TNF-α对血管内皮细胞ICAM-1诱导作用的研究
作者：陈红辉 孙圣刚 童萼塘 杜怡峰 崔能武
单位：陈红辉(同济医科大学附属协和医院神经内科 430022)；孙圣刚(同济医科大学附属协和医院神经内科 430022)；童萼塘(同济医科大学附属协和医院神经内科 430022)；崔能武(同济医科大学实验医学研究中心放射免疫研究室)；杜怡峰(青岛大学医学院附属医院神经内科)
关键词：TNF-α；血管内皮细胞；ICAM-1
脑与神经疾病杂志000503 摘 要 目的：探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对血管内皮细胞ICAM-1表达的诱导作用。方法：通过血管内皮细胞培养，采用免疫组织化学方法分别观察不同浓度(0～250U.ml-1)TNF-α24小时内及某一浓度(100U.ml-1)TNF-α在不同时程(0～72h)对内皮细胞ICAM-1表达的影响。结果：与对照组比较，TNF-α呈浓度与时间依赖性诱导内皮细胞ICAM-1的表达。结论：TNF-α是诱导血管内皮细胞表达ICAM-1的直接原因之一。
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TNF-α Induced ICAM-1 Expression In Vascular Endothellal Cells
Chen Honghui,Sun Shengang,Tong Etang,et al.
(Department of Neurology,Afiliated Union Hospital of Tongji Medical University,Wuhan,430022)
Abstract Objective：Regulation of the Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) expression by Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α) in Vascular Endothelial Cells was investigated.Methods:Human Umbilial Vein Endothelial Cells (HUVEC) were stimulated with TNF-α at the indicated concentration (0～250U.ml-1) for the same time (24h) and with the same concentration (100U.ml-1) for the different time (0～72h),cell surface expression of ICAM-1 was detected by immunocytochemistry methods.Results:After the exposure of endothelial cells to TNF-α,the expression of ICAM-1 in endothelial cells was obviously increased compared to control group (P<0.05 or 0.01),the induction was concentration and time-dependent.Conclusion:TNF-α may directly induce the expression of ICAM-1 in Vascular Endothelial Cells.
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Key words TNF-α Vascular Endothelial Cell ICAM-1
近年来，ICAM-α等粘附分子在脑缺血再灌注损伤中的作用备受人们重视。新近研究资料显示：在脑缺血再灌注期间，缺血脑组织中TNF-α与ICAM-1表达相继升高，TNF-α可能直接通过对ICAM-1的诱导而实现其致炎作用[1～3]，但具体机制尚未完全阐明。基于此，我们探讨了TNF-α对血管内皮细胞ICAM-1表达的诱导作用，以期加深对脑缺血再灌注损伤免疫学机制的认识。
材 料 和 方 法
一、 药品与试剂：TNF-α购自美国SIGMA公司； 鼠抗人ICAM-1购自美国ZYMED公司； SABC试剂盒购自武汉博士德生物制品公司。
二、 细胞培养：EVC-304人脐静脉内皮细胞株(武汉大学中国动植物细胞保藏中心提供)经0.1%胰蛋白酶消化后，用含有15%新生小牛血清的DMEM(GIBCO)液制成细胞悬液，接种在培养瓶内，置入5%CO2培养箱中37℃培养，每2天换培养液一次，生长融合的细胞经0.1%胰蛋白酶消化传代。
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三、 TNF-α对血管内皮细胞ICAM-1的诱导作用
取生长融合的静脉内皮细胞(VEC)，按传代法制备细胞悬液，分别接种于放有盖玻片的中号培养皿中，细胞密度为2×104/cm2，用DMEM完全培养液，置37℃，5%CO2培养箱内培养，待细胞呈亚融合状态时倾去培养液，用PBS洗涤细胞后，换用含5%新生小牛血清的DMEM培养液。在6瓶培养液中分别加入不同浓度的TNF-α(0、1、10、50、100、250U*ml-1)，继续培养24小时，终止培养：在另外8个培养瓶中各加入浓度为100U*ml-1的TNF-α，继续培养不同时程(0、4、8、12、16、24、48、72h)后终止培养，轻轻将培养液倾去，夹出载有细胞的盖玻片，PBS洗涤生长在盖玻片上的细胞2次，稍干燥，冷丙酮固定细胞15分钟，PBS洗涤后采用SABC方法染色，主要反应步骤如下：①X-100Tris HCL 6h;②PBS洗； ③正常羊血清37℃,3min；④ICAM-1 1∶30，4℃过夜； ⑤Biotin-羊抗鼠(即用型)，37℃，1h;⑥SABC(即用型)，37℃，45min；⑦DAB显色。阴性对照用PBS分别取代一抗和二抗，结果为阴性。
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四、ICAM-检测 随机选择ICAM-1蛋白反应阳性细胞，用MPIAS-500高清晰度多媒体彩色病理图文分析系统，以0.785μm像素点长，在1.718×105m2测量窗下测定积分光密度，检测中保持光强度及放大倍数不变。
五、 统计学分析：数据以
±S表示，应用SAS软件包进行统计分析：采用多样本比较，先行方差分析，存在显著性差异后再行Q检验。
结 果
免疫亲和细胞化学染色显示，ICAM-1阳性的内皮细胞膜全部或部分着浅褐色，ICAM-1表达增强表现为ICAM-1阳性细胞密度增加及膜着色加深。
光密度测定显示，对照组内皮细胞膜上存在少量ICAM-1表达； 实验组与对照组比较，TNF-α与血管内皮细胞共同孵育24小时后，1U*ml-1浓度即能明显增加内皮细胞ICAM-1的表达(P<0.05)，而10、50、100、250U*ml-1的TNF-α则使内皮细胞ICAM-1表达上调更显著(P<0.01)，其诱导作用呈浓度依赖性增强。另外，以100U*ml-1的TNF-α刺激内皮细胞，ICAM-1表达在4～16小时快速上升(接近峰值)，于24小时达高峰，并维持该水平达48小时，在0～24小时内，TNF-α诱导ICAM-1呈时间依赖性表达(P<0.01或P<0.05)(见表1、2)。
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表1 TNF-α浓度对血管内皮细胞ICAM-1表达的影响 浓度(U/ml)
积分光密度(±S)
0(control)
20.52±2.37
1
22.55±2.04^
10
33.96±4.57**
50
49.82±2.90**
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100
66.88±4.82
250
99.04±7.89**
注：^与对照组比较P<0.05；**与其他组比较P<0.01 表2 TNF-α刺激时程对血管内皮细胞CAM-1表达的影响 时程(h)
积分光密度(±S)
0(control
20.02±2.25
4
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26.07±4.50**
8
38.95±4.19**
12
59.08±6.57**
16
69.12±6.57△△☆
24
75.56±4.94△△
48
73.51±5.66△△
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72
73.42±5.46△△
注：**与其他组比较P<0.01;△△与对照组、4h、8h及12h组比较P<0.01;☆与24h组比较P<0.05讨 论
ICAM-1是一类与缺血性脑血管病关系密切的粘附分子，属免疫球蛋白超家族成员，广泛表达在缺血/再灌注脑组织的微血管内皮细胞上[4]，可作为配体与白细胞表面表达的LFA-1(CD11a/CD18)和Mac(CD11b/CD18)分子相结合，主要介导单核细胞、 粒细胞与血管内皮细胞牢固粘附，并穿经血管壁而进入脑组织，故被认为在缺血/再灌注脑损伤中发挥重要作用[5]。
已知在脑缺血再灌注期间，缺血脑组织内TNF-α水平明显上升[6]，而近年来的实验还发现：TNF-α和ICAM-1等粘附分子均在同一缺血脑组织出现，前者表达先于后者，鉴于此，最近国外个别研究已着手探讨TNF-α在体外对这些粘附分子表达的诱导规律[7～8]。本实验发现：在一定浓度范围内，TNF-α能使培养的血管内皮细胞ICAM-1表达明显上调，其诱导作用呈浓度依赖性增强，最近Stanimirovic[7]在研究人脑微血管内皮细胞粘附分子表达时也得出类似结论，提示TNF-α是增加血管内皮细胞表达ICAM-1的直接原因之一，其浓度可能影响它对ICAM-1的诱导作用。有人观察到不同浓度(2.5～25pmol)外源TNF-α呈剂量依赖性增加大鼠脑梗塞面积和加重神经功能缺损程度，并可产生程度不同的、 与缺血后所见相类似的白细胞聚集和浸润现象[2，6]，据认为这是TNF-α经调节ICAM-1表达引起血管炎性反应的表现[9]，结合本实验结果我们认为：机体在脑缺血/再灌注期间产生的TNF-α可能部分通过对缺血区微血管内皮细胞ICAM-1表达的调节而发挥致炎作用，且病变组织内的TNF-α水平可能是影响其对ICAM-1诱导作用的重要因素之一。
, 百拇医药
本实验还发现：一定浓度的TNF-α能使培养的血管内皮细胞ICAM-1表达呈时间依赖性明显上调，且维持高表达水平至少达48小时。Wong[8]也曾得出类似结论，这种ICAM-1在TNF-α作用下快速被诱导且稳定于高表达水平的现象进一步支持TNF-α直接参与诱导ICAM-1表达的观点，同时也提示TNF-α在各炎症阶段对ICAM-1发挥不同的诱导作用。我们[10]在对缺血再灌注动物模型研究后发现，TNF-α和ICAM-1的表达高峰先后出现在再灌注12和24小时，两者在体内表达高峰的时间差与体外实验结果基本一致。由此可知：作为一种重要的致炎因子，TNF-α可能在不同缺血/再灌注时程部分通过ICAM-1的诱导而体现不同的致炎特性。
本研究结果还表明，在未经TNF-α刺激(对照组)的血管内皮细胞上也存在少量ICAM-1表达。正常或非缺血大脑半球微血管内皮细胞也有少量ICAM-1表达[4]，说明ICAM-1不仅参与病理过程，而且可能具备一些生理功能。
, 百拇医药
综上所述，TNF-α能直接引起血管内皮细胞粘附分子ICAM-1表达上调，结合其他离体或在体的相关研究结论，我们认为在脑缺血再灌注损伤过程中，TNF-α参与了对脑微血管内皮细胞ICAM-1的诱导，这种诱导作用可能又受其本身浓度及处于再灌注不同时程等因素的影响。为此，需进一步探讨两者在缺血脑组织中的表达时空规律，以便为开展抗体干预和溶栓治疗提供一定实验依据。
参考文献
1，Kim JS.Cytokines and adhesion molecules in stroke and related disease.J Neurol Sci,1996,137∶69～78.
2，Liu T,Clark R.K,Mcdonnell P.C,et al.Tumor Necrosis Factor-α expression in ischemic neurons.Stroke,1994,25∶1481～1488.
, http://www.100md.com
3，Bitsch A,Klene W,Murtadal L,et al.A Longitudinal prospective study of soluble adhesion molecules in acute stroke.Stroke,1998,29∶2129～2135.
4，Yasushi D,Brain R.C,E.tsuro M,et al.P-selectin and intercellular adhesion molecule-1 expression after focal brain ischemia and reperfusion.Stroke,1994,25∶202～211.
5，李光勤.综述.细胞粘附分子与脑缺血.国外医学脑血管疾病分册，1995，5(5)∶266～269.
6，Barone.F.C,Avin B,White R.F,et al.Tumor Necrosis Factorα a mediator of focal ischemic brain injury.Stroke,1997,28∶1233～1244.
, 百拇医药
7，Stanimirovic D.B,Wong J,Shapiro A,et al.Incease in surface expression of ICAM-1,VCAM-1 and Eselectin in human cerebromicrovascular endothelial cells subjected to ischemia-like insults.Acta Neurochir,1997[suppl],70∶12～16.
8，Wong D,Dorovini-Zis k.Expression of Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.Microvascular Research,1995,49∶325～399.
9，杨金升.综述.肿瘤坏死因子在脑卒中时的表达及作用.国外医学脑血管疾病分册，1996，2∶77～80.
10，孙圣刚等.大鼠脑缺血再灌注后脑组织TNF-α与ICAM-1表达的实验研究.同济医科大学学报，1999，28(6)∶489～491.
收稿日期：2000-02-29, 百拇医药
单位：陈红辉(同济医科大学附属协和医院神经内科 430022)；孙圣刚(同济医科大学附属协和医院神经内科 430022)；童萼塘(同济医科大学附属协和医院神经内科 430022)；崔能武(同济医科大学实验医学研究中心放射免疫研究室)；杜怡峰(青岛大学医学院附属医院神经内科)
关键词：TNF-α；血管内皮细胞；ICAM-1
脑与神经疾病杂志000503 摘 要 目的：探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对血管内皮细胞ICAM-1表达的诱导作用。方法：通过血管内皮细胞培养，采用免疫组织化学方法分别观察不同浓度(0～250U.ml-1)TNF-α24小时内及某一浓度(100U.ml-1)TNF-α在不同时程(0～72h)对内皮细胞ICAM-1表达的影响。结果：与对照组比较，TNF-α呈浓度与时间依赖性诱导内皮细胞ICAM-1的表达。结论：TNF-α是诱导血管内皮细胞表达ICAM-1的直接原因之一。
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TNF-α Induced ICAM-1 Expression In Vascular Endothellal Cells
Chen Honghui,Sun Shengang,Tong Etang,et al.
(Department of Neurology,Afiliated Union Hospital of Tongji Medical University,Wuhan,430022)
Abstract Objective：Regulation of the Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) expression by Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α) in Vascular Endothelial Cells was investigated.Methods:Human Umbilial Vein Endothelial Cells (HUVEC) were stimulated with TNF-α at the indicated concentration (0～250U.ml-1) for the same time (24h) and with the same concentration (100U.ml-1) for the different time (0～72h),cell surface expression of ICAM-1 was detected by immunocytochemistry methods.Results:After the exposure of endothelial cells to TNF-α,the expression of ICAM-1 in endothelial cells was obviously increased compared to control group (P<0.05 or 0.01),the induction was concentration and time-dependent.Conclusion:TNF-α may directly induce the expression of ICAM-1 in Vascular Endothelial Cells.
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Key words TNF-α Vascular Endothelial Cell ICAM-1
近年来，ICAM-α等粘附分子在脑缺血再灌注损伤中的作用备受人们重视。新近研究资料显示：在脑缺血再灌注期间，缺血脑组织中TNF-α与ICAM-1表达相继升高，TNF-α可能直接通过对ICAM-1的诱导而实现其致炎作用[1～3]，但具体机制尚未完全阐明。基于此，我们探讨了TNF-α对血管内皮细胞ICAM-1表达的诱导作用，以期加深对脑缺血再灌注损伤免疫学机制的认识。
材 料 和 方 法
一、 药品与试剂：TNF-α购自美国SIGMA公司； 鼠抗人ICAM-1购自美国ZYMED公司； SABC试剂盒购自武汉博士德生物制品公司。
二、 细胞培养：EVC-304人脐静脉内皮细胞株(武汉大学中国动植物细胞保藏中心提供)经0.1%胰蛋白酶消化后，用含有15%新生小牛血清的DMEM(GIBCO)液制成细胞悬液，接种在培养瓶内，置入5%CO2培养箱中37℃培养，每2天换培养液一次，生长融合的细胞经0.1%胰蛋白酶消化传代。
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三、 TNF-α对血管内皮细胞ICAM-1的诱导作用
取生长融合的静脉内皮细胞(VEC)，按传代法制备细胞悬液，分别接种于放有盖玻片的中号培养皿中，细胞密度为2×104/cm2，用DMEM完全培养液，置37℃，5%CO2培养箱内培养，待细胞呈亚融合状态时倾去培养液，用PBS洗涤细胞后，换用含5%新生小牛血清的DMEM培养液。在6瓶培养液中分别加入不同浓度的TNF-α(0、1、10、50、100、250U*ml-1)，继续培养24小时，终止培养：在另外8个培养瓶中各加入浓度为100U*ml-1的TNF-α，继续培养不同时程(0、4、8、12、16、24、48、72h)后终止培养，轻轻将培养液倾去，夹出载有细胞的盖玻片，PBS洗涤生长在盖玻片上的细胞2次，稍干燥，冷丙酮固定细胞15分钟，PBS洗涤后采用SABC方法染色，主要反应步骤如下：①X-100Tris HCL 6h;②PBS洗； ③正常羊血清37℃,3min；④ICAM-1 1∶30，4℃过夜； ⑤Biotin-羊抗鼠(即用型)，37℃，1h;⑥SABC(即用型)，37℃，45min；⑦DAB显色。阴性对照用PBS分别取代一抗和二抗，结果为阴性。
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四、ICAM-检测 随机选择ICAM-1蛋白反应阳性细胞，用MPIAS-500高清晰度多媒体彩色病理图文分析系统，以0.785μm像素点长，在1.718×105m2测量窗下测定积分光密度，检测中保持光强度及放大倍数不变。
五、 统计学分析：数据以
±S表示，应用SAS软件包进行统计分析：采用多样本比较，先行方差分析，存在显著性差异后再行Q检验。结 果
免疫亲和细胞化学染色显示，ICAM-1阳性的内皮细胞膜全部或部分着浅褐色，ICAM-1表达增强表现为ICAM-1阳性细胞密度增加及膜着色加深。
光密度测定显示，对照组内皮细胞膜上存在少量ICAM-1表达； 实验组与对照组比较，TNF-α与血管内皮细胞共同孵育24小时后，1U*ml-1浓度即能明显增加内皮细胞ICAM-1的表达(P<0.05)，而10、50、100、250U*ml-1的TNF-α则使内皮细胞ICAM-1表达上调更显著(P<0.01)，其诱导作用呈浓度依赖性增强。另外，以100U*ml-1的TNF-α刺激内皮细胞，ICAM-1表达在4～16小时快速上升(接近峰值)，于24小时达高峰，并维持该水平达48小时，在0～24小时内，TNF-α诱导ICAM-1呈时间依赖性表达(P<0.01或P<0.05)(见表1、2)。
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表1 TNF-α浓度对血管内皮细胞ICAM-1表达的影响 浓度(U/ml)
积分光密度(
±S)0(control)
20.52±2.37
1
22.55±2.04^
10
33.96±4.57**
50
49.82±2.90**
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100
66.88±4.82
250
99.04±7.89**
注：^与对照组比较P<0.05；**与其他组比较P<0.01 表2 TNF-α刺激时程对血管内皮细胞CAM-1表达的影响 时程(h)
积分光密度(
±S)0(control
20.02±2.25
4
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26.07±4.50**
8
38.95±4.19**
12
59.08±6.57**
16
69.12±6.57△△☆
24
75.56±4.94△△
48
73.51±5.66△△
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73.42±5.46△△
注：**与其他组比较P<0.01;△△与对照组、4h、8h及12h组比较P<0.01;☆与24h组比较P<0.05讨 论
ICAM-1是一类与缺血性脑血管病关系密切的粘附分子，属免疫球蛋白超家族成员，广泛表达在缺血/再灌注脑组织的微血管内皮细胞上[4]，可作为配体与白细胞表面表达的LFA-1(CD11a/CD18)和Mac(CD11b/CD18)分子相结合，主要介导单核细胞、 粒细胞与血管内皮细胞牢固粘附，并穿经血管壁而进入脑组织，故被认为在缺血/再灌注脑损伤中发挥重要作用[5]。
已知在脑缺血再灌注期间，缺血脑组织内TNF-α水平明显上升[6]，而近年来的实验还发现：TNF-α和ICAM-1等粘附分子均在同一缺血脑组织出现，前者表达先于后者，鉴于此，最近国外个别研究已着手探讨TNF-α在体外对这些粘附分子表达的诱导规律[7～8]。本实验发现：在一定浓度范围内，TNF-α能使培养的血管内皮细胞ICAM-1表达明显上调，其诱导作用呈浓度依赖性增强，最近Stanimirovic[7]在研究人脑微血管内皮细胞粘附分子表达时也得出类似结论，提示TNF-α是增加血管内皮细胞表达ICAM-1的直接原因之一，其浓度可能影响它对ICAM-1的诱导作用。有人观察到不同浓度(2.5～25pmol)外源TNF-α呈剂量依赖性增加大鼠脑梗塞面积和加重神经功能缺损程度，并可产生程度不同的、 与缺血后所见相类似的白细胞聚集和浸润现象[2，6]，据认为这是TNF-α经调节ICAM-1表达引起血管炎性反应的表现[9]，结合本实验结果我们认为：机体在脑缺血/再灌注期间产生的TNF-α可能部分通过对缺血区微血管内皮细胞ICAM-1表达的调节而发挥致炎作用，且病变组织内的TNF-α水平可能是影响其对ICAM-1诱导作用的重要因素之一。
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本实验还发现：一定浓度的TNF-α能使培养的血管内皮细胞ICAM-1表达呈时间依赖性明显上调，且维持高表达水平至少达48小时。Wong[8]也曾得出类似结论，这种ICAM-1在TNF-α作用下快速被诱导且稳定于高表达水平的现象进一步支持TNF-α直接参与诱导ICAM-1表达的观点，同时也提示TNF-α在各炎症阶段对ICAM-1发挥不同的诱导作用。我们[10]在对缺血再灌注动物模型研究后发现，TNF-α和ICAM-1的表达高峰先后出现在再灌注12和24小时，两者在体内表达高峰的时间差与体外实验结果基本一致。由此可知：作为一种重要的致炎因子，TNF-α可能在不同缺血/再灌注时程部分通过ICAM-1的诱导而体现不同的致炎特性。
本研究结果还表明，在未经TNF-α刺激(对照组)的血管内皮细胞上也存在少量ICAM-1表达。正常或非缺血大脑半球微血管内皮细胞也有少量ICAM-1表达[4]，说明ICAM-1不仅参与病理过程，而且可能具备一些生理功能。
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综上所述，TNF-α能直接引起血管内皮细胞粘附分子ICAM-1表达上调，结合其他离体或在体的相关研究结论，我们认为在脑缺血再灌注损伤过程中，TNF-α参与了对脑微血管内皮细胞ICAM-1的诱导，这种诱导作用可能又受其本身浓度及处于再灌注不同时程等因素的影响。为此，需进一步探讨两者在缺血脑组织中的表达时空规律，以便为开展抗体干预和溶栓治疗提供一定实验依据。
参考文献
1，Kim JS.Cytokines and adhesion molecules in stroke and related disease.J Neurol Sci,1996,137∶69～78.
2，Liu T,Clark R.K,Mcdonnell P.C,et al.Tumor Necrosis Factor-α expression in ischemic neurons.Stroke,1994,25∶1481～1488.
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4，Yasushi D,Brain R.C,E.tsuro M,et al.P-selectin and intercellular adhesion molecule-1 expression after focal brain ischemia and reperfusion.Stroke,1994,25∶202～211.
5，李光勤.综述.细胞粘附分子与脑缺血.国外医学脑血管疾病分册，1995，5(5)∶266～269.
6，Barone.F.C,Avin B,White R.F,et al.Tumor Necrosis Factorα a mediator of focal ischemic brain injury.Stroke,1997,28∶1233～1244.
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7，Stanimirovic D.B,Wong J,Shapiro A,et al.Incease in surface expression of ICAM-1,VCAM-1 and Eselectin in human cerebromicrovascular endothelial cells subjected to ischemia-like insults.Acta Neurochir,1997[suppl],70∶12～16.
8，Wong D,Dorovini-Zis k.Expression of Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.Microvascular Research,1995,49∶325～399.
9，杨金升.综述.肿瘤坏死因子在脑卒中时的表达及作用.国外医学脑血管疾病分册，1996，2∶77～80.
10，孙圣刚等.大鼠脑缺血再灌注后脑组织TNF-α与ICAM-1表达的实验研究.同济医科大学学报，1999，28(6)∶489～491.
收稿日期：2000-02-29, 百拇医药