β-纤维蛋白原-455G/A基因多态性的检测
作者：刘国勋 李凤芹 蔡望伟 杨勤 谢朝阳 凌光鑫
单位：刘国勋 李凤芹 杨勤 谢朝阳 凌光鑫 广东医学院附属医院血液研究室，广东湛江524001
关键词：β-纤维蛋白原；基因多态性；基因型频率
临床检验杂志990404 摘要 应用多聚酶链反应限制性酶切法，分析中国广东籍人β-纤维蛋白原-455 G/A(β-FBG-455-G/A)基因多态性。266例广东籍人DNA样品的β-FBG-455-G/A多态性中，发现β-FBG-455A/A纯合子10个，基因型频率0.038；β-FBG-455-G/G野生型138个，基因型频率为0.519；β-FBG-455G/A杂合子118个，基因型频率为0.444，A等位基因频率为0.259。提示中国广东籍人β-FBG-455A等位基因频率比欧州一些国家报道的高。
血浆纤维蛋白原(Fbg)水平增高是导致缺血性心脑血管疾病发病的主要独立因素。研究表明，Fbg基因多态性是导致个体间血浆Fbg水平差异的直接因素[1～3]。国外文献报道Fbg基因多态性达十余种，其中影响Fbg水平变化的大部分是编码β链的基因(即β-FBG基因)。目前对β-Fbg基因转录起始点上游455 bp的G→A改变的多态性(简称β-FBG-455-G/A基因多态性)方面研究较多，其表现为455-G/G、455-G/A、455-A/A三种基因型[1，2]。目前尚无中国人Fbg基因型多态性频率及分布规率的文献报道。最近我们建立了β-FBG-455-G/A基因多态性的检测方法并对266例广东籍人进行β-FBG-455-G/A基因多态性分析，现报告如下。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 266例广东籍医学生，男178例、女88例，年龄17～24，中值20.8岁。
1.2 DNA制备 按常规经蛋白酶消化与酚、氯仿抽提DNA。
1.3 引物序列 参考文献[2]通过PCR-Design软件，设计引物，上游引物5′ ATAGAATAGGGTA-TGAATTTG 3′，下游引物5′ GGCTGAACCAT-TTTATCATTT 3′。
1.4 PCR反应 反应体系为25 μl。终浓度为1×buffer，2 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，引物浓度各0.4 μmol/L，待测DNA 5 μl。25 μl反应液中含Taq DNA聚合酶0.6 U(上海华美公司)。使用美国GT1-2基因扩增仪，94°C变性50秒，55°C复性50秒，72°C延伸1分钟，共31个循环。吸取扩增后产物5 μl在25 g/L琼脂板120 V电泳，用溴乙啶染色，紫外线灯下观察。
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1.5 限制性内切酶分析 用内切酶(Biolabs产品)取产物15 μl，加限制性内切酶5 U及相应酶缓冲液进行酶切2小时。30 g/L琼脂糖电泳检测酶切结果。
1.6 受检PCR片段的测序 PCR产物经QIA quik试剂盒纯化后，用下游引物在ABI PRISMTM 377 DNA测序仪上进行直接测序。
2 结果和讨论
PCR扩增产物为一条446 bp的片段。由于β-FBG-455有一HaeⅢ酶切位点，PCR扩增产物经酶切后，30 g/L琼脂糖电泳检测发现有三种基因型，①β-FBG-455G/G基因型，产生348 bp及98 bp两个片段；②β-FBG-455A/A基因型，仅见一条446 bp片段；③β-FBG-455G/A基因型，分别产生446 bp、348 bp及98 bp三个片段，见图1。
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1为pUC mix marker 2为G/A杂合子；3，4为G/G野生型；5为A/A纯合子。
图1 β-FBG-455 PCR产物HeaⅢ酶切结果
分析266个DNA样品中β-FBG-455A/A纯合子10个，基因型频率为0.038；β-FBG-455G/G野生型138个，基因型频率为0.519；β-FBG-455-G/A杂合子118个，基因型频率为0.444。A等位基因频率为0.259。
β-FBG-455G/A基因多态性的分布频率在各个国家、民族甚至同一个国家的不同地区间亦不一致[4，5]。芬兰、英国、欧洲北、中、南部地区β-FBG-455 A等位基因频率为分别为0.205、0.204、0.229、0.221、0.213[4]；丹麦哥本哈根为0.203[2]；瑞典为0.25[6]。近年国外一些研究发现带有β-FBG-455-G/A或β-FBG-455A/A基因型的个体血浆Fbg水平明显高于β-FBG-455-G/G型[1，2]。A/A及G/A基因型个体的缺血性心脑血管疾病的发生率明显高于G/G型个体[1]。这种基因分布频率的不一致也就可能导致不同国家、不同民族甚至不同地区人群中血浆Fbg水平的差异，其后果是缺血性心脑血管的发病率和严重程度的不同。但也有作者认为β-FBG-455-G-A的突变仅与血浆纤维蛋白原水平有关，而与缺血性心脏病无明显相关[2]。到目前为止，我国尚无有关Fbg基因多态性检测及其与心脑血管疾病之间关系的报道。本文测定266例中国广东籍人β-FBG-455A等位基因频率为0.259。此基因频率比、丹麦、芬兰、英国及欧州北、中、南部6个地区高，但与瑞典报道的接近。β-FBG-455-G→A的突变的检测将对探讨中国人β-FBG-455-G/A与血浆Fbg水平以及我国心脑血管疾病的发病关系有一定意义。
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*本课题为1998年度国家卫生部科研资助课题，编号：98-1-348
海南医学院生化教研室：蔡望伟
参考文献
1 Behague l,Poirier O,Nicaud V,et al. β fibrinogen gene polymorphisms are associated with plasma fibrinogen and coronary artery disease in patients with myocardial infarction. The ECTIM Study.Circulation，1996，93：440
2 Tybjaerg-Hansen A,Agerholm-Larsen B,Humphries S E,et al. A common mutation(G-455→A)in the β-fibrinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen,but not of ischemic heart disease.A study of 9127 individuals based on the Copenhagen city heart study.J Clin lnvest，1997，99：3034
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3 Carter A M,Catto A J,Bamford J M,et al. Gender-specific associations of the fibrinogen B beta 448 polymorphism,fibrinogen levels,and acute cerebrovascular disease.Art Throm Vasc Biol，1997，17：589
4 Humphries S E,Shu Ye,Talmud P,et al. European Atherosclerosis Research Study:Genotype at the fibrinogen locus(G-455-Aβ-gene)is associated with differences in plasma fibrinogen levels in young men and women from different regions in Europe:evidence for gendergenotype-environment interaction.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995，15：96
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5 lso H,Folsom A R,Winkelmann J C,et al. Polymorphisms of the Beta fibrinogen gene and plasma fibrinogen concentration in Caucasian and Japanese population samples.Thromb Haemost，1995，73：106
6 Green F,Hamsten A,Blomback M, et al. The role of beta-fibrinogen genotype in determining plasma fibrinogen levels in young survivors of myocardial infarction and healthy controls from Sweden.Thromb haemost，1993，70(6)：915
(1999-02-02收稿，1999-05-28修回), 百拇医药
单位：刘国勋 李凤芹 杨勤 谢朝阳 凌光鑫 广东医学院附属医院血液研究室，广东湛江524001
关键词：β-纤维蛋白原；基因多态性；基因型频率
临床检验杂志990404 摘要 应用多聚酶链反应限制性酶切法，分析中国广东籍人β-纤维蛋白原-455 G/A(β-FBG-455-G/A)基因多态性。266例广东籍人DNA样品的β-FBG-455-G/A多态性中，发现β-FBG-455A/A纯合子10个，基因型频率0.038；β-FBG-455-G/G野生型138个，基因型频率为0.519；β-FBG-455G/A杂合子118个，基因型频率为0.444，A等位基因频率为0.259。提示中国广东籍人β-FBG-455A等位基因频率比欧州一些国家报道的高。
血浆纤维蛋白原(Fbg)水平增高是导致缺血性心脑血管疾病发病的主要独立因素。研究表明，Fbg基因多态性是导致个体间血浆Fbg水平差异的直接因素[1～3]。国外文献报道Fbg基因多态性达十余种，其中影响Fbg水平变化的大部分是编码β链的基因(即β-FBG基因)。目前对β-Fbg基因转录起始点上游455 bp的G→A改变的多态性(简称β-FBG-455-G/A基因多态性)方面研究较多，其表现为455-G/G、455-G/A、455-A/A三种基因型[1，2]。目前尚无中国人Fbg基因型多态性频率及分布规率的文献报道。最近我们建立了β-FBG-455-G/A基因多态性的检测方法并对266例广东籍人进行β-FBG-455-G/A基因多态性分析，现报告如下。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 266例广东籍医学生，男178例、女88例，年龄17～24，中值20.8岁。
1.2 DNA制备 按常规经蛋白酶消化与酚、氯仿抽提DNA。
1.3 引物序列 参考文献[2]通过PCR-Design软件，设计引物，上游引物5′ ATAGAATAGGGTA-TGAATTTG 3′，下游引物5′ GGCTGAACCAT-TTTATCATTT 3′。
1.4 PCR反应 反应体系为25 μl。终浓度为1×buffer，2 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，引物浓度各0.4 μmol/L，待测DNA 5 μl。25 μl反应液中含Taq DNA聚合酶0.6 U(上海华美公司)。使用美国GT1-2基因扩增仪，94°C变性50秒，55°C复性50秒，72°C延伸1分钟，共31个循环。吸取扩增后产物5 μl在25 g/L琼脂板120 V电泳，用溴乙啶染色，紫外线灯下观察。
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1.5 限制性内切酶分析 用内切酶(Biolabs产品)取产物15 μl，加限制性内切酶5 U及相应酶缓冲液进行酶切2小时。30 g/L琼脂糖电泳检测酶切结果。
1.6 受检PCR片段的测序 PCR产物经QIA quik试剂盒纯化后，用下游引物在ABI PRISMTM 377 DNA测序仪上进行直接测序。
2 结果和讨论
PCR扩增产物为一条446 bp的片段。由于β-FBG-455有一HaeⅢ酶切位点，PCR扩增产物经酶切后，30 g/L琼脂糖电泳检测发现有三种基因型，①β-FBG-455G/G基因型，产生348 bp及98 bp两个片段；②β-FBG-455A/A基因型，仅见一条446 bp片段；③β-FBG-455G/A基因型，分别产生446 bp、348 bp及98 bp三个片段，见图1。
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1为pUC mix marker 2为G/A杂合子；3，4为G/G野生型；5为A/A纯合子。
图1 β-FBG-455 PCR产物HeaⅢ酶切结果
分析266个DNA样品中β-FBG-455A/A纯合子10个，基因型频率为0.038；β-FBG-455G/G野生型138个，基因型频率为0.519；β-FBG-455-G/A杂合子118个，基因型频率为0.444。A等位基因频率为0.259。
β-FBG-455G/A基因多态性的分布频率在各个国家、民族甚至同一个国家的不同地区间亦不一致[4，5]。芬兰、英国、欧洲北、中、南部地区β-FBG-455 A等位基因频率为分别为0.205、0.204、0.229、0.221、0.213[4]；丹麦哥本哈根为0.203[2]；瑞典为0.25[6]。近年国外一些研究发现带有β-FBG-455-G/A或β-FBG-455A/A基因型的个体血浆Fbg水平明显高于β-FBG-455-G/G型[1，2]。A/A及G/A基因型个体的缺血性心脑血管疾病的发生率明显高于G/G型个体[1]。这种基因分布频率的不一致也就可能导致不同国家、不同民族甚至不同地区人群中血浆Fbg水平的差异，其后果是缺血性心脑血管的发病率和严重程度的不同。但也有作者认为β-FBG-455-G-A的突变仅与血浆纤维蛋白原水平有关，而与缺血性心脏病无明显相关[2]。到目前为止，我国尚无有关Fbg基因多态性检测及其与心脑血管疾病之间关系的报道。本文测定266例中国广东籍人β-FBG-455A等位基因频率为0.259。此基因频率比、丹麦、芬兰、英国及欧州北、中、南部6个地区高，但与瑞典报道的接近。β-FBG-455-G→A的突变的检测将对探讨中国人β-FBG-455-G/A与血浆Fbg水平以及我国心脑血管疾病的发病关系有一定意义。
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*本课题为1998年度国家卫生部科研资助课题，编号：98-1-348
海南医学院生化教研室：蔡望伟
参考文献
1 Behague l,Poirier O,Nicaud V,et al. β fibrinogen gene polymorphisms are associated with plasma fibrinogen and coronary artery disease in patients with myocardial infarction. The ECTIM Study.Circulation，1996，93：440
2 Tybjaerg-Hansen A,Agerholm-Larsen B,Humphries S E,et al. A common mutation(G-455→A)in the β-fibrinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen,but not of ischemic heart disease.A study of 9127 individuals based on the Copenhagen city heart study.J Clin lnvest，1997，99：3034
, http://www.100md.com
3 Carter A M,Catto A J,Bamford J M,et al. Gender-specific associations of the fibrinogen B beta 448 polymorphism,fibrinogen levels,and acute cerebrovascular disease.Art Throm Vasc Biol，1997，17：589
4 Humphries S E,Shu Ye,Talmud P,et al. European Atherosclerosis Research Study:Genotype at the fibrinogen locus(G-455-Aβ-gene)is associated with differences in plasma fibrinogen levels in young men and women from different regions in Europe:evidence for gendergenotype-environment interaction.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995，15：96
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5 lso H,Folsom A R,Winkelmann J C,et al. Polymorphisms of the Beta fibrinogen gene and plasma fibrinogen concentration in Caucasian and Japanese population samples.Thromb Haemost，1995，73：106
6 Green F,Hamsten A,Blomback M, et al. The role of beta-fibrinogen genotype in determining plasma fibrinogen levels in young survivors of myocardial infarction and healthy controls from Sweden.Thromb haemost，1993，70(6)：915
(1999-02-02收稿，1999-05-28修回), 百拇医药