白三烯D4在促进培养的人气管平滑肌细胞增殖中的作用
作者：罗雅玲 文金序 徐健 朱建军
单位：(笫一军医大学南方医院呼吸科， 广东 广州 510515)
关键词：肌，平滑；白三烯类；增生；哮喘
中国病理生理杂志000316 [摘 要] 目的和方法：研究白三烯D4(LTD4)是否剌激培养的人气管平滑肌细胞(ASMC)增殖。将分离的人ASMC进行传代培养，在培养基中加入各种浓度的LTD4，计数细胞并测定[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入量和三磷酸肌醇(IP3)累积量。结果： LTD4在一定范围内(0.1 nmoL.L-1～10 nmoL.L-1)以浓度依赖的方式增加人ASMC(P<0.01)。LTD4也增加[3H]-TdR的掺入量和IP3累积量(P<0.01)。磷脂酶C抑制剂新霉素(1 μmol.L-1)阻止IP3累积量的增加(P<0.01)。结论：LTD4剌激培养的人ASMC增殖并且可能在哮喘的气道重塑中起了作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R 562.2+5 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0252-03
Role of leukotriene D4 in promoting proliferation of cultured human airway smooth muscle cells
LUO Ya-ling, WEN Jin-xu, XU Jian, ZHU Jian-jun
(Guangzhou Nan Fang Hospital Respiratory Department， Guangzhou 510515, China)
[Abstract] AIM： To investigate whether leukotriene D4(LTD4) would stimulates proliferation of cultured human airway smooth muscle (ASMC). METHOD： Human ASMC were isolated and subcultured, varying concentration of LTD4 were added to the media. Cell counts were obtained, [3H]-thymidine([3H]-TdR) incorporation and inositol 1, 4, 5-trisphosphate (IP3) accumulation were measured. RESULTS: LTD4(0.1 nmol.L-1～10 nmol.L-1) increased cell number and also increased incorporation of [3H]-TdR and accumulation of IP3 in a concentration dependent manner(P<0.01). The latter response was blocked by phospholipase C inhibition with neomycin (1 μmoL.L-1(P<0.01). However, neomycin had no effect on the promitogenic action of LTD4. CONCLUSION: LTD4 stimulates proliferation of cultured human ASMC and may play a role in airway remodeling of asthma.
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[MeSH] Muscle,smooth; Leukotrienes; Hyperplasia; Asthma
白三烯(leukotriene,LT)是哮喘发病过程中重要的炎症介质。白三烯D4(leukotriene D4，LTD4)能引起哮喘的主要病理变化，如气道平滑肌的收缩，血浆渗出，气道高反应性[1]，气道粘液分泌，促进感觉神经末梢释放速激肽而诱导神经元炎症等。已有报导LTD4拮抗剂能阻止鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell, ASMC)增殖[2]，但LTD4对ASMC，尤其对人ASMC的增殖作用尚末见报道。本研究旨在通过离体培养的人ASMC，观察LTD4对其增殖的影响。
材 料 和 方 法
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一、标本来源
意外死亡的正常人6例，征得家属同意，在死亡2 h之内，取靠近隆突的支气管作实验。
二、主要试剂
LTD4、新霉素(neomycin)、消炎痛(indomethacin)、Hams F-12培养基(Hams F-12 culture medium)、4型胶原酶(collagenase type 4型)、大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)、抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SM actin)单克隆抗体、抗细胞角蛋白抗体(anticytokeratin antibodies, CAMs)均购自Sigma公司。
三、人ASMC培养
按文献[6]上的方法，无菌剥离邻近隆突的气管片，以胶原酶消化法进行原代ASMC培养。7 d后，可见ASMC已贴壁生长，细胞呈梭形或长梭形，10～14 d后达到融合，高低起伏呈“峰、谷”状。用含20%胎牛血清的F-12培养基每周换液2次，待细胞长满瓶壁后，进行传代培养。第2～4代ASMC用于实验。用α-SM actin确认为人ASMC。光镜下，人ASMC经α-SM actin免疫组织化学显色后，免疫反应产物呈棕色，阴性对照片未见阳性细胞。用CAMs染色阴性，排除上皮细胞污染。
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四、细胞计数
人ASMC以1×107细胞/L的密度接种于25 cm3的培养瓶中，用有血清的F-12培养基培养24 h后,再用无血清的F-12培养基培养24 h,使细胞同步于G0期。分成6组,每组6瓶(来自6个不同人的气管),实验组加入不同浓度的LTD4，或LTD4和新霉素,或LTD4和消炎痛，对照组仅用无血清的F-12培养基培养，48 h后计数细胞。
五、[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,TdR)掺入量测定
人ASMC以1×107细胞/L的密度接种于24孔培养板上，在无血清的F-12培养基中培养24h后，每6孔分别加入含有不同浓度的LTD4，或者含有新霉素和LTD4，或者含有消炎痛和LTD4的无血清F-12培养基，另外6孔单独加入无血清的培养基作为对照组。24h后用10 kBq/孔的[3H]-TdR(美国Amersham公司试剂盒)标记12 h，常规消化，收集细胞，冼涤干燥，测每分钟放射性核素闪烁计数值(counts.min-1)。
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六、三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)累积量的测定
人ASMC以1×107细胞/L的密度接种于25 cm3培养瓶中，加含有20%胎牛血清的F-12培养基孵化1周后，分成6组，每组6瓶。3组加入不同浓度的LTD4，另外2组分别加入新霉素或消炎痛2 h后，再加入LTD4，还有1组作为对照组。24 h后收集细胞。细胞被标准化到1×106细胞，用6%高氯酸溶解，碳酸氢钠中和，保持在冰中1 h，离心(20?000×g,4℃,25 min),取出100μL上清液，用放射性配基竟争结合法测定IP3累积量(美国Amersham公司试剂盒)。
结 果
一、LTD4对人ASMC增殖的作用
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表1可见LTD4引起人ASMC增殖，其中10 nmol.L-1的LTD4引起增殖的细胞数最高。磷脂酶C抑制剂新霉素对于LTD4引起的细胞数的增长没有抑制作用。环氧化酶抑制剂10μmol.L-1的消炎痛对于10 nmol.L-1的LTD4引起的细胞数的增长有一定的抑制作用。
二、LTD4对[3H]-TdR掺入量的影响
表2显示LTD4能引起人ASMC的[3H]-TdR掺入量增长。其中以10 nmol.L-1的LTD4引起的[3H]-TdR掺入量最高。1μmol.L-1的新霉素不能阻止10 nmol.L-1的LTD4引起的[3H]-TdR掺入量的增加。10μmol.L-1的消炎痛对于10 nmol.L-1LTD4引起的[3H]-TdR掺入量的增加有一定的抑制作用。
, 百拇医药
三、LTD4对IP3累积量的影响
表3显示LTD4能引起人ASMC的IP3累积量增高，其中10 nmol.L-1的LTD4引起的IP3累积量最高。1μmol.L-1的新霉素明显抑制10 nmol.L-1的LTD4引起的IP3累积量的增加。
表1 白三烯D4 对培养的人气管平滑肌细胞增殖的作用
Tab 1 The effect of LTD4 on cultured airway smooth muscle cell (ASMC) proliferation (
±s,n=6) Group
, 百拇医药
Concentration(nmol.L-1)
ASMC count(cell/cm2)
Proliferation(% control)
Control
No stimulation
16550±1308
100.00±7.90
LTD4
0.1
19630±1260**
, 百拇医药
118.63±7.62**
10
22350±1300**
135.05±7.85**
1000
20200±970**
122.06±5.87**
LTD4+neomycin
101000
21630±970**
, 百拇医药
130.72±5.87**
LTD4+indomethacin
1010000
19470±1040**
117.62±6.28**
**P<0.01, vs control表2 白三烯D4对培养的人气管平滑肌细胞[3H]-胸腺嘧啶核苷结合的作用
Tab 2 The effect of LTD4 on [3H]-Thymidine ([3H]-TdR) in corporation in cultured human ASMC (±s,n=6) Group
, 百拇医药
Concentration(nmol.L-1)
[3H]-TdR(counts.min-1)
Proliferation(% control)
Control
10557±890
100.00±8.43
LTD4
0.1
13537±1080**
, 百拇医药
128.04±10.07**
10
16548±1204**
156.75±11.40**
1000
13342±974**
126.37±9.23**
LTD4+neomycin
10?1000
15700±716**
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148.73±6.78**
LTD4+indomethacin
10?10000
13800±855**
130.74±8.10**
**P<0.01, vs control表3 白三烯D4对培养的人气管平滑肌细胞三磷酸肌醇累积量的作用
Tab 3 The effect of LTD4 on inositol 1,4,5-trisphate [Ins(1,4,5)P3] accumulation in cultured human ASMC (±s,n=6) Group
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Concentration(nmol.L-1)
Ins(1,4,5)P3(pmols/106cell)
Proliferation(% control)
Control
11.38±1.07
100.00±9.42
LTD4
0.1
17.49±2.12**
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152.42±19.35**
10
28.36±1.39**
249.17±12.21**
1000
23.75±1.87**
208.69±16.41**
LTD4+neomycin
101000
16.17±1.77**
, 百拇医药
142.05±15.57**
LTD4+indomethacin
1010000
16.14±1.74**
141.80±15.32**
**P<0.01, vs control讨 论
人ASMC和动物ASMC的不同：(1)初次培养的人ASMC生长周期比动物ASMC长。一般豚鼠、兔ASMC初次接种后2～3 d后开始生长，7～8 d达到融合，而人ASMC 6～7 d开始生长，13～14 d达到融合。(2)人ASMC对白三烯等炎症介质增殖反应更明显。
, 百拇医药
气道高反应性是哮喘的本质，气道炎症是气道高反应性的基础。LT是花生四烯酸代谢产物，是炎症反应的重要介质。游离花生四烯酸产生LTA4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4，后3种有生物活性。LTD4是ASMC强有力的收缩剂，其收缩作用是组胺的1000倍。在哮喘发病过程中，嗜酸性、嗜碱性、中性粒、巨噬细胞在多种剌激下均可迅速释放大量LT，其药理作用广泛，对哮喘发病的多个环节均有影响，且作用强，维持时间长。近年来，在研究哮喘的发病机理中，人们不仅认识到气道炎症，而且注意了气道重塑[4，5]。气道重塑是支气管哮喘晚期的病理改变。主要是上皮纤维化，平滑肌增生，新血管形成。我们的实验通过计数细胞、[3H]-TdR掺入量和IP3累积量的测定证实LTD4能引起人ASMC的增殖。在气道中LTD4与受体结合[6]，通过磷脂酶C途径激活、分解磷脂酰二磷酸肌醇生成甘油二酯和三磷酸肌醇(IP3)，甘油二酯和IP3协同增加细胞内钙离子浓度，引起ASMC收缩和增殖。LTD4通过磷脂酶C激活受体，但在磷脂酶C抑制剂新霉素的作用下，IP3的合成虽受到抑制，LTD4的促增殖作用却没有受到影响。有报道血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)在兔ASMC引起内源性LTD4释放增加[7]，TXA2剌激兔ASMC增殖，这种作用不被新霉素阻滞，而被磷脂酶A2抑制剂和LTD4抑制剂所阻滞。我们推测LTD4的促有丝分裂作用可能与磷酯酶A2的活性有关。因此，ASMC的增殖，气管壁的重塑，有许多问题尚待研究。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Drazen JM,Austen KF. Leukotrienes and airway responses [J]. Am Rev Respir Dis, 1987,136(4):985～988.
[2] Wang CG,DU T,XUL F,et al. Role of leukotriene D4 in allergen induced increases in airway smooth muscle in the rat [J]. Am Rev Respir Dis, 1993,148:413～417.
[3] Panettieri RA,Murray RK, Depalo LR,et al. A human airway smooth muscle cell line that retain physiological responsiveness [J]. Am J Physiol,1989,256:C329～C335.
, http://www.100md.com
[4] James AL,Pare PD, Hagg JC. The mechanics of airway narrowing in asthma [J]. Am Rev Respir Dis,1989,139:242～296.
[5] Wiggs BR, Bosken C, Pare PD,et al.A model of airway narrowing in asthma and in chronic abstructive pulmonary disease [J]. Am Rev Respir Dis,1992,145：1251～1258.
[6] Lee M W, Severson D L.Signal transduction in vascular smooth muscle:diacylglycerol second messengers and PKC action [J]. Am J Physiol, 1994,267:C659～C678.
[7] Noveral J P ,Grunstein M M.Role and mechanism of thromboxane induced proliferation of cultured airway smooth muscle cells [J]. Am J Physil,1992,263:L555～L561.
[收稿日期] 1999-01-05 [修回日期] 1999-06-29
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单位：(笫一军医大学南方医院呼吸科， 广东 广州 510515)
关键词：肌，平滑；白三烯类；增生；哮喘
中国病理生理杂志000316 [摘 要] 目的和方法：研究白三烯D4(LTD4)是否剌激培养的人气管平滑肌细胞(ASMC)增殖。将分离的人ASMC进行传代培养，在培养基中加入各种浓度的LTD4，计数细胞并测定[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入量和三磷酸肌醇(IP3)累积量。结果： LTD4在一定范围内(0.1 nmoL.L-1～10 nmoL.L-1)以浓度依赖的方式增加人ASMC(P<0.01)。LTD4也增加[3H]-TdR的掺入量和IP3累积量(P<0.01)。磷脂酶C抑制剂新霉素(1 μmol.L-1)阻止IP3累积量的增加(P<0.01)。结论：LTD4剌激培养的人ASMC增殖并且可能在哮喘的气道重塑中起了作用。
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[中图分类号] R 562.2+5 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0252-03
Role of leukotriene D4 in promoting proliferation of cultured human airway smooth muscle cells
LUO Ya-ling, WEN Jin-xu, XU Jian, ZHU Jian-jun
(Guangzhou Nan Fang Hospital Respiratory Department， Guangzhou 510515, China)
[Abstract] AIM： To investigate whether leukotriene D4(LTD4) would stimulates proliferation of cultured human airway smooth muscle (ASMC). METHOD： Human ASMC were isolated and subcultured, varying concentration of LTD4 were added to the media. Cell counts were obtained, [3H]-thymidine([3H]-TdR) incorporation and inositol 1, 4, 5-trisphosphate (IP3) accumulation were measured. RESULTS: LTD4(0.1 nmol.L-1～10 nmol.L-1) increased cell number and also increased incorporation of [3H]-TdR and accumulation of IP3 in a concentration dependent manner(P<0.01). The latter response was blocked by phospholipase C inhibition with neomycin (1 μmoL.L-1(P<0.01). However, neomycin had no effect on the promitogenic action of LTD4. CONCLUSION: LTD4 stimulates proliferation of cultured human ASMC and may play a role in airway remodeling of asthma.
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[MeSH] Muscle,smooth; Leukotrienes; Hyperplasia; Asthma
白三烯(leukotriene,LT)是哮喘发病过程中重要的炎症介质。白三烯D4(leukotriene D4，LTD4)能引起哮喘的主要病理变化，如气道平滑肌的收缩，血浆渗出，气道高反应性[1]，气道粘液分泌，促进感觉神经末梢释放速激肽而诱导神经元炎症等。已有报导LTD4拮抗剂能阻止鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell, ASMC)增殖[2]，但LTD4对ASMC，尤其对人ASMC的增殖作用尚末见报道。本研究旨在通过离体培养的人ASMC，观察LTD4对其增殖的影响。
材 料 和 方 法
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一、标本来源
意外死亡的正常人6例，征得家属同意，在死亡2 h之内，取靠近隆突的支气管作实验。
二、主要试剂
LTD4、新霉素(neomycin)、消炎痛(indomethacin)、Hams F-12培养基(Hams F-12 culture medium)、4型胶原酶(collagenase type 4型)、大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)、抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SM actin)单克隆抗体、抗细胞角蛋白抗体(anticytokeratin antibodies, CAMs)均购自Sigma公司。
三、人ASMC培养
按文献[6]上的方法，无菌剥离邻近隆突的气管片，以胶原酶消化法进行原代ASMC培养。7 d后，可见ASMC已贴壁生长，细胞呈梭形或长梭形，10～14 d后达到融合，高低起伏呈“峰、谷”状。用含20%胎牛血清的F-12培养基每周换液2次，待细胞长满瓶壁后，进行传代培养。第2～4代ASMC用于实验。用α-SM actin确认为人ASMC。光镜下，人ASMC经α-SM actin免疫组织化学显色后，免疫反应产物呈棕色，阴性对照片未见阳性细胞。用CAMs染色阴性，排除上皮细胞污染。
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四、细胞计数
人ASMC以1×107细胞/L的密度接种于25 cm3的培养瓶中，用有血清的F-12培养基培养24 h后,再用无血清的F-12培养基培养24 h,使细胞同步于G0期。分成6组,每组6瓶(来自6个不同人的气管),实验组加入不同浓度的LTD4，或LTD4和新霉素,或LTD4和消炎痛，对照组仅用无血清的F-12培养基培养，48 h后计数细胞。
五、[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,TdR)掺入量测定
人ASMC以1×107细胞/L的密度接种于24孔培养板上，在无血清的F-12培养基中培养24h后，每6孔分别加入含有不同浓度的LTD4，或者含有新霉素和LTD4，或者含有消炎痛和LTD4的无血清F-12培养基，另外6孔单独加入无血清的培养基作为对照组。24h后用10 kBq/孔的[3H]-TdR(美国Amersham公司试剂盒)标记12 h，常规消化，收集细胞，冼涤干燥，测每分钟放射性核素闪烁计数值(counts.min-1)。
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六、三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)累积量的测定
人ASMC以1×107细胞/L的密度接种于25 cm3培养瓶中，加含有20%胎牛血清的F-12培养基孵化1周后，分成6组，每组6瓶。3组加入不同浓度的LTD4，另外2组分别加入新霉素或消炎痛2 h后，再加入LTD4，还有1组作为对照组。24 h后收集细胞。细胞被标准化到1×106细胞，用6%高氯酸溶解，碳酸氢钠中和，保持在冰中1 h，离心(20?000×g,4℃,25 min),取出100μL上清液，用放射性配基竟争结合法测定IP3累积量(美国Amersham公司试剂盒)。
结 果
一、LTD4对人ASMC增殖的作用
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表1可见LTD4引起人ASMC增殖，其中10 nmol.L-1的LTD4引起增殖的细胞数最高。磷脂酶C抑制剂新霉素对于LTD4引起的细胞数的增长没有抑制作用。环氧化酶抑制剂10μmol.L-1的消炎痛对于10 nmol.L-1的LTD4引起的细胞数的增长有一定的抑制作用。
二、LTD4对[3H]-TdR掺入量的影响
表2显示LTD4能引起人ASMC的[3H]-TdR掺入量增长。其中以10 nmol.L-1的LTD4引起的[3H]-TdR掺入量最高。1μmol.L-1的新霉素不能阻止10 nmol.L-1的LTD4引起的[3H]-TdR掺入量的增加。10μmol.L-1的消炎痛对于10 nmol.L-1LTD4引起的[3H]-TdR掺入量的增加有一定的抑制作用。
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三、LTD4对IP3累积量的影响
表3显示LTD4能引起人ASMC的IP3累积量增高，其中10 nmol.L-1的LTD4引起的IP3累积量最高。1μmol.L-1的新霉素明显抑制10 nmol.L-1的LTD4引起的IP3累积量的增加。
表1 白三烯D4 对培养的人气管平滑肌细胞增殖的作用
Tab 1 The effect of LTD4 on cultured airway smooth muscle cell (ASMC) proliferation (
±s,n=6) Group, 百拇医药
Concentration(nmol.L-1)
ASMC count(cell/cm2)
Proliferation(% control)
Control
No stimulation
16550±1308
100.00±7.90
LTD4
0.1
19630±1260**
, 百拇医药
118.63±7.62**
10
22350±1300**
135.05±7.85**
1000
20200±970**
122.06±5.87**
LTD4+neomycin
101000
21630±970**
, 百拇医药
130.72±5.87**
LTD4+indomethacin
1010000
19470±1040**
117.62±6.28**
**P<0.01, vs control表2 白三烯D4对培养的人气管平滑肌细胞[3H]-胸腺嘧啶核苷结合的作用
Tab 2 The effect of LTD4 on [3H]-Thymidine ([3H]-TdR) in corporation in cultured human ASMC (
±s,n=6) Group, 百拇医药
Concentration(nmol.L-1)
[3H]-TdR(counts.min-1)
Proliferation(% control)
Control
10557±890
100.00±8.43
LTD4
0.1
13537±1080**
, 百拇医药
128.04±10.07**
10
16548±1204**
156.75±11.40**
1000
13342±974**
126.37±9.23**
LTD4+neomycin
10?1000
15700±716**
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148.73±6.78**
LTD4+indomethacin
10?10000
13800±855**
130.74±8.10**
**P<0.01, vs control表3 白三烯D4对培养的人气管平滑肌细胞三磷酸肌醇累积量的作用
Tab 3 The effect of LTD4 on inositol 1,4,5-trisphate [Ins(1,4,5)P3] accumulation in cultured human ASMC (
±s,n=6) Group, http://www.100md.com
Concentration(nmol.L-1)
Ins(1,4,5)P3(pmols/106cell)
Proliferation(% control)
Control
11.38±1.07
100.00±9.42
LTD4
0.1
17.49±2.12**
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152.42±19.35**
10
28.36±1.39**
249.17±12.21**
1000
23.75±1.87**
208.69±16.41**
LTD4+neomycin
101000
16.17±1.77**
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142.05±15.57**
LTD4+indomethacin
1010000
16.14±1.74**
141.80±15.32**
**P<0.01, vs control讨 论
人ASMC和动物ASMC的不同：(1)初次培养的人ASMC生长周期比动物ASMC长。一般豚鼠、兔ASMC初次接种后2～3 d后开始生长，7～8 d达到融合，而人ASMC 6～7 d开始生长，13～14 d达到融合。(2)人ASMC对白三烯等炎症介质增殖反应更明显。
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气道高反应性是哮喘的本质，气道炎症是气道高反应性的基础。LT是花生四烯酸代谢产物，是炎症反应的重要介质。游离花生四烯酸产生LTA4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4，后3种有生物活性。LTD4是ASMC强有力的收缩剂，其收缩作用是组胺的1000倍。在哮喘发病过程中，嗜酸性、嗜碱性、中性粒、巨噬细胞在多种剌激下均可迅速释放大量LT，其药理作用广泛，对哮喘发病的多个环节均有影响，且作用强，维持时间长。近年来，在研究哮喘的发病机理中，人们不仅认识到气道炎症，而且注意了气道重塑[4，5]。气道重塑是支气管哮喘晚期的病理改变。主要是上皮纤维化，平滑肌增生，新血管形成。我们的实验通过计数细胞、[3H]-TdR掺入量和IP3累积量的测定证实LTD4能引起人ASMC的增殖。在气道中LTD4与受体结合[6]，通过磷脂酶C途径激活、分解磷脂酰二磷酸肌醇生成甘油二酯和三磷酸肌醇(IP3)，甘油二酯和IP3协同增加细胞内钙离子浓度，引起ASMC收缩和增殖。LTD4通过磷脂酶C激活受体，但在磷脂酶C抑制剂新霉素的作用下，IP3的合成虽受到抑制，LTD4的促增殖作用却没有受到影响。有报道血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)在兔ASMC引起内源性LTD4释放增加[7]，TXA2剌激兔ASMC增殖，这种作用不被新霉素阻滞，而被磷脂酶A2抑制剂和LTD4抑制剂所阻滞。我们推测LTD4的促有丝分裂作用可能与磷酯酶A2的活性有关。因此，ASMC的增殖，气管壁的重塑，有许多问题尚待研究。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-01-05 [修回日期] 1999-06-29
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