR产物(来自角膜植片及TG)用低溶点软琼脂凝胶电泳法纯化后，分别上样于DNA序列自动分析仪(Model 373 A Beckman Co.USA)进行序列分析。
2 结果
接种病毒的兔右眼角膜均发生典型的HSK。2只兔死于脑炎，接种病毒后60天的1个兔角膜和PKP术后2周的6个受体兔角膜HSV-1抗原检测均为阴性；作为阳性对照的急性期的兔角膜检出了HSV-1抗原。
6个兔TG及角膜植片(1/2)的PCR产物，经电泳后，除2个受体兔角膜未出现结果外，其余的均在216 bp处出现了特异性电泳条带(见图1)。阳性PCR产物序列分析表明，在-196～20 bp处的DNA序列(启动子)完全相同。
, 百拇医药
图1 角膜、TG PCR产物电泳结果 (A：分子量标志 B：阳性对照 C：阴性对照 D～I为测定样本) Fig.1 Cornea and TG PCR product electrophor esis result(A：molecular weig h t marker B：positive contrast C：negative contrast D～I：samples)
3 讨论
单疱病毒潜伏感染时，潜伏相关转录(LAT)基因不断进行转录，虽然LAT不是HSV-1潜伏感染建立的决定因素，但检测LAT可作为潜伏感染的分子标志[8]。LAT基因的转录依赖于LAT启动子的启动，它能起始mRNA的合成，LAT转录起始点(+1)位于其5′末端，相当于HSV-1基因组中118808位置，LAT启动子位于其上游-2～-161核苷酸序列[2，6]，由于LAT启动子核苷酸序列是其发挥功能的结构基础，因此，研究LAT启动子有助于阐明HSV-1在角膜内潜伏和活化的分子机制。
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在本研究中，6个受体TG和4个受体角膜(4/6)DNA中检测到了HSV-1 LAT启动子，说明角膜中存在病毒DNA。它可能是缺陷的、无功能的病毒DNA，也可能是真正的潜伏于角膜内的HSV-DNA，即角膜为HSV-1的另一潜伏地。另外，角膜PCR产物电泳结果与TG的一致，表明两者的分子量相同，因此，可初步断定两者的结构相同或相似。
由于在潜伏状态TG中的HSV-1基因不完整，且多发生重排[9]，因此，所检出的TG和角膜内的LAT启动子不知是否也发生了重排 核苷酸序列分析结果表明，TG内的HSV-1 LAT启动子区域的核苷酸并未发生重排，与Perry[6]的研究结果一致。通过比较发现，角膜内HSV-1 LAT启动子区域的核苷酸序列与TG内的完全一致。但它们在-89～-95核苷酸序列间均多了一个碱基(A)，此碱基可能是在PCR扩增时掺入的，也可能是由于病毒株保存时间过长而发生的点突变，还可能是在潜伏状态即发生碱基A的插入。此点突变说明了两个问题，第1，在-89～-95核苷酸序列间易插入碱基A；第2，可能对HSV-1的潜伏有影响。本研究序列分析结果一致，说明了HSV-1在角膜内类似于在神经元内的潜伏。这不但为其调节功能相同或相似提供可靠的结构基础，而且为HSV-1可在角膜内形成潜伏感染的论点提供了重要的理论依据，具有重要意义。
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参考文献
1，Cook SD，Batra SK，Broon SM.Recovery of herpes simplex virus from the corneas of experimentally infected rabbits.J Gen Virol，68∶2013
2，Perng GC，Zwaagstra JC，Ghiasi H，et al.Similarities in regulation of the HSV-1 LAT promoter in corneal and neuronal cells.Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35∶2981
3，梁风岐，董晓光，谢立信.单纯疱疹病毒Ⅰ型潜伏感染的研究—兔角膜HSV-1抗原的检测.眼科研究，1991，9∶134
4，董晓光，谢立信，史伟云.复发性单疱病毒性角膜炎稳定期角膜内潜伏病毒活化的研究.中华眼科杂志，1994，30∶360
, http://www.100md.com
5，姜泊，张亚历，周殿元，等.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.66-67
6，Perry LJ ，McGeoch DJ.The DNA sequences of the long repeat region and adjoining parts of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1.J Gen Virol，1988，69∶2831
7，Mullis KB，Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymeras-catalyzed chain reaction.Methods Enzymol，1987，155∶335
8，Cook SD，Hill JM，Lynas C，et al.Latency-associated transcripts in corneas and ganglia of HSV-1 infected rabbits.Br J Ophthalmol，1991，75∶644
9，Puga A，Cantin EM，Wohlenberg C，et al.Different sizes of restriction endomuclease fragments from the terminal repetitions of the herpes simplex virus type 1 genome latent in trigemiral ganglia of mice.J Gen Virol，1984，65∶437
(收稿：1999-01-15 修回：1999-11-16), 百拇医药