肾移植HLA-DR血清学分型与PCR-SSP基因分型的比较
作者：陈连周 王长希 徐鸿绪 曾文涛 傅茜 陈规划 肖露露
单位：陈连周 王长希 徐鸿绪 曾文涛 傅茜 陈规划(510080 广州市，中山医科大学附属第一医院外科)；肖露露(510095 广州器官移植配型中心)
关键词：HLA-DR抗原；聚合酶链反应；基因型
实用医学杂志001006 摘 要 目的：比较肾移植供受体HLA-DR血清学分型与PCR-SSP基因分型方法的差异，以探讨两种方法的优缺点。方法：对已作HLA-DR标准血清学分型的供受体标本，用PCR-SSP基因分型法作HLA-DR抗原分型。结果：血清学法耗时80 min，PCR-SSP法耗时145 min;血清学方法误差率为11.5%(受者15.1%，供者8.7%)。结论：PCR-SSP法作HLA-DR分型具有准确、简便、快速等优点，随着其技术的改进，将逐步取代暂时还适合我国的尸体供肾快速配型的血清学方法。
, http://www.100md.com
目前肾移植供体的选择主要是利用人类白细胞抗原(HLA)配型的方法[1]。国内肾移植由于特定条件所限，要求HLA抗原分型方法快速、简便、准确，至于分辨率不一定要求很高。本研究采用比较标准血清学法和经美国FDA通过的PCR-SSP法作HLA-DR抗原分型，实验比较如下。
1 对象与方法
1.1 检测对象 收集1997年1月～1999年12月已作HLA-DR标准血清学分型的尸体供肾血标本69例和尿毒症肾移植受者血标本53例。血标本均用ACD(Acid Citrate Dextrose)抗凝剂抗凝，吸取1.25 ml到1.5 ml离心管中，于-86℃保存，所有标本均隐去姓名，用数字编号。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 血清学方法分型仪器和试剂 免疫磁珠(Fluoro Besd-B)、血清板(DR72D，单克隆抗体分型板，包括DR座位33个和DQ座位6个)、补体、Lambda ALPHA读板机(购自美国One Lambda公司)，全自动荧光倒置显微镜(购自日本Olympuis公司)。
, 百拇医药
1.2.2 PCR-SSP方法所用仪器和试剂 9600PCR仪(美国PE公司)、高速离心机(上海离心机厂)、旋涡震荡仪(美国Cole-parma公司)、DR/DQ特异引物(美国One Lambda公司)、DNA抽提试剂盒(内含试剂A，B，C，D和TE溶液，美国G&T公司)、Taq酶(美国Promega公司)。
1.3 方法
1.3.1 血清学法操作步骤及结果判断 取10 ml ACD抗凝全血离心，2 800 r/min 10 min，取1 ml白膜到5 ml试管中，加4 ml PBS/citrate，加100 μ l免疫磁珠，旋转3 min(22～25℃)，置磁架孔中3 min，待磁珠吸附于管壁，自磁珠对侧吸去液体，用PBS洗去未被磁珠吸附的血细胞2次，加入5%胎牛血清Mccoy's液，调整至细胞数为2×103个/μ l，采用软加法，依次在分型板每个孔中加无菌水1 μ l、石蜡油5 μ l，B淋巴细胞、补体各1 μ l，置22～25℃孵育，50 min后加荧光染色固定，在荧光倒置显微镜下观察结果，连接Lambda ALPHA读板机读板，用Alpha Scan系统软件处理打印反应格局和判断结果。
, 百拇医药
1.3.2 PCR-SSP方法
1.3.2.1 DNA抽提方法 按G&T公司提供方法进行操作：取带盖的1.5 ml离心管，先加入1.2 ml试剂A，再加入0.3 ml EDTA抗凝全血，在室温颠倒5～6次，观察到红细胞全部裂解。置小型离心机以8 000 r/min离心3 min。小心吸弃上清液，但务必残留20 μ l左右上清液，剧烈震荡或用加样器使沉淀悬起，然后加入试剂B 170 μ l，试剂C 4 μ l。剧烈震荡20 s，加入试剂D 72 μ l，再剧烈震荡20 s；10 000 r/min离心5 min；将上清液转入1.5 ml离心管，加入210 μ l异丙醇，颠倒混匀数次，可见丝状DNA沉淀；10 000 r/min离心5 min，小心吸弃上清液，注意不要接触到底部的DNA；加入0.5 ml 70%乙醇，离心3 min，弃上清液，尽量吸干；尽快加50 μ l TE溶液，置65℃水浴5 min助溶。
1.3.2.2 扩增、电泳及结果判断 美国One Lambda公司的PCR-SSP法，每份标本同时32管PCR反应(31管DR/DQ基因分型，1管阳性对照)，每管反应体积10 μ l，包括：混合液8 μ l，2 UTaq酶1 μ l，模板DNA 1 μ l。PCR扩增条件：第1步，94℃ 130 s，63℃ 60 s共1个循环。第2步：94℃ 10 s，63℃ 60 s共9个循环。第3步：94℃ 10 s，59℃ 50 s，72℃ 30 s共20个循环。电泳20 min，紫外透视仪下观察结果、拍照及记录结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 检测时间 血清学分型耗时约80 min，包括：分离B淋巴细胞20 min，分型板中加入淋巴细胞孵育50 min，染色固定2 min，观察结果5 min。PCR-SSP法约145 min，包括：抽提DNA 30 min，PCR扩增90 min，电泳20 min，观察结果5 min。
2.2 血清学与DNA分型结果比较 69例供者和53例受者共122份血样本的HLA-DR分型结果中，DNA分型共检出DR等位基因总数231个(空白位点13个)。血清学分型有空白位点16个(包括2例标本存在可疑第2个DR位点)，其中经DNA分型证实有3例存在第二位点(8，10，12)；11个DR位点分型错误，其余位点与DNA分型结果符合。血清学分型的总误差率为11.5%(受者15.1%，供者8.7%)。
2.3 血清学分型误差结果 血清学分型的误差主要出现在DR 15，DR 16，DR 8。血清学分型结果3例DR 15，3例DR 16，2例DR 8；DNA分型结果分别是DR 16，DR 15，DR 12。
, 百拇医药
3 讨论
在人类，主要组织相容性复合体(MHC)称为人类白细胞抗原，简称HLA。它是调节人体免疫反应的一组基因，和同种异体器官移植的排斥反应密切相关，故又称为移植抗原。大量的临床资料[2～4]表明，良好的供受体HLA配型可减少急性排斥的发生，并可降低移植受体对供体HLA抗原的致敏性，有利于移植肾的长期存活，并对再次移植受体更有益。因此，准确快速地完成组织配型是肾移植成功的前提之一。
本实验结果表明了传统的血清学方法经过不断改良，具有耗时短、操作简单等优点，但总误差仍较高，为11.5%，特别是尿毒症肾移植受者的误差高达15.1%，这可能与尿毒症患者体内长期高浓度的毒素或再次移植者应用了大量免疫抑制剂有关。这些均可能导致淋巴细胞的数量和质量发生改变而影响细胞表面抗原的表达或引起抗原性减弱，使血清学分型出现错误。另一个值得注意的是本组供者HLA-DR血清学分型误差率明显较低(8.7%)，可能与本组供体绝大多数为健康青壮年有关，在分离B淋巴细胞时，能较易获得大量活性好的B淋巴细胞。
, 百拇医药
血清学HLA-DR分型除了需要较大量优质B淋巴细胞外，交叉反应是其最主要的问题。加样可采用软加法，避免加样器接触到反应板的底部，减少反应孔之间相互污染而引起的交叉反应。HLA抗体和补体的效价可随着保存时间的延长而下降，使试验出现假阴性结果。对于这种情况，可采用延长反应时间，增加反应温度，另用高效价的补体来弥补抗体效价不足等方法[5]。然而，由于血清学方法本身的缺点，各抗原之间存在交叉反应。从血清学HLA-DR反应格局DR 72 D中可发现，4个DR 15反应有3个与DR 16重复，容易造成DR 15与DR 16之间错判。DR 8，DR 10，DR 12的漏检可能与血清反应板的DR 8，DR 10，DR 12抗原抗体反应弱有关。尽管如此，血清学在我国尸肾HLA快速分型方面，特别是在分辨率要求不高的初次肾移植HLA配型时，具有一定的优势，仍能适合肾移植临床需要[6]。
PCR-SSP方法是通过各种具有型特异性、组特异性或等位基因特异性的引物设计，直接扩增出目的基因片段，通过普通凝胶电泳，观察特异性扩增带的有无来判定待测样品的HLA型别。它所检测的是DNA，不仅适合量小、冰箱保存时间长的样品，还可用于检测已经部分降解的DNA，不受机体免疫状态的干扰[7]。基因分型结果判断容易、且清楚可靠、快速、简便，与血清学方法相比具有明显的优势，是血清学方法的可靠补充和发展。
, http://www.100md.com
本课题受广东省科委青年基金资助项目(项目编号：960131)
参考文献
1，章咏棠. 基础理论和临床实践相结合提高肾移植的诊疗水平. 中华器官移植杂志，1997，18(1)：1.
2，陈洪涛，肖露露，于立新，等. 快速PCR-SSP-HLA-DRB分型的比较. 中华泌尿外科杂志，1998，19(1)：51～53.
3，Opelz G,Wujiciak T. Cadaveric kidneys should be alloated according to the HLA match. Transp Proc，1995，27(1)：93.
4，Steve Takemoto BS,Paul l,Terasaki PL,et al. Survival of nationlly shared HLA-matached kidney transplantation from cadaveric bonors. N EngL J Med,1992，329(8)：834.
5，赵桐茂. HLA分型原理和应用. 上海：上海科技出版社，1984. 68～70，198.
6，肖露露，于立新，张升，等. HLA-抗原一步分型新方法. 第一军医大学学报，1997，17(4)：311～312.
7，刘广贤，孔繁华，张蕊芳，等. PCR-SSP基因分型技术的建立及其在骨髓移植配型中的应用. 中国实验临床免疫学杂志，1996，8(3)：18～21.
(收稿日期：2000-06-05), http://www.100md.com
单位：陈连周 王长希 徐鸿绪 曾文涛 傅茜 陈规划(510080 广州市，中山医科大学附属第一医院外科)；肖露露(510095 广州器官移植配型中心)
关键词：HLA-DR抗原；聚合酶链反应；基因型
实用医学杂志001006 摘 要 目的：比较肾移植供受体HLA-DR血清学分型与PCR-SSP基因分型方法的差异，以探讨两种方法的优缺点。方法：对已作HLA-DR标准血清学分型的供受体标本，用PCR-SSP基因分型法作HLA-DR抗原分型。结果：血清学法耗时80 min，PCR-SSP法耗时145 min;血清学方法误差率为11.5%(受者15.1%，供者8.7%)。结论：PCR-SSP法作HLA-DR分型具有准确、简便、快速等优点，随着其技术的改进，将逐步取代暂时还适合我国的尸体供肾快速配型的血清学方法。
, http://www.100md.com
目前肾移植供体的选择主要是利用人类白细胞抗原(HLA)配型的方法[1]。国内肾移植由于特定条件所限，要求HLA抗原分型方法快速、简便、准确，至于分辨率不一定要求很高。本研究采用比较标准血清学法和经美国FDA通过的PCR-SSP法作HLA-DR抗原分型，实验比较如下。
1 对象与方法
1.1 检测对象 收集1997年1月～1999年12月已作HLA-DR标准血清学分型的尸体供肾血标本69例和尿毒症肾移植受者血标本53例。血标本均用ACD(Acid Citrate Dextrose)抗凝剂抗凝，吸取1.25 ml到1.5 ml离心管中，于-86℃保存，所有标本均隐去姓名，用数字编号。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 血清学方法分型仪器和试剂 免疫磁珠(Fluoro Besd-B)、血清板(DR72D，单克隆抗体分型板，包括DR座位33个和DQ座位6个)、补体、Lambda ALPHA读板机(购自美国One Lambda公司)，全自动荧光倒置显微镜(购自日本Olympuis公司)。
, 百拇医药
1.2.2 PCR-SSP方法所用仪器和试剂 9600PCR仪(美国PE公司)、高速离心机(上海离心机厂)、旋涡震荡仪(美国Cole-parma公司)、DR/DQ特异引物(美国One Lambda公司)、DNA抽提试剂盒(内含试剂A，B，C，D和TE溶液，美国G&T公司)、Taq酶(美国Promega公司)。
1.3 方法
1.3.1 血清学法操作步骤及结果判断 取10 ml ACD抗凝全血离心，2 800 r/min 10 min，取1 ml白膜到5 ml试管中，加4 ml PBS/citrate，加100 μ l免疫磁珠，旋转3 min(22～25℃)，置磁架孔中3 min，待磁珠吸附于管壁，自磁珠对侧吸去液体，用PBS洗去未被磁珠吸附的血细胞2次，加入5%胎牛血清Mccoy's液，调整至细胞数为2×103个/μ l，采用软加法，依次在分型板每个孔中加无菌水1 μ l、石蜡油5 μ l，B淋巴细胞、补体各1 μ l，置22～25℃孵育，50 min后加荧光染色固定，在荧光倒置显微镜下观察结果，连接Lambda ALPHA读板机读板，用Alpha Scan系统软件处理打印反应格局和判断结果。
, 百拇医药
1.3.2 PCR-SSP方法
1.3.2.1 DNA抽提方法 按G&T公司提供方法进行操作：取带盖的1.5 ml离心管，先加入1.2 ml试剂A，再加入0.3 ml EDTA抗凝全血，在室温颠倒5～6次，观察到红细胞全部裂解。置小型离心机以8 000 r/min离心3 min。小心吸弃上清液，但务必残留20 μ l左右上清液，剧烈震荡或用加样器使沉淀悬起，然后加入试剂B 170 μ l，试剂C 4 μ l。剧烈震荡20 s，加入试剂D 72 μ l，再剧烈震荡20 s；10 000 r/min离心5 min；将上清液转入1.5 ml离心管，加入210 μ l异丙醇，颠倒混匀数次，可见丝状DNA沉淀；10 000 r/min离心5 min，小心吸弃上清液，注意不要接触到底部的DNA；加入0.5 ml 70%乙醇，离心3 min，弃上清液，尽量吸干；尽快加50 μ l TE溶液，置65℃水浴5 min助溶。
1.3.2.2 扩增、电泳及结果判断 美国One Lambda公司的PCR-SSP法，每份标本同时32管PCR反应(31管DR/DQ基因分型，1管阳性对照)，每管反应体积10 μ l，包括：混合液8 μ l，2 UTaq酶1 μ l，模板DNA 1 μ l。PCR扩增条件：第1步，94℃ 130 s，63℃ 60 s共1个循环。第2步：94℃ 10 s，63℃ 60 s共9个循环。第3步：94℃ 10 s，59℃ 50 s，72℃ 30 s共20个循环。电泳20 min，紫外透视仪下观察结果、拍照及记录结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 检测时间 血清学分型耗时约80 min，包括：分离B淋巴细胞20 min，分型板中加入淋巴细胞孵育50 min，染色固定2 min，观察结果5 min。PCR-SSP法约145 min，包括：抽提DNA 30 min，PCR扩增90 min，电泳20 min，观察结果5 min。
2.2 血清学与DNA分型结果比较 69例供者和53例受者共122份血样本的HLA-DR分型结果中，DNA分型共检出DR等位基因总数231个(空白位点13个)。血清学分型有空白位点16个(包括2例标本存在可疑第2个DR位点)，其中经DNA分型证实有3例存在第二位点(8，10，12)；11个DR位点分型错误，其余位点与DNA分型结果符合。血清学分型的总误差率为11.5%(受者15.1%，供者8.7%)。
2.3 血清学分型误差结果 血清学分型的误差主要出现在DR 15，DR 16，DR 8。血清学分型结果3例DR 15，3例DR 16，2例DR 8；DNA分型结果分别是DR 16，DR 15，DR 12。
, 百拇医药
3 讨论
在人类，主要组织相容性复合体(MHC)称为人类白细胞抗原，简称HLA。它是调节人体免疫反应的一组基因，和同种异体器官移植的排斥反应密切相关，故又称为移植抗原。大量的临床资料[2～4]表明，良好的供受体HLA配型可减少急性排斥的发生，并可降低移植受体对供体HLA抗原的致敏性，有利于移植肾的长期存活，并对再次移植受体更有益。因此，准确快速地完成组织配型是肾移植成功的前提之一。
本实验结果表明了传统的血清学方法经过不断改良，具有耗时短、操作简单等优点，但总误差仍较高，为11.5%，特别是尿毒症肾移植受者的误差高达15.1%，这可能与尿毒症患者体内长期高浓度的毒素或再次移植者应用了大量免疫抑制剂有关。这些均可能导致淋巴细胞的数量和质量发生改变而影响细胞表面抗原的表达或引起抗原性减弱，使血清学分型出现错误。另一个值得注意的是本组供者HLA-DR血清学分型误差率明显较低(8.7%)，可能与本组供体绝大多数为健康青壮年有关，在分离B淋巴细胞时，能较易获得大量活性好的B淋巴细胞。
, 百拇医药
血清学HLA-DR分型除了需要较大量优质B淋巴细胞外，交叉反应是其最主要的问题。加样可采用软加法，避免加样器接触到反应板的底部，减少反应孔之间相互污染而引起的交叉反应。HLA抗体和补体的效价可随着保存时间的延长而下降，使试验出现假阴性结果。对于这种情况，可采用延长反应时间，增加反应温度，另用高效价的补体来弥补抗体效价不足等方法[5]。然而，由于血清学方法本身的缺点，各抗原之间存在交叉反应。从血清学HLA-DR反应格局DR 72 D中可发现，4个DR 15反应有3个与DR 16重复，容易造成DR 15与DR 16之间错判。DR 8，DR 10，DR 12的漏检可能与血清反应板的DR 8，DR 10，DR 12抗原抗体反应弱有关。尽管如此，血清学在我国尸肾HLA快速分型方面，特别是在分辨率要求不高的初次肾移植HLA配型时，具有一定的优势，仍能适合肾移植临床需要[6]。
PCR-SSP方法是通过各种具有型特异性、组特异性或等位基因特异性的引物设计，直接扩增出目的基因片段，通过普通凝胶电泳，观察特异性扩增带的有无来判定待测样品的HLA型别。它所检测的是DNA，不仅适合量小、冰箱保存时间长的样品，还可用于检测已经部分降解的DNA，不受机体免疫状态的干扰[7]。基因分型结果判断容易、且清楚可靠、快速、简便，与血清学方法相比具有明显的优势，是血清学方法的可靠补充和发展。
, http://www.100md.com
本课题受广东省科委青年基金资助项目(项目编号：960131)
参考文献
1，章咏棠. 基础理论和临床实践相结合提高肾移植的诊疗水平. 中华器官移植杂志，1997，18(1)：1.
2，陈洪涛，肖露露，于立新，等. 快速PCR-SSP-HLA-DRB分型的比较. 中华泌尿外科杂志，1998，19(1)：51～53.
3，Opelz G,Wujiciak T. Cadaveric kidneys should be alloated according to the HLA match. Transp Proc，1995，27(1)：93.
4，Steve Takemoto BS,Paul l,Terasaki PL,et al. Survival of nationlly shared HLA-matached kidney transplantation from cadaveric bonors. N EngL J Med,1992，329(8)：834.
5，赵桐茂. HLA分型原理和应用. 上海：上海科技出版社，1984. 68～70，198.
6，肖露露，于立新，张升，等. HLA-抗原一步分型新方法. 第一军医大学学报，1997，17(4)：311～312.
7，刘广贤，孔繁华，张蕊芳，等. PCR-SSP基因分型技术的建立及其在骨髓移植配型中的应用. 中国实验临床免疫学杂志，1996，8(3)：18～21.
(收稿日期：2000-06-05), http://www.100md.com