LPS对心脏微血管内皮细胞ICAM-1表达的影响及rHDL的调控作用
作者：宋耀明 孟素荣
单位：第三军医大学新桥医院心内科 (重庆 400037)
关键词：细胞间粘附分子-1；心脏微血管内皮细胞
中国血液流变学杂志990103 摘 要 目的：观察PLS作用下心脏微血管内皮(CMECs)细胞间粘附分子(ICAM)-1的表达情况及rHDL的调控作用，为CHD的防治提供实验依据。方法：利用培养的血管内皮细胞，采用流式细胞仪检测正常细胞、LPS作用和LPS与rHDL协同作用下0、1、2、6、12小时不同时相点ICAM-1表达阳性细胞数及荧光强度。结果：LPS和CMECs共同孵育下，随时间延长ICAM-1表达的阳性细胞数和荧光强度上升，rHDL有抑制ICAM-1表达作用。结论：PLS可以刺激CMECs表达ICAM-1,rHDL对血管内波细胞的损伤有保护作用。
EFFECTS OF LPS AND rHDL ON EXPRESSION OF ICAM-1
, http://www.100md.com
IN CARDIAC MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS
Song Yaoming et al
(Department of Cardiology,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400037)
Abstract Objective:To investigate the effects of LPS and recombinant high density lipoprotein(rHDL) on the expression of intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1) in cardiac microvascular endothelial cells(CMECs) to provide theoretic basis for prevention and treatment of coronary heart disease(CHD).Methods:After the cardiac microvascular endothelial cells were extracted,they were randomized into three groups(A,B and C).The cells in group A were routinely cultured while those in groups B and C were respectively cultured in the media with addition of LPS and rHDL.Then the number of cells with positive expression of ICAM-1 and florescent density of the expression were determined in 0,1,2,6 and 12h after incubation with flow cytometry.Results:After the CMECs were incubated in the medium with addition of LPS,the number of the cells with positive expression of ICAM-1 and florescent density of the expression were gradually increased with time prolongation.And rHDL could inhibit the expression of ICAM-1.Condclusion:LPS can stimulate CMECs to express ICAM-1 and rHDL might protect the vasular endothelial cells from damage.
, 百拇医药
Keywords intercellular adhesion molecule 1 cardiac microvascular endothelial cell
冠状动脉硬化性心脏病(CHD)目前已成为发达国家及发展中国家病人死亡的首要原因，也是我国，尤其是北方病人的首要死亡原因。因此，对CHD发病机理的深入研究具有重大的意义。内皮细胞损伤及局部脂质沉着是粥样硬化斑块形成的主要病理基础。研究发现在动脉粥样硬化形成的早期即有大量的内皮细胞粘附分子表达。粘附分子对血细胞尤其白细胞有阻获作用，白细胞释放的炎症介质及细胞因子可能有助于冠状动脉粥样硬化形成和加重。高密度脂蛋白(HDL)被认为有降低动脉粥样硬化形成的作用；LPS对血管内皮细胞有确切的损伤作用。本文体外分离和培养了大鼠心脏微血管内皮细胞(CMECs)，探讨了内毒素作用下心脏微血管内皮细胞中细胞间粘附分子(ICAM)-1的表达状况及重组高密度脂蛋白(rHDL)的调控作用，为冠状动脉粥样硬化形成的机制及防治提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 试剂：ICAM-1单抗、rHDL、胶原酶Ⅱ型、内毒素、M199培养液、培养瓶和96孔培养板从SIGMA公司购入。FTTC-IgG、抗VⅢ因子(ZA-0111)从中山公司购入，胰蛋白酶Fluka公司分装。
1.2 心脏微血管内皮细胞的分离和培养(1)：参考NISHIDA MASASHI方法分离、培养心脏微血管内皮细胞。简述如下：雄性Wistar大鼠180-250g，戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后打开胸腔，主动脉插管，用KHBB缓冲液逆行冲洗约5min，剪去左心房、心耳及右心室，沿左室壁剪开，75%酒精灭活30g后去除心室壁外侧1/4组织，剪碎后用0.2%胶原酶消化30min，然后用0.02%胰蛋白酶消化10min，用50目和200目滤网过滤，100×g，离心10min，用含有20%胎牛血清的M199培养液培养，4h后用M199洗去未附壁细胞，2～3d换液一次，2～3代细胞用于实验。细胞经抗VⅢ因子及形态学鉴定证实为血管内皮细胞。
, 百拇医药
1.3 LPS对心脏微血管内皮细胞中ICAM-1表达的影响及rHDL的抑制作用
将生长良好的心脏微血管内皮细胞用胶原酶(0.25%)及胰酶(0.025%)消化后，分为正常对照组，加入LPS(1μg/ml)后1、2、6、12h组和LPS(1μg/ml)+rHDL(1mg/ml)后1、2、6、12h组，用0.01MPBS(pH7.2)液离心清洗，加入适量稀释的ICAM-1单抗，在4℃冰箱中孵育30min，0.01MPBS(pH7.2)液离心清洗后加入相应的荧光抗体，在4℃冰箱中孵育30min，0.01MPBS液离心清洗后用流式细胞仪检测阳性细胞数及荧光强度。
2 结 果
表1 LPS对培养的心脏微血管内皮细胞中ICAM-1阳性细胞数
表达的影响及rHDL的抑制作用(%,
±s,n=6) 分组
, http://www.100md.com
孵 育 时 间
0
1
2
6
12
LPS组
24.6±3.24
32.8±6.24
50.1±8.02*
64.8±11.23**
89.6±12.43**
, http://www.100md.com
LPS+rHDL组
24.6±3.24
26.1±2.84#
34.6±7.02#
42.3±9.32#
62.9±10.24#
注：0时相点为正常标本测定结果；与0时相点比较，*P<0.05,**P<0.01
LPS组和LPS+rHDL组比较，#P<0.05表2 LPS对培养的心脏微血管内皮细胞中ICAM-1荧光强度表达
的影响及rHDL的抑制作用(MFI,
±s,n=6) 分组
, 百拇医药
孵 育 时 间
0
1
2
6
12
LPS组
98.2±11.24
120.4±21.46
146.8±27.61**
196.2±30.12**
340.7±48.71**
, http://www.100md.com
LPS+rHDL组
98.2±11.24
101.2±13.73
108.4±23.12#
156.9±26.78#
286.4±49.12#
注：0时相点为正常标本测定结果；与0时相点比较，*P<0.05,**P<0.01
LPS组和LPS+rHDL组比较，#P<0.05
表1、2显示LPS和LPS+rHDL培养的心脏微血管内皮细胞共同孵育，随孵育时间的延长ICAM-1表达的阳性细胞数和荧光强度明显增强(P<0.05和P<0.01)，rHDL有明显的抑制ICAM-1表达的作用(P<0.05)。
, http://www.100md.com
3 讨 论
细胞粘附分子(CAMs)是细胞膜蛋白的组成成分，属多糖蛋白，在维持细胞正常功能及形态上有重要的作用[5]。粘附分子目前已成为医学分子生物学研究的热点之一。CAMs分为五大家族，即整合素家族、免疫球蛋白超家族、选择素家族、钙粘附分子家族和碳水化合物家族，每一大家族在脏器中的作用各不相同，本文研究的细胞间粘附分子(ICAM)-1属于免疫球蛋白超家族，目前研究较多，它在参与肿瘤的形成，细胞因子、炎症介质对实质脏器的损害，冠状动脉粥样硬化等多种病理变化中起非常重要的作用。目前认为冠状动脉粥样硬化形成的原因主要是高胆固醇血症情况下，有内皮细胞受损和细胞因子及炎症介质的协同作用使细胞在受损局部粘附、聚集，粥样斑块形成。细胞损伤是CHD的重要病理基础[2]，但具体机制仍不清楚。本文应用大鼠心脏微血管内皮细胞为模型，应用内毒素(LPS)作为刺激因素，观察了内皮细胞在内毒素作用下ICAM-1的表达状况及重组高密度脂蛋白(rHDL)对其的抑制作用。结果显示LPS和培养的心脏微血管内皮细胞共同孵育，随孵育时间的延长ICAM-1表达的阳性细胞数和荧光强度明显增强，rHDL有明显的抑制ICAM-1表达的作用。LPS已被证实有损伤多种脏器实质细胞的作用，包括血管内皮细胞。本研究结果说明LPS引起了CMECs的损伤，而rHDL可以拮抗LPS的内皮损伤作用，提示rHDL具有治疗CHD的作用。
, 百拇医药
高密度脂蛋白(HDL)可以抑制冠状动脉粥样硬化的形成，主要是靠逆转胆固醇的转运，它可以抑制在细胞因子和炎症介质作用下低密度脂蛋白诱导的白细胞和血管内皮细胞的结合和对内皮细胞的激活和损伤。在这一过程中ICAM-1起非常重要的作用，因为在白细胞和血管内皮细胞的粘附和及对内皮细胞的激活和损伤主要是靠ICAM-1的参与[3]。实验研究证实，HDL可以抑制内皮细胞中在细胞因子作用下ICAM-1的基因转录，从而抑制内皮细胞膜表面ICAM-1表达，其信号传导系统要靠胞浆为MAPK激酶通路和核内的NF-KB来完成[4]，具体机制仍不清楚，尚需进一步研究。
本文还提示败血症或内毒素血症可能是粥样硬化形成的原因之一，在CHD的发生发展中起重要的作用。
参考文献
[1] Masashi Nishida,William W.Carley,Mary E.Gerritsen,Yvind Ellingsen,Raloh A.Kelly,and Thomas W.Smith.Isolation and charadterization of human and rat cardiacmicrovascular endothelial cells.Am j Physiol,199;264(2pt2):H639
, 百拇医药
[2] Calabresi-L;Franceschini-G;Sirtori-CR;De-Palma-A;Saeesella-M;Ferrante-P;
Taramelli-D.Inhibition of VCAM-1 expression in 奺ndothelial cells by reconstituted
high density liproteins.Biochem-Biophys-Res-Commun.1997;238(1);61-5
[3]Amberger-A;Maczek-C;Jurgens-G;Michaelis-D;Schett-G;Trieb-K;Eberl-T;Jindal-S;
Xu-Q;Wick-G.Co-expression of ICAM-1,VCAM-1,ELAM-1 and Hsp60 in human arterial
, 百拇医药
and venous endothelial cells in response to cytokines and oxidized low-density
lipoproteins.Cell-Stress-Chaperones.1997;2(2):94-103
[4] Moudry-R;Spycher-MO;Doran-JE.Reconstituted high density lipoprotein
modulates adherence of polymorphonuclear leukocytes to human endothelial
cells.Shock.1997;7(3):175-81
[5] 刘景生.细胞信息与调控.中国医科大学与中国协和医科大学联合出版社,1998.625-28.
(1998年12月28日收稿), http://www.100md.com
单位：第三军医大学新桥医院心内科 (重庆 400037)
关键词：细胞间粘附分子-1；心脏微血管内皮细胞
中国血液流变学杂志990103 摘 要 目的：观察PLS作用下心脏微血管内皮(CMECs)细胞间粘附分子(ICAM)-1的表达情况及rHDL的调控作用，为CHD的防治提供实验依据。方法：利用培养的血管内皮细胞，采用流式细胞仪检测正常细胞、LPS作用和LPS与rHDL协同作用下0、1、2、6、12小时不同时相点ICAM-1表达阳性细胞数及荧光强度。结果：LPS和CMECs共同孵育下，随时间延长ICAM-1表达的阳性细胞数和荧光强度上升，rHDL有抑制ICAM-1表达作用。结论：PLS可以刺激CMECs表达ICAM-1,rHDL对血管内波细胞的损伤有保护作用。
EFFECTS OF LPS AND rHDL ON EXPRESSION OF ICAM-1
, http://www.100md.com
IN CARDIAC MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS
Song Yaoming et al
(Department of Cardiology,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400037)
Abstract Objective:To investigate the effects of LPS and recombinant high density lipoprotein(rHDL) on the expression of intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1) in cardiac microvascular endothelial cells(CMECs) to provide theoretic basis for prevention and treatment of coronary heart disease(CHD).Methods:After the cardiac microvascular endothelial cells were extracted,they were randomized into three groups(A,B and C).The cells in group A were routinely cultured while those in groups B and C were respectively cultured in the media with addition of LPS and rHDL.Then the number of cells with positive expression of ICAM-1 and florescent density of the expression were determined in 0,1,2,6 and 12h after incubation with flow cytometry.Results:After the CMECs were incubated in the medium with addition of LPS,the number of the cells with positive expression of ICAM-1 and florescent density of the expression were gradually increased with time prolongation.And rHDL could inhibit the expression of ICAM-1.Condclusion:LPS can stimulate CMECs to express ICAM-1 and rHDL might protect the vasular endothelial cells from damage.
, 百拇医药
Keywords intercellular adhesion molecule 1 cardiac microvascular endothelial cell
冠状动脉硬化性心脏病(CHD)目前已成为发达国家及发展中国家病人死亡的首要原因，也是我国，尤其是北方病人的首要死亡原因。因此，对CHD发病机理的深入研究具有重大的意义。内皮细胞损伤及局部脂质沉着是粥样硬化斑块形成的主要病理基础。研究发现在动脉粥样硬化形成的早期即有大量的内皮细胞粘附分子表达。粘附分子对血细胞尤其白细胞有阻获作用，白细胞释放的炎症介质及细胞因子可能有助于冠状动脉粥样硬化形成和加重。高密度脂蛋白(HDL)被认为有降低动脉粥样硬化形成的作用；LPS对血管内皮细胞有确切的损伤作用。本文体外分离和培养了大鼠心脏微血管内皮细胞(CMECs)，探讨了内毒素作用下心脏微血管内皮细胞中细胞间粘附分子(ICAM)-1的表达状况及重组高密度脂蛋白(rHDL)的调控作用，为冠状动脉粥样硬化形成的机制及防治提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 试剂：ICAM-1单抗、rHDL、胶原酶Ⅱ型、内毒素、M199培养液、培养瓶和96孔培养板从SIGMA公司购入。FTTC-IgG、抗VⅢ因子(ZA-0111)从中山公司购入，胰蛋白酶Fluka公司分装。
1.2 心脏微血管内皮细胞的分离和培养(1)：参考NISHIDA MASASHI方法分离、培养心脏微血管内皮细胞。简述如下：雄性Wistar大鼠180-250g，戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后打开胸腔，主动脉插管，用KHBB缓冲液逆行冲洗约5min，剪去左心房、心耳及右心室，沿左室壁剪开，75%酒精灭活30g后去除心室壁外侧1/4组织，剪碎后用0.2%胶原酶消化30min，然后用0.02%胰蛋白酶消化10min，用50目和200目滤网过滤，100×g，离心10min，用含有20%胎牛血清的M199培养液培养，4h后用M199洗去未附壁细胞，2～3d换液一次，2～3代细胞用于实验。细胞经抗VⅢ因子及形态学鉴定证实为血管内皮细胞。
, 百拇医药
1.3 LPS对心脏微血管内皮细胞中ICAM-1表达的影响及rHDL的抑制作用
将生长良好的心脏微血管内皮细胞用胶原酶(0.25%)及胰酶(0.025%)消化后，分为正常对照组，加入LPS(1μg/ml)后1、2、6、12h组和LPS(1μg/ml)+rHDL(1mg/ml)后1、2、6、12h组，用0.01MPBS(pH7.2)液离心清洗，加入适量稀释的ICAM-1单抗，在4℃冰箱中孵育30min，0.01MPBS(pH7.2)液离心清洗后加入相应的荧光抗体，在4℃冰箱中孵育30min，0.01MPBS液离心清洗后用流式细胞仪检测阳性细胞数及荧光强度。
2 结 果
表1 LPS对培养的心脏微血管内皮细胞中ICAM-1阳性细胞数
表达的影响及rHDL的抑制作用(%,
±s,n=6) 分组, http://www.100md.com
孵 育 时 间
0
1
2
6
12
LPS组
24.6±3.24
32.8±6.24
50.1±8.02*
64.8±11.23**
89.6±12.43**
, http://www.100md.com
LPS+rHDL组
24.6±3.24
26.1±2.84#
34.6±7.02#
42.3±9.32#
62.9±10.24#
注：0时相点为正常标本测定结果；与0时相点比较，*P<0.05,**P<0.01
LPS组和LPS+rHDL组比较，#P<0.05表2 LPS对培养的心脏微血管内皮细胞中ICAM-1荧光强度表达
的影响及rHDL的抑制作用(MFI,
±s,n=6) 分组, 百拇医药
孵 育 时 间
0
1
2
6
12
LPS组
98.2±11.24
120.4±21.46
146.8±27.61**
196.2±30.12**
340.7±48.71**
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LPS+rHDL组
98.2±11.24
101.2±13.73
108.4±23.12#
156.9±26.78#
286.4±49.12#
注：0时相点为正常标本测定结果；与0时相点比较，*P<0.05,**P<0.01
LPS组和LPS+rHDL组比较，#P<0.05
表1、2显示LPS和LPS+rHDL培养的心脏微血管内皮细胞共同孵育，随孵育时间的延长ICAM-1表达的阳性细胞数和荧光强度明显增强(P<0.05和P<0.01)，rHDL有明显的抑制ICAM-1表达的作用(P<0.05)。
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3 讨 论
细胞粘附分子(CAMs)是细胞膜蛋白的组成成分，属多糖蛋白，在维持细胞正常功能及形态上有重要的作用[5]。粘附分子目前已成为医学分子生物学研究的热点之一。CAMs分为五大家族，即整合素家族、免疫球蛋白超家族、选择素家族、钙粘附分子家族和碳水化合物家族，每一大家族在脏器中的作用各不相同，本文研究的细胞间粘附分子(ICAM)-1属于免疫球蛋白超家族，目前研究较多，它在参与肿瘤的形成，细胞因子、炎症介质对实质脏器的损害，冠状动脉粥样硬化等多种病理变化中起非常重要的作用。目前认为冠状动脉粥样硬化形成的原因主要是高胆固醇血症情况下，有内皮细胞受损和细胞因子及炎症介质的协同作用使细胞在受损局部粘附、聚集，粥样斑块形成。细胞损伤是CHD的重要病理基础[2]，但具体机制仍不清楚。本文应用大鼠心脏微血管内皮细胞为模型，应用内毒素(LPS)作为刺激因素，观察了内皮细胞在内毒素作用下ICAM-1的表达状况及重组高密度脂蛋白(rHDL)对其的抑制作用。结果显示LPS和培养的心脏微血管内皮细胞共同孵育，随孵育时间的延长ICAM-1表达的阳性细胞数和荧光强度明显增强，rHDL有明显的抑制ICAM-1表达的作用。LPS已被证实有损伤多种脏器实质细胞的作用，包括血管内皮细胞。本研究结果说明LPS引起了CMECs的损伤，而rHDL可以拮抗LPS的内皮损伤作用，提示rHDL具有治疗CHD的作用。
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高密度脂蛋白(HDL)可以抑制冠状动脉粥样硬化的形成，主要是靠逆转胆固醇的转运，它可以抑制在细胞因子和炎症介质作用下低密度脂蛋白诱导的白细胞和血管内皮细胞的结合和对内皮细胞的激活和损伤。在这一过程中ICAM-1起非常重要的作用，因为在白细胞和血管内皮细胞的粘附和及对内皮细胞的激活和损伤主要是靠ICAM-1的参与[3]。实验研究证实，HDL可以抑制内皮细胞中在细胞因子作用下ICAM-1的基因转录，从而抑制内皮细胞膜表面ICAM-1表达，其信号传导系统要靠胞浆为MAPK激酶通路和核内的NF-KB来完成[4]，具体机制仍不清楚，尚需进一步研究。
本文还提示败血症或内毒素血症可能是粥样硬化形成的原因之一，在CHD的发生发展中起重要的作用。
参考文献
[1] Masashi Nishida,William W.Carley,Mary E.Gerritsen,Yvind Ellingsen,Raloh A.Kelly,and Thomas W.Smith.Isolation and charadterization of human and rat cardiacmicrovascular endothelial cells.Am j Physiol,199;264(2pt2):H639
, 百拇医药
[2] Calabresi-L;Franceschini-G;Sirtori-CR;De-Palma-A;Saeesella-M;Ferrante-P;
Taramelli-D.Inhibition of VCAM-1 expression in 奺ndothelial cells by reconstituted
high density liproteins.Biochem-Biophys-Res-Commun.1997;238(1);61-5
[3]Amberger-A;Maczek-C;Jurgens-G;Michaelis-D;Schett-G;Trieb-K;Eberl-T;Jindal-S;
Xu-Q;Wick-G.Co-expression of ICAM-1,VCAM-1,ELAM-1 and Hsp60 in human arterial
, 百拇医药
and venous endothelial cells in response to cytokines and oxidized low-density
lipoproteins.Cell-Stress-Chaperones.1997;2(2):94-103
[4] Moudry-R;Spycher-MO;Doran-JE.Reconstituted high density lipoprotein
modulates adherence of polymorphonuclear leukocytes to human endothelial
cells.Shock.1997;7(3):175-81
[5] 刘景生.细胞信息与调控.中国医科大学与中国协和医科大学联合出版社,1998.625-28.
(1998年12月28日收稿), http://www.100md.com