恶性B淋巴细胞性淋巴瘤克隆性重排检测研究
作者：郑颂国 陆孝禹 张容轩 罗建民 肖力 沈兆忠 许良中
单位：郑颂国 罗建民 沈兆忠 许良中 上海医科大学肿瘤医院分子生物学实验室(上海 200032)；陆孝禹 肖力 华东医院病理科；张容轩 上海市第一肺科医院病理科
关键词：淋巴瘤，B细胞；基因重排；多聚酶链反应
肿瘤990509 摘要：目的 对恶性B淋巴细胞性淋巴瘤进行克隆性研究。方法 用免疫组化法标记筛选恶性B淋巴细胞性淋巴瘤，用针对IgH单轮扩增引物进行多聚酶链反应扩增检测克隆性基因重排。结果 在126例恶性B细胞性淋巴瘤中，免疫组化标记与IgH基因克隆性重排符合率为97%，其中，IgH基因克隆性重排阳性83例(66%)，3例见TCRβ交叉阳性，在1例病理诊断为颈淋巴结反应性增生病例中出现IgH克隆性重排，在其它22例非淋巴组织和良性淋巴组织疾患中均未见阳性。在18例临床诊断有争议的病例中11例出现IgH克隆性重排。结论 克隆性重排检测对恶性B淋巴细胞性淋巴瘤有一定的辅助诊断作用。
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STUDY ON DETECTING CLONALITY IN MALIGNANT B CELL LYMPHOMA
ZHENG Song-Guo1，LU Xiao-Yu2，ZHANG Rong-Xuan3，et al.
(1.Laboratory of Molecular Biology,Cancer Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China;2.Department of Pathology,Huadong Hospital,China;3.Department of Pathology,The First Lung Hospital of Shanghai,China)
Abstract：Objective To investigate the clonality of malignant B cell lymphoma.Methods Specimens from 126 cases of malignant B cell lymphoma were studied by immunohistochemical methods(IHC) and were investigated for gene rearrangements by PCR technique.Results In 122 of 126(97%) cases,there was concordance between IHC and PCR.Family specific monoclonal IgH gene rearrangements were found in 83 out of 126 samples(66%) from malignant B cell lymphomas,only with 3 positive amplification of TCRβ gene rearrangements.Monoclonality of B-lymphocytes wasn′t detected in 22 cases of benign reactive diseases and non-lymphatic tumors.Conclusions The results provide an evidence to support the hypothesis of monoclonal origin of neoplasm and this technique may be useful in adjuvant diagnosis of malignant B cell lymphoma.
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Key words： Lymphoma,B-cell；Gene rearrangement;PCR
恶性淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s lymphoma,NHL)两大类。其中，HL因含有典型的R-S细胞而比较容易诊断，而NHL确是临床病理诊断和鉴别诊断中的难题，误诊率很高。在我国，NHL发病率占绝对优势(95%左右)，B细胞性和T细胞性淋巴瘤构成了NHL主要的免疫学亚型，国内又以B细胞性淋巴瘤为主(75%以上)。免疫组化技术的建立对区分NHL的免疫学亚型有很大的价值，其中应用免疫球蛋白轻链k，λ的单克隆(或多克隆)抗体对部分B细胞性NHL有一定的帮助诊断价值，但在大多数情况下，免疫组化技术不能帮助判别良恶性。
B淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其免疫球蛋白重链(IgH)基因不断通过基因重排而形成功能基因，一旦某一克隆的B细胞发生恶性变化，此时即呈现特异的基因重排，运用Southern印迹和PCR技术可以检测这一重排基因，帮助判别克隆性性质。由于Southern印迹需要制备探针，经Southern印迹，分子杂交，放射自显影等步骤，手续繁杂，费时，并需用较大量的DNA及有放射性同位素的污染等缺点，制约了其在实际临床病理中的应用[1]。相反，PCR技术不仅具有Southern印迹相似的特异性，而且更加敏感，快速并且无污染，国外已广泛应用。本研究在免疫学分型的基础上，对126例恶性B细胞性淋巴瘤进行IgH基因克隆性重排检测研究，并以反应性增生和非淋巴组织性肿瘤进行对照，在B淋巴细胞中检测TCR(T细胞受体，其克隆性重排是恶性T细胞的标志)基因作对照，以探讨检测IgH基因克隆性重排在恶性B细胞性淋巴瘤中的诊断价值。
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材料与方法
一、组织学标本
1.新鲜标本和细胞学穿刺标本 临床送检的新鲜淋巴结活检组织标本14例，细胞学穿刺标本18例(含2例骨髓穿刺标本)，立即置-70℃低温冰箱中保留待用。经临床病理和免疫组化标记证实为：B-NHL24例，淋巴结反应性增生6例，转移性癌2例。并用Raji细胞做B淋巴细胞恶性克隆性阳性对照。
2.石蜡包埋组织标本 经临床病理和免疫组织化学标记证实的B-NHL102例，T-NHL 18例，102例B-NHL中有疑难病例18例(临床诊断有不同意见)，所有标本均取自1990年以后上海肿瘤医院，华东医院，上海市第一肺科医院和全国各地疑难会诊标本。同时取淋巴结反应性增生10例，淋巴结转移性癌2例和非淋巴组织来源的肿瘤(如大肠癌等)3例。
二、免疫组织化学检测。具体方法见文献[2]。常规采用淋巴瘤筛选标记抗血清，分别为LCA(白细胞共同抗原)，免疫球蛋白κ轻链，λ轻链，L26(B细胞标志物)，UCHL-1(T细胞标志物)。
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三、模板制备
新鲜组织和细胞学穿刺标本采用常规酚/氯仿提取法。石蜡包埋组织切取6 μm厚蜡片5片置入1.5 ml Eppendorf管中，二甲苯，乙醇常规脱蜡水化，加入蛋白酶K和SDS成分的消化液(终浓度分别为100 μg/ml和1%)，56℃ 1 h后，37℃水浴振荡中过夜，在用酚，氯仿常规萃取，上清液中加3 mol/L NaAc，使终浓度为0.3 mol/L，最后加入2.5倍体积的-20℃无水乙醇沉淀DNA，去盐后真空抽干，溶于适量TE中备用。
四、引物合成
IgH基因引物序列引自McCarthy提供的最常用IgH通用引物[3]，引物序列如下：上引物：5′-CTGTCGACACGGCCGTGTATTTACTG-3′；下引物：5′-AACTGCAGAGGAGACGGTGACC-3′。所期望的DNA扩增片断大小为100-150 bp。TCR基因引物序列亦引自McCarthy的报告[4]。选用D2J2引物序列，具体序列如下：D2：5′-TCATGGTGTAACATTGTGGGGAC-3′；J2：5′-AGCACCGTGTGCCTGGTGCC-3′。所期望的DNA扩增片断大小为55-90 bp。所有引物序列均由中国科学院生物化学研究所合成。
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五、PCR扩增
应用美国PE公司生产的480型DNA扩增仪进行扩增。PCR反应体系为：DNA模板0.5 μg，dNTP 0.6 mmol/L，Taq酶1.5 U，10x buffer 5μl，引物分别为50 pmol，加水至40 μl，加等量液体石蜡油防止蒸发，设空白阴性对照。反应条件如下：94℃变性5 min，然后94℃ 60 s，52℃ 60s，72℃ 90s，共36个循环，最后72℃延伸7 min。
六、PCR产物的电泳鉴定
制作8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板，装入垂直电泳槽中，取10 μl PCR产物+2 μl含溴酚兰的加样缓冲液加入电泳槽孔中，同时加分子量Marker和阳性对照标本，电压120 V，1.5 h后取凝胶板常规固定，银染，玻璃纸封胶，凡在目标碱基对范围内出现明确扩增条带即可视为阳性。
结果
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一、免疫组化标记结果
在126例B-NHL中，LCA阳性116例(92%)，L26阳性122例(97%)，UCHL-1阳性3例(2.4%)，其中，4例LCA和L26均阴性。κ阳性24例(19%)，λ 20例(16)%。LCA，L26和UCHL-1的定位图(见插页第3页图3)。
图3 B细胞淋巴瘤 LCA(棕色)定位于细胞膜上(×100)
二、PCR检测IgH和TCRβ基因重排
在B-NHL中，无论是新鲜组织(包括活检和穿刺标本)还是石蜡包埋组织，经适当的模板制备技术及PCR扩增后，在目标基因范围内(IgH:100～150bp；TCRβ：55～90 bp)出现明显的DNA扩增条带，在反应性增生的淋巴组织中未见明显条带，仅在凝胶上见到染色均匀的弥漫阴影(smear)，非淋巴组织和T细胞淋巴瘤组织中亦未见条带(见附图)。
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附图 PCR检测IgH基因重排
M：标志分子量，1：转移性癌，2：反应性增生，3～7：恶性淋巴瘤
其中4～7出现110 bp克隆性扩增条带
附表 恶性B淋巴细胞增殖性疾患克隆性重排和免疫组化检测阳性病例数 类 型
例数
IgH
TCRβ
LCA
L26
UCHL-1
κ
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λ
恶性B-NHL
126
83
3
116
122
3
24
20
新鲜组织
24
17
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22
24
1
6
2
石蜡组织
102
66
2
94
98
2
18
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18
结内组织
86
62
2
79
83
1
15
14
结外组织
40
21
1
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37
39
2
9
6
反应性增生等
23
1
0
15
16
13
11
11
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恶性T-NHL
18
0
6
16
0
17
0
0
三、免疫组化标记与PCR扩增比较
恶性B细胞淋巴瘤克隆性重排和免疫组化检测结果详见附表。126例B-NHL中，IgH出现克隆性重排83例(83/126，66%)，LCA阳性标记116例(92%)，L26 122例(97%)，在83例IgH出现克隆性重排的病例中，LCA阳性78例(94%)，L26阳性79例(95%)，在4例LCA和L26均阴性的病例中，有2例出现IgH克隆性重排。
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四、其它
在B-NHL中，24例新鲜组织标本中出现IgH克隆性重排17例(71%)，102例石蜡组织66例阳性(62%)，86例结内标本62例阳性(72%)，40例结外21例阳性(53%)，2例骨髓穿刺标本，细胞学未见肿瘤证据，但经过PCR扩增，均出现IgH克隆性重排条带。
讨论
一、检测克隆性重排在恶性B细胞淋巴瘤辅助诊断中的价值
随着B淋巴细胞的不断分化成熟，其免疫球蛋白重链基因结构V，D，J，C区会不断发生重排组合[5]，若在某一特定的分化阶段发生肿瘤性增生，则其重排的基因是完全相同的，这为PCR技术检测B淋巴细胞肿瘤克隆性重排奠定了基础。国外在90年代初期开始应用，国内近2年少数大的科研单位开始应用。先期主要采用Southern印迹技术，但由于该技术费时较长，需要新鲜组织，并有同位素污染等缺点，限制了它在常规临床中的应用。PCR技术的建立，它可取代Southern印迹技术，进行淋巴瘤克隆性重排的检测。PCR技术不仅与Southern印迹有相似的特异性，而且更加简单，价廉，快速，无同位素污染，敏感性更高，细胞学穿刺和石蜡包埋固定的组织标本同样适用[1]。
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PCR技术已被广泛地，成功地用於各种遗传性疾病和基因病的诊断，McCarthy等在比较PCR与Southern印迹检测淋巴细胞的单克隆性性质时，发现PCR技术拥有Southern印迹技术相似的特异性[3]，Trainor等在研究55例B淋巴细胞增殖性疾患时，运用PCR技术检测出39例(75%)有特异性克隆性重排，与Southern印迹不相符的仅有3例，而此3例都是Southern印迹阴性，PCR技术阳性，提示PCR技术有高的敏感性[1]。本研究采用IgH通用引物，在126例B细胞淋巴瘤中，发现83例(66%)出现特异性克隆性重排，出现克隆性重排的病人，大多数都是临床病理比较肯定的病例。比较有意义的是有18例病例，病理形态结合免疫组化仍不能作出明确的诊断，其中11例出现IgH克隆性重排，1例出现TCRβ克隆性重排。在对照组中，1例颈淋巴结反应性增生病例出现IgH克隆性重排，由于以往的文献报道PCR技术检测淋巴细胞克隆性没有假阳性，因此这例病例作者正在随访中。即使该例出现假阳性，也不能否定该技术在辅助诊断淋巴瘤中的重要价值。
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二、检测克隆性重排对NHL免疫学分型和微小病灶早期复发病例的价值
Griesser等认为，免疫组织化学技术对NHL和HL鉴别诊断价值不大，其原因是肿瘤细胞和反应性细胞都有自己的特异抗原表达，因此，不结合形态学，仅靠免疫组化技术不能区分良、恶性[6]。免疫组化技术在T，B细胞分型方面有独特价值，本实验发现126例B细胞淋巴瘤，92%的LCA，97%的L26有阳性表达，极少数不能表达LCA和L26的病例，可能由于B淋巴细胞所处的不同分化阶段有关，在4例LCA和L26均不表达的病例中，形态学诊断为B细胞性淋巴瘤，IgH在2例中出现克隆性重排，提示检测淋巴细胞克隆性重排也有助于淋巴细胞的免疫学分型。PCR技术已被广泛用于肿瘤的淋巴结微小转移和骨髓微灶侵犯[7～9]。在本实验中，比较有趣的是，有2例临床考虑淋巴瘤侵犯骨髓，但反复细胞学穿刺并未见恶性证据，PCR检测确有IgH特异性克隆性重排，提示，该技术的应用可能有助于微小病灶，残留病灶和早期复发病人的诊断，Crotty等也有相似的报道[10]。
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三、存在的问题和对策
用PCR检测淋巴细胞的克隆性重排也存在一些问题，主要是假阴性较高，石蜡包埋组织检出率低于新鲜组织，少数病例IgH和TCRβ出现交叉和双标记等等。由于国内基层单位绝大多数均无保留新鲜组织的条件，若不能在石蜡组织中开展此项工作，则会影响该技术在全国的推广和应用。在实验中，作者重点选择石蜡标本，并对石蜡组织的模板制备进行改进，作者的体会是只要石蜡包埋组织不超过5年，采用中性福尔马林固定，进行改良的模板制备技术，因模板固定等原因引起的基因组断裂造成的假阴性可以克服。关于假阴性过高问题，作者也试图联合采用多对引物来提高其检测的阳性率，但实验结果显示，虽然提高一些阳性检测率，但提高的程度有限(另文报道)。因此，作者认为通过一定的技术优化，采用通用引物既比较适合于我国的国情，又可能帮助恶性淋巴瘤的诊断和鉴别诊断。
基金项目：本课题获上海市卫生局科研基金资助(96433)
, 百拇医药 作者简介：郑颂国，男，硕士，副研究员。
参考文献
[1]Trainor KJ,Brisco MJ,Wan JH, et al. Gene rearrangement in B-and T-lmphoproliferative disease detected by the polymerase chain reaction.Blood,1991,78:192
[2]郑颂国，刘尚廉，朱雄增，等.滋养细胞肿瘤PP11，PP19，PP25和PP26的免疫组织化学研究.肿瘤，1994，14：75
[3]McCarthy KP,Sloane JP,Wiedemann LM.Rapid method for distinguishing clonal from polyclonal B cell populations in surgical biopsy specimens.J Clin Pathol,1990,43:429
, 百拇医药
[4]McCarthy KP,Sloane JP,Kabarowsk JHS,et al. The rapid detection of clonal T-cell proliferation in patients with lymphoid diseases.Am J Pathol,1991,138:821
[5]Diss TC,Watts M,Pan LX.The polymerase chain reaction in the demonstration of monoclonality in T cell lymphomas.J Clin Pathol,1995,48;1045
[6]Griesser H,Feller AC,Mak TW, et al. Clonal rearrangement of T-cell receptor and immunoglobulin genes and immunophenotypic antigen expression in different subclasses of Hodgkin′s disease.Int J Cancer,1987,40;157
, 百拇医药
[7]Negrin RS,Blume KG.The use of the polymerase chain reaction for the detection of minimal residual malignant disease.Blood,1991,78:255
[8]Nollau P,Jung R,Neumaier M, et al.Tumor diagnosis by PCR-based detection of tumour cells.Scan J CLin Invest,1995,55:Suppl.221:116
[9]Coad JE,Olson DJ,Christense DR, et al. Correlation of PCR-detected clonal gene rearrangements with bone marrow morphology in patients with B-lineage lymphomas.Am J Surg Pathol,1997,12:1047
[10]Crotty PL,Smith BR,Tallini G.Morphologic,immunophenotypic,and molecular evaluation of bone marrow involvement in non-Hodgkin′s lymphoma.Diagn Mol Pathol,1998,7:90
(收稿日期：1999-02-12), 百拇医药
单位：郑颂国 罗建民 沈兆忠 许良中 上海医科大学肿瘤医院分子生物学实验室(上海 200032)；陆孝禹 肖力 华东医院病理科；张容轩 上海市第一肺科医院病理科
关键词：淋巴瘤，B细胞；基因重排；多聚酶链反应
肿瘤990509 摘要：目的 对恶性B淋巴细胞性淋巴瘤进行克隆性研究。方法 用免疫组化法标记筛选恶性B淋巴细胞性淋巴瘤，用针对IgH单轮扩增引物进行多聚酶链反应扩增检测克隆性基因重排。结果 在126例恶性B细胞性淋巴瘤中，免疫组化标记与IgH基因克隆性重排符合率为97%，其中，IgH基因克隆性重排阳性83例(66%)，3例见TCRβ交叉阳性，在1例病理诊断为颈淋巴结反应性增生病例中出现IgH克隆性重排，在其它22例非淋巴组织和良性淋巴组织疾患中均未见阳性。在18例临床诊断有争议的病例中11例出现IgH克隆性重排。结论 克隆性重排检测对恶性B淋巴细胞性淋巴瘤有一定的辅助诊断作用。
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STUDY ON DETECTING CLONALITY IN MALIGNANT B CELL LYMPHOMA
ZHENG Song-Guo1，LU Xiao-Yu2，ZHANG Rong-Xuan3，et al.
(1.Laboratory of Molecular Biology,Cancer Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China;2.Department of Pathology,Huadong Hospital,China;3.Department of Pathology,The First Lung Hospital of Shanghai,China)
Abstract：Objective To investigate the clonality of malignant B cell lymphoma.Methods Specimens from 126 cases of malignant B cell lymphoma were studied by immunohistochemical methods(IHC) and were investigated for gene rearrangements by PCR technique.Results In 122 of 126(97%) cases,there was concordance between IHC and PCR.Family specific monoclonal IgH gene rearrangements were found in 83 out of 126 samples(66%) from malignant B cell lymphomas,only with 3 positive amplification of TCRβ gene rearrangements.Monoclonality of B-lymphocytes wasn′t detected in 22 cases of benign reactive diseases and non-lymphatic tumors.Conclusions The results provide an evidence to support the hypothesis of monoclonal origin of neoplasm and this technique may be useful in adjuvant diagnosis of malignant B cell lymphoma.
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Key words： Lymphoma,B-cell；Gene rearrangement;PCR
恶性淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s lymphoma,NHL)两大类。其中，HL因含有典型的R-S细胞而比较容易诊断，而NHL确是临床病理诊断和鉴别诊断中的难题，误诊率很高。在我国，NHL发病率占绝对优势(95%左右)，B细胞性和T细胞性淋巴瘤构成了NHL主要的免疫学亚型，国内又以B细胞性淋巴瘤为主(75%以上)。免疫组化技术的建立对区分NHL的免疫学亚型有很大的价值，其中应用免疫球蛋白轻链k，λ的单克隆(或多克隆)抗体对部分B细胞性NHL有一定的帮助诊断价值，但在大多数情况下，免疫组化技术不能帮助判别良恶性。
B淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其免疫球蛋白重链(IgH)基因不断通过基因重排而形成功能基因，一旦某一克隆的B细胞发生恶性变化，此时即呈现特异的基因重排，运用Southern印迹和PCR技术可以检测这一重排基因，帮助判别克隆性性质。由于Southern印迹需要制备探针，经Southern印迹，分子杂交，放射自显影等步骤，手续繁杂，费时，并需用较大量的DNA及有放射性同位素的污染等缺点，制约了其在实际临床病理中的应用[1]。相反，PCR技术不仅具有Southern印迹相似的特异性，而且更加敏感，快速并且无污染，国外已广泛应用。本研究在免疫学分型的基础上，对126例恶性B细胞性淋巴瘤进行IgH基因克隆性重排检测研究，并以反应性增生和非淋巴组织性肿瘤进行对照，在B淋巴细胞中检测TCR(T细胞受体，其克隆性重排是恶性T细胞的标志)基因作对照，以探讨检测IgH基因克隆性重排在恶性B细胞性淋巴瘤中的诊断价值。
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材料与方法
一、组织学标本
1.新鲜标本和细胞学穿刺标本 临床送检的新鲜淋巴结活检组织标本14例，细胞学穿刺标本18例(含2例骨髓穿刺标本)，立即置-70℃低温冰箱中保留待用。经临床病理和免疫组化标记证实为：B-NHL24例，淋巴结反应性增生6例，转移性癌2例。并用Raji细胞做B淋巴细胞恶性克隆性阳性对照。
2.石蜡包埋组织标本 经临床病理和免疫组织化学标记证实的B-NHL102例，T-NHL 18例，102例B-NHL中有疑难病例18例(临床诊断有不同意见)，所有标本均取自1990年以后上海肿瘤医院，华东医院，上海市第一肺科医院和全国各地疑难会诊标本。同时取淋巴结反应性增生10例，淋巴结转移性癌2例和非淋巴组织来源的肿瘤(如大肠癌等)3例。
二、免疫组织化学检测。具体方法见文献[2]。常规采用淋巴瘤筛选标记抗血清，分别为LCA(白细胞共同抗原)，免疫球蛋白κ轻链，λ轻链，L26(B细胞标志物)，UCHL-1(T细胞标志物)。
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三、模板制备
新鲜组织和细胞学穿刺标本采用常规酚/氯仿提取法。石蜡包埋组织切取6 μm厚蜡片5片置入1.5 ml Eppendorf管中，二甲苯，乙醇常规脱蜡水化，加入蛋白酶K和SDS成分的消化液(终浓度分别为100 μg/ml和1%)，56℃ 1 h后，37℃水浴振荡中过夜，在用酚，氯仿常规萃取，上清液中加3 mol/L NaAc，使终浓度为0.3 mol/L，最后加入2.5倍体积的-20℃无水乙醇沉淀DNA，去盐后真空抽干，溶于适量TE中备用。
四、引物合成
IgH基因引物序列引自McCarthy提供的最常用IgH通用引物[3]，引物序列如下：上引物：5′-CTGTCGACACGGCCGTGTATTTACTG-3′；下引物：5′-AACTGCAGAGGAGACGGTGACC-3′。所期望的DNA扩增片断大小为100-150 bp。TCR基因引物序列亦引自McCarthy的报告[4]。选用D2J2引物序列，具体序列如下：D2：5′-TCATGGTGTAACATTGTGGGGAC-3′；J2：5′-AGCACCGTGTGCCTGGTGCC-3′。所期望的DNA扩增片断大小为55-90 bp。所有引物序列均由中国科学院生物化学研究所合成。
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五、PCR扩增
应用美国PE公司生产的480型DNA扩增仪进行扩增。PCR反应体系为：DNA模板0.5 μg，dNTP 0.6 mmol/L，Taq酶1.5 U，10x buffer 5μl，引物分别为50 pmol，加水至40 μl，加等量液体石蜡油防止蒸发，设空白阴性对照。反应条件如下：94℃变性5 min，然后94℃ 60 s，52℃ 60s，72℃ 90s，共36个循环，最后72℃延伸7 min。
六、PCR产物的电泳鉴定
制作8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板，装入垂直电泳槽中，取10 μl PCR产物+2 μl含溴酚兰的加样缓冲液加入电泳槽孔中，同时加分子量Marker和阳性对照标本，电压120 V，1.5 h后取凝胶板常规固定，银染，玻璃纸封胶，凡在目标碱基对范围内出现明确扩增条带即可视为阳性。
结果
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一、免疫组化标记结果
在126例B-NHL中，LCA阳性116例(92%)，L26阳性122例(97%)，UCHL-1阳性3例(2.4%)，其中，4例LCA和L26均阴性。κ阳性24例(19%)，λ 20例(16)%。LCA，L26和UCHL-1的定位图(见插页第3页图3)。
图3 B细胞淋巴瘤 LCA(棕色)定位于细胞膜上(×100)
二、PCR检测IgH和TCRβ基因重排
在B-NHL中，无论是新鲜组织(包括活检和穿刺标本)还是石蜡包埋组织，经适当的模板制备技术及PCR扩增后，在目标基因范围内(IgH:100～150bp；TCRβ：55～90 bp)出现明显的DNA扩增条带，在反应性增生的淋巴组织中未见明显条带，仅在凝胶上见到染色均匀的弥漫阴影(smear)，非淋巴组织和T细胞淋巴瘤组织中亦未见条带(见附图)。
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附图 PCR检测IgH基因重排
M：标志分子量，1：转移性癌，2：反应性增生，3～7：恶性淋巴瘤
其中4～7出现110 bp克隆性扩增条带
附表 恶性B淋巴细胞增殖性疾患克隆性重排和免疫组化检测阳性病例数 类 型
例数
IgH
TCRβ
LCA
L26
UCHL-1
κ
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λ
恶性B-NHL
126
83
3
116
122
3
24
20
新鲜组织
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石蜡组织
102
66
2
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98
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18
结内组织
86
62
2
79
83
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结外组织
40
21
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37
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2
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反应性增生等
23
1
0
15
16
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恶性T-NHL
18
0
6
16
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三、免疫组化标记与PCR扩增比较
恶性B细胞淋巴瘤克隆性重排和免疫组化检测结果详见附表。126例B-NHL中，IgH出现克隆性重排83例(83/126，66%)，LCA阳性标记116例(92%)，L26 122例(97%)，在83例IgH出现克隆性重排的病例中，LCA阳性78例(94%)，L26阳性79例(95%)，在4例LCA和L26均阴性的病例中，有2例出现IgH克隆性重排。
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四、其它
在B-NHL中，24例新鲜组织标本中出现IgH克隆性重排17例(71%)，102例石蜡组织66例阳性(62%)，86例结内标本62例阳性(72%)，40例结外21例阳性(53%)，2例骨髓穿刺标本，细胞学未见肿瘤证据，但经过PCR扩增，均出现IgH克隆性重排条带。
讨论
一、检测克隆性重排在恶性B细胞淋巴瘤辅助诊断中的价值
随着B淋巴细胞的不断分化成熟，其免疫球蛋白重链基因结构V，D，J，C区会不断发生重排组合[5]，若在某一特定的分化阶段发生肿瘤性增生，则其重排的基因是完全相同的，这为PCR技术检测B淋巴细胞肿瘤克隆性重排奠定了基础。国外在90年代初期开始应用，国内近2年少数大的科研单位开始应用。先期主要采用Southern印迹技术，但由于该技术费时较长，需要新鲜组织，并有同位素污染等缺点，限制了它在常规临床中的应用。PCR技术的建立，它可取代Southern印迹技术，进行淋巴瘤克隆性重排的检测。PCR技术不仅与Southern印迹有相似的特异性，而且更加简单，价廉，快速，无同位素污染，敏感性更高，细胞学穿刺和石蜡包埋固定的组织标本同样适用[1]。
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PCR技术已被广泛地，成功地用於各种遗传性疾病和基因病的诊断，McCarthy等在比较PCR与Southern印迹检测淋巴细胞的单克隆性性质时，发现PCR技术拥有Southern印迹技术相似的特异性[3]，Trainor等在研究55例B淋巴细胞增殖性疾患时，运用PCR技术检测出39例(75%)有特异性克隆性重排，与Southern印迹不相符的仅有3例，而此3例都是Southern印迹阴性，PCR技术阳性，提示PCR技术有高的敏感性[1]。本研究采用IgH通用引物，在126例B细胞淋巴瘤中，发现83例(66%)出现特异性克隆性重排，出现克隆性重排的病人，大多数都是临床病理比较肯定的病例。比较有意义的是有18例病例，病理形态结合免疫组化仍不能作出明确的诊断，其中11例出现IgH克隆性重排，1例出现TCRβ克隆性重排。在对照组中，1例颈淋巴结反应性增生病例出现IgH克隆性重排，由于以往的文献报道PCR技术检测淋巴细胞克隆性没有假阳性，因此这例病例作者正在随访中。即使该例出现假阳性，也不能否定该技术在辅助诊断淋巴瘤中的重要价值。
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二、检测克隆性重排对NHL免疫学分型和微小病灶早期复发病例的价值
Griesser等认为，免疫组织化学技术对NHL和HL鉴别诊断价值不大，其原因是肿瘤细胞和反应性细胞都有自己的特异抗原表达，因此，不结合形态学，仅靠免疫组化技术不能区分良、恶性[6]。免疫组化技术在T，B细胞分型方面有独特价值，本实验发现126例B细胞淋巴瘤，92%的LCA，97%的L26有阳性表达，极少数不能表达LCA和L26的病例，可能由于B淋巴细胞所处的不同分化阶段有关，在4例LCA和L26均不表达的病例中，形态学诊断为B细胞性淋巴瘤，IgH在2例中出现克隆性重排，提示检测淋巴细胞克隆性重排也有助于淋巴细胞的免疫学分型。PCR技术已被广泛用于肿瘤的淋巴结微小转移和骨髓微灶侵犯[7～9]。在本实验中，比较有趣的是，有2例临床考虑淋巴瘤侵犯骨髓，但反复细胞学穿刺并未见恶性证据，PCR检测确有IgH特异性克隆性重排，提示，该技术的应用可能有助于微小病灶，残留病灶和早期复发病人的诊断，Crotty等也有相似的报道[10]。
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三、存在的问题和对策
用PCR检测淋巴细胞的克隆性重排也存在一些问题，主要是假阴性较高，石蜡包埋组织检出率低于新鲜组织，少数病例IgH和TCRβ出现交叉和双标记等等。由于国内基层单位绝大多数均无保留新鲜组织的条件，若不能在石蜡组织中开展此项工作，则会影响该技术在全国的推广和应用。在实验中，作者重点选择石蜡标本，并对石蜡组织的模板制备进行改进，作者的体会是只要石蜡包埋组织不超过5年，采用中性福尔马林固定，进行改良的模板制备技术，因模板固定等原因引起的基因组断裂造成的假阴性可以克服。关于假阴性过高问题，作者也试图联合采用多对引物来提高其检测的阳性率，但实验结果显示，虽然提高一些阳性检测率，但提高的程度有限(另文报道)。因此，作者认为通过一定的技术优化，采用通用引物既比较适合于我国的国情，又可能帮助恶性淋巴瘤的诊断和鉴别诊断。
基金项目：本课题获上海市卫生局科研基金资助(96433)
, 百拇医药 作者简介：郑颂国，男，硕士，副研究员。
参考文献
[1]Trainor KJ,Brisco MJ,Wan JH, et al. Gene rearrangement in B-and T-lmphoproliferative disease detected by the polymerase chain reaction.Blood,1991,78:192
[2]郑颂国，刘尚廉，朱雄增，等.滋养细胞肿瘤PP11，PP19，PP25和PP26的免疫组织化学研究.肿瘤，1994，14：75
[3]McCarthy KP,Sloane JP,Wiedemann LM.Rapid method for distinguishing clonal from polyclonal B cell populations in surgical biopsy specimens.J Clin Pathol,1990,43:429
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[4]McCarthy KP,Sloane JP,Kabarowsk JHS,et al. The rapid detection of clonal T-cell proliferation in patients with lymphoid diseases.Am J Pathol,1991,138:821
[5]Diss TC,Watts M,Pan LX.The polymerase chain reaction in the demonstration of monoclonality in T cell lymphomas.J Clin Pathol,1995,48;1045
[6]Griesser H,Feller AC,Mak TW, et al. Clonal rearrangement of T-cell receptor and immunoglobulin genes and immunophenotypic antigen expression in different subclasses of Hodgkin′s disease.Int J Cancer,1987,40;157
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[7]Negrin RS,Blume KG.The use of the polymerase chain reaction for the detection of minimal residual malignant disease.Blood,1991,78:255
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[9]Coad JE,Olson DJ,Christense DR, et al. Correlation of PCR-detected clonal gene rearrangements with bone marrow morphology in patients with B-lineage lymphomas.Am J Surg Pathol,1997,12:1047
[10]Crotty PL,Smith BR,Tallini G.Morphologic,immunophenotypic,and molecular evaluation of bone marrow involvement in non-Hodgkin′s lymphoma.Diagn Mol Pathol,1998,7:90
(收稿日期：1999-02-12), 百拇医药