我国流行性喘憋性肺炎呼吸道合胞病毒分离株F蛋白基因特征初探
作者：邓洁 王之梁 钱渊 耿学辉 孙晓鸥 朱汝南 刘成贵
单位：100020 首都儿科研究所北京感染与免疫中心实验室
关键词：肺炎；病毒性；呼吸道合胞病毒；蛋白质类；碱基序列
中华儿科杂志990509 【摘要】 目的 探讨流行性喘憋性肺炎(简称流喘肺炎)与散发肺炎呼吸道合胞病毒(RSV)分离株F蛋白的异同。方法 采用PCR片段直接测序及克隆测序，对11株流喘肺炎RSV分离株及5株散发肺炎RSV分离株F蛋白基因序列进行了分析比较。结果 被检测流喘肺炎RSV分离株中，36%(4/11) 的毒株其F蛋白基因3′非编码区(3′-NCR) (第1741位核苷酸) 存在6个核苷酸插入，而散发肺炎RSV分离株均无此插入存在。结论 RSV流喘肺炎分离株与散发肺炎分离株F蛋白基因的3′-NCR有差异。
A preliminary study on the characteristics of fusion protein genes of respiratory syncytial virus field strains isolated from children with epidemic asthma-like pneumonia DENG Jie, WANG Zhiliang, QIAN Yuan，et al. Capital Institute of Pediatrics, Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity，Beijing 100020
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To identify genetic differences among the fusion (F) protein genes of respiratory syncytial virus (RSV) field strains isolated from pediatric patients with epidemic asthma-like pneumonia and from regular pneumonia. Methods Direct sequencing of PCR products from partially amplified F genes and sequencing of cloned cDNA from F genes were used in this study. Results Among 11 strains isolated from epidemic asthma-like pneumonia, 4 (36%) had extra six nucleotides inserted into the 3′end non-coding region of the F gene, whereas none of the F genes from 5 strains isolated from regular pneumonia had that insertion. The χ2 test showed P>0.05. Conclusion There were differences among the F genes of RSV isolates from epidemic asthma-like pneumonia compared with those from regular pneumonia.
, 百拇医药
【Key words】 Pneumonia, viral Respiratory syncytial viruses Proteins Base sequence
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染、特别是毛细支气管炎最重要的病毒病原。RSV属副粘病毒科肺炎病毒属，为不分节段的负链RNA病毒，RSV病毒基因编码至少10个蛋白，其中两种病毒表面糖蛋白F蛋白和G蛋白是激发机体产生保护性抗体的最主要的病毒抗原[1]，F蛋白直接介导病毒与细胞的融合、病毒的穿入、合胞体的形成。与G蛋白不同，F蛋白基因变异小，在不同的亚型间具有高度的抗原同源性，是主要的交叉保护性抗原[2]。为了从分子基础来探讨RSV的致病性，本研究室对从不同地区、不同流行特征分离到的RSV进行了主要抗原结构蛋白的基因序列比较分析。在RSV F蛋白基因序列分析工作中，我们偶然发现一例流喘肺炎RSV分离株(E73)F蛋白基因3’非编码区有6个核苷酸插入[3]，而其他地区散发流行病例中分离到的毒株F蛋白均无此插入，这一发现引起了我们的注意，为进一步证实此插入的存在并探讨它是否为流喘肺炎分离株所特有的，又选取了同年份(1992年)本室分离的10株流喘肺炎RSV分离株及5株北京地区散发肺炎RSV分离株进行了RSV F蛋白基因序列比较分析。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
1.标本来源： (1) 1992年从河北地区婴幼儿流喘肺炎暴发流行患儿咽拭子中分离的RSV 11株(E1、E2、E3、 E10、E47、E49、E59、E69、E65、E73、E88)。(2)1992年从北京地区散发婴幼儿支气管肺炎患儿咽拭子中分离的RSV 5株(B67、B70、B75、B77、B98)。
2.主要试剂：M-MLV 逆转录酶购于GIBCO BRL。Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，Oligo(dT)15 primer 等均购于Promega公司。限制性内切酶，琼脂糖购于GIBCO BRL公司。克隆质粒载体PTZ18R购于友谊公司。T7 DNA测序试剂盒为Shanghai promega公司产品。DNA纯化柱子购于Millipor公司。
, 百拇医药
3.所使用的引物：用于PCR扩增计测序所需要的引物见表1。
表1 RSVF蛋白基因PCR扩增及测序引物 引物
位置(核苷酸)
序 列
功 能
P1
2～20
5′(ccgatggatcc)gggcaaataacaatggagt3′
PCR扩增
P2
1879～1899
, 百拇医药
5′(cgcccaagctt)atataactataaactaggaa3′
PCR扩增
P3
1879～1899
5′tatataactataaactaggaa3′
PCR扩增及测序
P4
1565～1578
5′gctggtaaatccaccac3′
PCR扩增
P5
, 百拇医药
401～417
5′agcaagaaaaggaaaag3′
测序
P6
700～717
5′actactagagattacca3′
测序
P7
1213～1229
5′cggagctgcttacatct3′
测序
P8
, 百拇医药
1493～1509
5′atcttctcattgacttg3′
测序
二、方法
1.用P3、P4作为PCR引物对16株RSV分离株进行了RSV F蛋白3′末端部分基因扩增(1565 bp～1899 bp，扩增产物为334 bp)及测序。PCR产物经Millipor柱子纯化后, 直接进行序列测定。其病毒RNA提取，cDNA合成，PCR扩增方法见文献[4]。PCR片段测序法见文献[5]。
2.选取两株RSV分离株进行RSV F蛋白全基因扩增及克隆测序，一株为有6个核苷酸插入的E49株，另一株为无插入的E65株。用P1、P2作为PCR引物进行F蛋白全基因扩增，经纯化后进行克隆及全基因序列测定。方法见文献[4]。
, 百拇医药
3.采用χ2检验对实验结果进行了统计学处理。结 果
一、RSV F蛋白基因3′末端序列测定结果
11株流喘肺炎RSV分离株中，有4株(E1、E49、E69和E73)的F蛋白基因在第1741位上有6个核苷酸(AAAAAT)的插入，5株非流喘肺炎RSV分离株均无此插入，两组比较经Fisher检验精确概率值P=0.1813(图1)。
E49为有核苷酸插入(AAAAAT)的分离株，E65为无核苷酸插入的分离株
图1 流喘肺炎RSV分离株F蛋白3′端NCR 6个核苷酸的插入位置
二、RSV F蛋白全基因序列分析结果
, 百拇医药
分别选择有6个核苷酸插入和无插入的流喘肺炎RSV分离株各1株(E49和E65)，与RSV原型株A2及散发RSV分离株B65(该分离株基因序列已知，见文献[3])进行了F蛋白全基因的核苷酸及氨基酸序列比较(图2)。分离株与原型株A2相比，有一定的核苷酸变异，但分离株之间变异位置及变异形式基本相同，与过去本室对RSV我国部分地方株F蛋白全基因测序结果一致。E49、E65、B65这三株分离株之间，在信号肽区、F1亚单位、F2亚单位的核苷酸同源性分别为97%～98.5%、98.2%～99.0%、98.0%～98.8%。氨基酸同源性分别为100%、99.1%～99.8%、98.2%～99.1%。在高变区3′非翻译区(E49的6个核苷酸插入未计算在内)，三株之间的核苷酸同源性为96.4%～98.2%，除6个核苷酸插入以外，其他变异是相似的。
A2为原型株;B65为北京地区散发肺炎分离株;E49为有6个核苷酸插入的流喘肺炎分离株;E65为无核苷酸插入的流喘肺炎分离株(方框标明的是起始和终止密码子；“*”表示有“AAAAAT”6个核苷酸插入)
, http://www.100md.com
图2 RSV F蛋白核苷酸序列测定结果
讨 论
我国自70年代以来已证明RSV为引起婴幼儿下呼吸道感染最主要的病毒病原，而且还是引起我国所特有的流行性喘憋性肺炎(简称流喘肺炎)的主要病原。流喘肺炎曾于1971年、1972年、1975年、1986年、1989年及1992年在我国一些地区出现过大规模的暴发流行，在短时间内出现数千乃至数万的病例，导致部分患儿死亡[6]，其他国家尚无类似流行的报告。为什么同是RSV，可以引起具有不同流行特征的疾病，是否抗原的变异导致大规模的暴发流行？本研究工作主要对我国特有的流喘肺炎的RSV分离株及同年份散发肺炎RSV分离株进行了F蛋白基因的序列测定，并与原型株A2株进行比较，以探讨流喘肺炎与散发肺炎RSV分离株F蛋白基因的异同。基因序列测定的结果显示，流喘肺炎分离株及散发肺炎分离株F蛋白基因的信号肽、F1亚单位、F2亚单位的氨基酸序列与原型株A2株相比，其变异的位置、形式基本相同。有4株流喘肺炎分离株在F蛋白3′非翻译区存在相同的6个核苷酸插入，其插入的位置完全相同(第1741位核苷酸)。而同年份北京的5株散发肺炎RSV分离株，均无此插入存在。除此插入外，流喘肺炎分离株与散发肺炎分离株的3’非翻译区的核苷酸变异是相似的。
, 百拇医药
本研究工作采用了cDNA克隆测序及PCR产物直接测序的方法，用两种方法都证实了在流喘肺炎分离株的F蛋白基因3′末端这6个核苷酸插入的存在，其存在的几率为36%(4/6)，而所测的5株散发肺炎RSV分离株均无此插入，目前因样本数少，两组差异无显著意义，但这一结果仍值得注意，待增加样本量进一步证实。另外，流喘肺炎的流行病学特征及临床症状与常见的呼吸道合胞病毒感染所致肺炎并不相同，其主要特点为患儿发病急，喘憋重，大规模暴发流行。从RSV我国部分地方株F蛋白基因的测序结果看，目前仅在流喘肺炎分离株中发现3′非翻译区有6个核苷酸的插入。从3′非翻译区的二级结构预测看，有6个核苷酸插入的F蛋白基因在该区域形成的茎环结构与原型株不同。有何意义尚不清楚。F蛋白是参与病毒与细胞、细胞与细胞之间融合的糖蛋白，其3′末端非翻译区在病毒的转录、复制及翻译过程中的作用机制目前尚不清楚，因此这6个核苷酸的插入与RSV的致病特点是否存在某种内在的联系也有待深入的研究。
本课题由卫生部科学基金、北京市科委新星计划项目资助(课题编号：951875400)
, 百拇医药
参考文献
1 Walsh EE, Schlesinger JJ, Brandriss MW, et al. Protection from respiratory syncytial virus infection in cotton rats by passive transfer of monoclonal antibodies infect. Immun, 1984, 43: 756-758.
2 Watt PJ, Zardis M, Lambden PR. Age related IgG subclass response to respiratory syncytial virus fusion protein in infected infants. Clin Exp Immunol, 1986, 64:503-509.
3 孙晓鸥，耿学辉，王之梁，等. 5株呼吸道合胞病毒地方株F蛋白基因序列分析. 中华微生物学和免疫学杂志, 1998, 18:295-300.
4 耿学辉, 王之梁, 钱渊，等. 呼吸道合胞病毒北京地区分离株G蛋白的基因分析. 病毒学报, 1996, 12:317-322.
5 陈虹, 杜晓娟, 伏瑾，等. 双链PCR产物直接测序方法介绍. 中华医学遗传学杂志, 1995, 12: 293.
6 黄达枢，邵向云. 关于喘憋性肺炎的喘憋问题和死因探讨. 中华儿科杂志, 1978,16:80-81.
(收稿：1998-05-25 修回：1999-01-22), 百拇医药
单位：100020 首都儿科研究所北京感染与免疫中心实验室
关键词：肺炎；病毒性；呼吸道合胞病毒；蛋白质类；碱基序列
中华儿科杂志990509 【摘要】 目的 探讨流行性喘憋性肺炎(简称流喘肺炎)与散发肺炎呼吸道合胞病毒(RSV)分离株F蛋白的异同。方法 采用PCR片段直接测序及克隆测序，对11株流喘肺炎RSV分离株及5株散发肺炎RSV分离株F蛋白基因序列进行了分析比较。结果 被检测流喘肺炎RSV分离株中，36%(4/11) 的毒株其F蛋白基因3′非编码区(3′-NCR) (第1741位核苷酸) 存在6个核苷酸插入，而散发肺炎RSV分离株均无此插入存在。结论 RSV流喘肺炎分离株与散发肺炎分离株F蛋白基因的3′-NCR有差异。
A preliminary study on the characteristics of fusion protein genes of respiratory syncytial virus field strains isolated from children with epidemic asthma-like pneumonia DENG Jie, WANG Zhiliang, QIAN Yuan，et al. Capital Institute of Pediatrics, Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity，Beijing 100020
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【Abstract】 Objective To identify genetic differences among the fusion (F) protein genes of respiratory syncytial virus (RSV) field strains isolated from pediatric patients with epidemic asthma-like pneumonia and from regular pneumonia. Methods Direct sequencing of PCR products from partially amplified F genes and sequencing of cloned cDNA from F genes were used in this study. Results Among 11 strains isolated from epidemic asthma-like pneumonia, 4 (36%) had extra six nucleotides inserted into the 3′end non-coding region of the F gene, whereas none of the F genes from 5 strains isolated from regular pneumonia had that insertion. The χ2 test showed P>0.05. Conclusion There were differences among the F genes of RSV isolates from epidemic asthma-like pneumonia compared with those from regular pneumonia.
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【Key words】 Pneumonia, viral Respiratory syncytial viruses Proteins Base sequence
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染、特别是毛细支气管炎最重要的病毒病原。RSV属副粘病毒科肺炎病毒属，为不分节段的负链RNA病毒，RSV病毒基因编码至少10个蛋白，其中两种病毒表面糖蛋白F蛋白和G蛋白是激发机体产生保护性抗体的最主要的病毒抗原[1]，F蛋白直接介导病毒与细胞的融合、病毒的穿入、合胞体的形成。与G蛋白不同，F蛋白基因变异小，在不同的亚型间具有高度的抗原同源性，是主要的交叉保护性抗原[2]。为了从分子基础来探讨RSV的致病性，本研究室对从不同地区、不同流行特征分离到的RSV进行了主要抗原结构蛋白的基因序列比较分析。在RSV F蛋白基因序列分析工作中，我们偶然发现一例流喘肺炎RSV分离株(E73)F蛋白基因3’非编码区有6个核苷酸插入[3]，而其他地区散发流行病例中分离到的毒株F蛋白均无此插入，这一发现引起了我们的注意，为进一步证实此插入的存在并探讨它是否为流喘肺炎分离株所特有的，又选取了同年份(1992年)本室分离的10株流喘肺炎RSV分离株及5株北京地区散发肺炎RSV分离株进行了RSV F蛋白基因序列比较分析。
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材料和方法
一、材料
1.标本来源： (1) 1992年从河北地区婴幼儿流喘肺炎暴发流行患儿咽拭子中分离的RSV 11株(E1、E2、E3、 E10、E47、E49、E59、E69、E65、E73、E88)。(2)1992年从北京地区散发婴幼儿支气管肺炎患儿咽拭子中分离的RSV 5株(B67、B70、B75、B77、B98)。
2.主要试剂：M-MLV 逆转录酶购于GIBCO BRL。Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，Oligo(dT)15 primer 等均购于Promega公司。限制性内切酶，琼脂糖购于GIBCO BRL公司。克隆质粒载体PTZ18R购于友谊公司。T7 DNA测序试剂盒为Shanghai promega公司产品。DNA纯化柱子购于Millipor公司。
, 百拇医药
3.所使用的引物：用于PCR扩增计测序所需要的引物见表1。
表1 RSVF蛋白基因PCR扩增及测序引物 引物
位置(核苷酸)
序 列
功 能
P1
2～20
5′(ccgatggatcc)gggcaaataacaatggagt3′
PCR扩增
P2
1879～1899
, 百拇医药
5′(cgcccaagctt)atataactataaactaggaa3′
PCR扩增
P3
1879～1899
5′tatataactataaactaggaa3′
PCR扩增及测序
P4
1565～1578
5′gctggtaaatccaccac3′
PCR扩增
P5
, 百拇医药
401～417
5′agcaagaaaaggaaaag3′
测序
P6
700～717
5′actactagagattacca3′
测序
P7
1213～1229
5′cggagctgcttacatct3′
测序
P8
, 百拇医药
1493～1509
5′atcttctcattgacttg3′
测序
二、方法
1.用P3、P4作为PCR引物对16株RSV分离株进行了RSV F蛋白3′末端部分基因扩增(1565 bp～1899 bp，扩增产物为334 bp)及测序。PCR产物经Millipor柱子纯化后, 直接进行序列测定。其病毒RNA提取，cDNA合成，PCR扩增方法见文献[4]。PCR片段测序法见文献[5]。
2.选取两株RSV分离株进行RSV F蛋白全基因扩增及克隆测序，一株为有6个核苷酸插入的E49株，另一株为无插入的E65株。用P1、P2作为PCR引物进行F蛋白全基因扩增，经纯化后进行克隆及全基因序列测定。方法见文献[4]。
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3.采用χ2检验对实验结果进行了统计学处理。结 果
一、RSV F蛋白基因3′末端序列测定结果
11株流喘肺炎RSV分离株中，有4株(E1、E49、E69和E73)的F蛋白基因在第1741位上有6个核苷酸(AAAAAT)的插入，5株非流喘肺炎RSV分离株均无此插入，两组比较经Fisher检验精确概率值P=0.1813(图1)。
E49为有核苷酸插入(AAAAAT)的分离株，E65为无核苷酸插入的分离株
图1 流喘肺炎RSV分离株F蛋白3′端NCR 6个核苷酸的插入位置
二、RSV F蛋白全基因序列分析结果
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分别选择有6个核苷酸插入和无插入的流喘肺炎RSV分离株各1株(E49和E65)，与RSV原型株A2及散发RSV分离株B65(该分离株基因序列已知，见文献[3])进行了F蛋白全基因的核苷酸及氨基酸序列比较(图2)。分离株与原型株A2相比，有一定的核苷酸变异，但分离株之间变异位置及变异形式基本相同，与过去本室对RSV我国部分地方株F蛋白全基因测序结果一致。E49、E65、B65这三株分离株之间，在信号肽区、F1亚单位、F2亚单位的核苷酸同源性分别为97%～98.5%、98.2%～99.0%、98.0%～98.8%。氨基酸同源性分别为100%、99.1%～99.8%、98.2%～99.1%。在高变区3′非翻译区(E49的6个核苷酸插入未计算在内)，三株之间的核苷酸同源性为96.4%～98.2%，除6个核苷酸插入以外，其他变异是相似的。
A2为原型株;B65为北京地区散发肺炎分离株;E49为有6个核苷酸插入的流喘肺炎分离株;E65为无核苷酸插入的流喘肺炎分离株(方框标明的是起始和终止密码子；“*”表示有“AAAAAT”6个核苷酸插入)
, http://www.100md.com
图2 RSV F蛋白核苷酸序列测定结果
讨 论
我国自70年代以来已证明RSV为引起婴幼儿下呼吸道感染最主要的病毒病原，而且还是引起我国所特有的流行性喘憋性肺炎(简称流喘肺炎)的主要病原。流喘肺炎曾于1971年、1972年、1975年、1986年、1989年及1992年在我国一些地区出现过大规模的暴发流行，在短时间内出现数千乃至数万的病例，导致部分患儿死亡[6]，其他国家尚无类似流行的报告。为什么同是RSV，可以引起具有不同流行特征的疾病，是否抗原的变异导致大规模的暴发流行？本研究工作主要对我国特有的流喘肺炎的RSV分离株及同年份散发肺炎RSV分离株进行了F蛋白基因的序列测定，并与原型株A2株进行比较，以探讨流喘肺炎与散发肺炎RSV分离株F蛋白基因的异同。基因序列测定的结果显示，流喘肺炎分离株及散发肺炎分离株F蛋白基因的信号肽、F1亚单位、F2亚单位的氨基酸序列与原型株A2株相比，其变异的位置、形式基本相同。有4株流喘肺炎分离株在F蛋白3′非翻译区存在相同的6个核苷酸插入，其插入的位置完全相同(第1741位核苷酸)。而同年份北京的5株散发肺炎RSV分离株，均无此插入存在。除此插入外，流喘肺炎分离株与散发肺炎分离株的3’非翻译区的核苷酸变异是相似的。
, 百拇医药
本研究工作采用了cDNA克隆测序及PCR产物直接测序的方法，用两种方法都证实了在流喘肺炎分离株的F蛋白基因3′末端这6个核苷酸插入的存在，其存在的几率为36%(4/6)，而所测的5株散发肺炎RSV分离株均无此插入，目前因样本数少，两组差异无显著意义，但这一结果仍值得注意，待增加样本量进一步证实。另外，流喘肺炎的流行病学特征及临床症状与常见的呼吸道合胞病毒感染所致肺炎并不相同，其主要特点为患儿发病急，喘憋重，大规模暴发流行。从RSV我国部分地方株F蛋白基因的测序结果看，目前仅在流喘肺炎分离株中发现3′非翻译区有6个核苷酸的插入。从3′非翻译区的二级结构预测看，有6个核苷酸插入的F蛋白基因在该区域形成的茎环结构与原型株不同。有何意义尚不清楚。F蛋白是参与病毒与细胞、细胞与细胞之间融合的糖蛋白，其3′末端非翻译区在病毒的转录、复制及翻译过程中的作用机制目前尚不清楚，因此这6个核苷酸的插入与RSV的致病特点是否存在某种内在的联系也有待深入的研究。
本课题由卫生部科学基金、北京市科委新星计划项目资助(课题编号：951875400)
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参考文献
1 Walsh EE, Schlesinger JJ, Brandriss MW, et al. Protection from respiratory syncytial virus infection in cotton rats by passive transfer of monoclonal antibodies infect. Immun, 1984, 43: 756-758.
2 Watt PJ, Zardis M, Lambden PR. Age related IgG subclass response to respiratory syncytial virus fusion protein in infected infants. Clin Exp Immunol, 1986, 64:503-509.
3 孙晓鸥，耿学辉，王之梁，等. 5株呼吸道合胞病毒地方株F蛋白基因序列分析. 中华微生物学和免疫学杂志, 1998, 18:295-300.
4 耿学辉, 王之梁, 钱渊，等. 呼吸道合胞病毒北京地区分离株G蛋白的基因分析. 病毒学报, 1996, 12:317-322.
5 陈虹, 杜晓娟, 伏瑾，等. 双链PCR产物直接测序方法介绍. 中华医学遗传学杂志, 1995, 12: 293.
6 黄达枢，邵向云. 关于喘憋性肺炎的喘憋问题和死因探讨. 中华儿科杂志, 1978,16:80-81.
(收稿：1998-05-25 修回：1999-01-22), 百拇医药