反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质细胞的作用
作者：黄其林 蔡文琴 张可成
单位：黄其林(第三军医大学新桥医院神经外科，)；蔡文琴(第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400037)；张可成(第三军医大学新桥医院神经外科，)
关键词：星形胶质细胞；逆转录病毒；胶原纤维酸性蛋白；脑损伤
解剖学报000202 【摘要】 目的 构建反义GFAP逆转录病毒表达载体，评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞(Ast)形态及GFAP基因表达的影响。 方法 用定向克隆技术，将1.1kb的GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN上，获得重组体PLBskG，经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等，挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养，收获病毒上清液感染体外培养的Ast，通过免疫组织化学、原位杂交、RT-PCR、Southern blot和流式细胞仪分析等方法，研究PLBskG对正常及损伤Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响。 结果 插入PLBskG中的GFAPcDNA片段序列、方向完全正确，Southern杂交及RT-PCR分析表明，PLBskG成功整合入PA317细胞中，并实现了在NIH3T3细胞中的表达。PLBskG使正常及反应性Ast生长抑制，G1期阻滞，Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩，核浆比例增大。GFAP免疫组织化学染色减弱；GFAP mRNA表达水平降低。 结论 获得了构建正确的反义GFAP逆转录病毒表达载体，并证实其对正常及反应性Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响，为深入研究Ast反应及GFAP基因的功能创造了条件。
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【中图分类号】Q189 【文献标识码】A
【文章编号】0529-1356(2000)02-102
THE CONSTRUCTION OF ANTISENSE GFAP RETROVIRUS
EXPRESSING VECTOR AND THE EFFECT ON ASTROCYTE
HUANG Qi-lin,ZHANG Ke-cheng
(Department of Neurosurgery,Xingqiao Hospital,)
CAI Wen-qin
(the Third Military Medical University,Chongqing 400037,China)
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【Abstract】 Objective
To recombinant antisense GFAP retrovirus expressing vector and to investigate its effect on morphology and GFAP expression of normal,reactive astrocyte. Methods A 1.1kb from the coding region of mouse GFAP gene was cloned in the antisense orientation to PLXSN,a retrovirus vector.The recombinant expressing vector was named as PLBskG.The efficiency of PLBskG on the growth,cell cycle,morphology and GFAP gene expression of normal and reactive astrocyte in vitro was investigated by cell growth curve,flow cytometer immunocytochemistry,in situ hybridization,RT-PCR,Southern blot. Results The sequence and the orientation of GFAP cDNA fragment inserted into PLBskG was completely accuracy.The PLBskG was successfully conformed into PA317 cell and expressed in NIH3T3 cell as showed by Southern blot and RT-PCR analyze.The PLBskG infection resulted in growth suppression and G1 stage arrest of the normal and scratched astrocyte.The normal and reactive astrocytes infected by PLBskG became round or ellipse.The process of this cell became fine or retracted,the ratio of nuclei/cytoplasm was larger.The staining of GFAP substance was reduced and transcription level of GFAP mRNA was down-regulated. Conclusions We obtained a normal construction of the antisense GFAP retrovirus expressing vector,and confirmed that this vector could effectively inhibit the growth and GFAP expression of normal and reactive astrocyte in vitro.
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【Key words】 Astrocyte;Retrovirus;Glial fibrillary acidic protein;Brain injury
星形胶质细胞(astrocyte,Ast)在中枢神经系统(CNS)中起着重要的作用，它不仅参与了CNS各种生理功能的调节，而且在CNS的多种病理变化中，尤其是在CNS的损伤修复中起着重要的作用。研究发现，胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)对维持Ast的形态结构及功能具有重要作用，抑制GFAP基因表达，可能影响Ast的生长、增殖，以及Ast对损伤的反应[1]。反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的，与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性的与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。本研究采用基因重组技术，成功构建了反义GFAP逆转录病毒表达载体，通过体外实验研究了其对培养正常及反应性Ast形态结构、GFAP基因表达的影响，并探讨了作用机制与意义。
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材料和方法
1. 主要材料
内切酶SaⅡ、HindⅢ、EcoRI、XhoI及M-MLV逆转录酶为Promega公司产品，Lipofectin、G418、Dulbecco' modified Eagle medium(DMEM)为GIBCO公司产品，细胞系PA317、NIH3T3、ψ2为军事医学科学院贺福初研究员惠赠，胎牛血清为天津血制品研究所产品，TriPure试剂盒为宝灵曼公司产品，免疫组织化学与原位杂交试剂为中山公司产品。
2. 重组反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
质粒pBR322/GFAP(含GFAP基因第1外显子起始密码区1.1kb DNA片段，由美国纽约大学医学中心Nicholas J.Cowan教授惠赠，用Sal I和Hind Ⅲ双酶切后，回收目的片段，亚克隆至pBluscript sk-载体上，重组子命名为BskG。在插入位点的外侧，用EcoRI和XhoI双酶切BskG质粒，回收目的片段，反向插入逆转录病毒载体PLXSN上，重组子命名为PLBskG，酶切鉴定及序列分析。
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3. 病毒包装与滴度测定
PLBskG及空载体PLXSN质粒用脂质体Lipofectin包裹后转染PA317细胞，G418筛选2周，随机挑选各4个克隆细胞扩增培养，收获病毒上清，感染NIH3T3细胞，G418筛选，根据克隆形成数，计算病毒滴度。挑选滴度高的克隆细胞继续扩增培养。收获的病毒上清，交叉感染ψ2及PA317细胞，重复两次，再次测定病毒滴度。
4. Southern杂交鉴定PLBskG在包装细胞中的整合
提取病毒感染的PA317细胞基因组DNA，酶切后，凝胶电泳分离，转NC膜，32P-GFAPcDNA探针进行Southern杂交。
5. RT-PCR检测目的基因在NIH3T3细胞中的表达
用TriPure试剂盒提取PLBskG感染的NIH3T3细胞总RNA，经M-MLV逆转录酶反转录成cDNA后，PCR扩增，凝胶电泳分析。GFAP引物上游序列为：5′-CTGAATTCTGCTGGCTTCA-AGG-3′，下游序列：5′-CTAAGCTTGCTCTGCG-TTGCGG-3′，扩增片段增长624bp。β-actin引物上游序列为，5′-GCG-GGAAATCGTGCTGACATT-3′，下游序列为5′-GATGGAGTTGAAGGTAGT-TTCGTG，扩增片段长314bp。扩增条件：94℃,4min；接94℃,30s;60℃,1min;72℃,1min;循环30次后，接72℃,7min。
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6. Ast分离培养
取新生当天Wistar大鼠皮层组织，制成细胞悬液。200目金属滤网过滤，收集滤液，转入培养瓶中，补加含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5%CO2孵箱培养24h，细胞贴壁后换液。继续培养至约90%融合时，0.25%胰酶消化，传3～4代，纯化Ast培养。
7. 反应性Ast体外模型的建立
改良Yu[2]等建立的体外培养Ast划伤模型，采用点搓法造成Ast损伤，即取24孔板，每孔中置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片，Ast生长在经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，达80%～90%融合后，用自制消毒橡皮头，无菌钳夹持后，在盖片的不同部位上轻轻点搓3～4次，制成体外Ast损伤模型。加D-Hank清洗1次，去除损伤碎片，补加新鲜培养基继续培养。
8. PLBskG感染靶细胞
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取病毒上清1ml,滴加在50%～60%融合的培养Ast上，37℃,5%CO2孵箱中孵育3h，补充含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。
9. PCR扩增Neo基因鉴定PLBskG在靶细胞中的整合
提取PLBskG感染的培养Ast细胞基因组DNA，PCR扩增。反应条件：94℃，4min;接94℃,30s;60℃,1min;72℃,1min，循环30次后，接72℃,7min。Neo基因引物上游序列为5′-CGAGGCAGCGCGGCTATCGT-3′，下游序列为5′-ACGT-GCTCGCTCGA-TGCGAT-3′，扩增片段长度240bp。
10. RT-PCR检测靶细胞中GFAP mRNA基因的表达
提取PLBskG及PLXSN感染的正常Ast、划伤Ast细胞总RNA，经M-MLV反转录成cDNA后，PCR扩增。
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11. 生长曲线测定
Ast按1×105接种24孔板，长至60%融合后，弃培养基，每孔加病毒上清1ml,24h后，换含10%胎牛血清的新鲜培养液，分别于换液后0、1、3、5d，各取3孔细胞，胰酶消化后，收集细胞，台盼蓝染色，计数活细胞，取平均值，绘制生长曲线。
12. 生长周期检测
收集培养的正常Ast、划伤Ast及病毒感染后0、1、3、5d的细胞，碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色，流式细胞仪检测。
13. 免疫细胞化学染色(ICC)
生长于盖玻片上的Ast，经70%酒精+10%冰醋酸固定30min后，按本室常规方法进行ICC染色[3]。
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14. 原位杂交
生长于盖玻片上的Ast，经4%多聚甲醛固定5min后，用Dig-GFAP cRNA探针，按本室常规方法进行原位杂交[3]。
15. 统计学处理
采用计算机统计程序对所得数据作单因数方差分析。
结 果
1. 反义GFAP重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
重组子BskG经酶切后，凝胶电泳证实，1.1kb的插入片段与载体成功连接；序列分析表明，插入片段的序列与方向与文献报道完全一致。回收目的片段后，定向克隆至pLXSN载体上，获得的重组子PLBskG经酶切鉴定，构建正确(图1)。
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图1 重组反义GFAP逆转录病毒PLBskG酶切图谱
a.λDNA/EorRI+Hind Ⅲ marker b.回收的GFAP片段 c.重组PLBskG质粒 d.PLBskG质粒EcoRI酶切图谱 e.PLBskG质粒XhoI+EcoRI双酶切图谱
Fig.1 The electrophoresis of restriction enzyme digest of PLBskG
a,λDNA/EorRI+Hind Ⅲ marker b,fragment of GFAP c,plasmid of PLBskG d,restriction enzyme of PLBskG by EcoR I e,restriction enzyme of PLBskG by XhoI and EcoRI
2. 病毒滴度测定
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收获的第1代病毒上清液，滴度为：PLBskG 5.2×104，pLXSN 5.6×104，交叉感染ψ2及PA317细胞后，PLBskG滴度上升为4.8×105，pLXSN滴度上升为3.7×105。
3. Southern杂交
获得清晰的阳性杂交带，表明PLBskG在包装细胞中成功实现了整合(图2)。
图2 Southern blot鉴定PLBskG在PA317细胞中的整合
a.PA317/PLBskG克隆细胞1个月 b.PA317/PLBskG克隆细胞2个月
Fig.2 Identification of integration of DNS of PLBskG in PA317 cell by Southern blot
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a,one month,PA317/PLBskG clone cells b,two months,PA317/PLBskG clone cells
4. RT-PCR
扩增产物经凝胶电泳分析，获得了1条620bp的阳性扩增带，表明PLBskG在NIH3T3细胞中成功表达。
5. Ast纯化培养及划伤模型的建立
分离细胞接种于培养基中，24h后，存活细胞贴壁，5～7d后，细胞分层铺满瓶底。胰酶消化，传3～4代，形成大致均一的单层细胞，为扁平、多角形，并具有短而粗大的突起，GFAP免疫组织化学染色阳性。如此传代培养的Ast，其纯度达95%以上。划伤Ast 24h后，可见细胞体积增大，长出突起，3～4d后突起变细长，彼此交织，成网状聚集，GFAP免疫组织化学染色增强。
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6. PLBskG对正常Ast及损伤Ast的影响
PLBskG感染培养正常Ast在48h后，可见Ast细胞体积缩小，胞浆减少，突起回缩；3～5d后，Ast形态明显改变，胞体变成圆形，或椭圆形；胞浆显著减少，胞突变细，回缩，胞核无明显改变，核浆比例增大，GFAP免疫组织化学染色强度减弱；原位杂交显示GFAP mRNA表达降低。PLBskG感染损伤Ast后，可见Ast增大的胞体缩小，呈圆形、椭圆形或不规则形，突起回缩，部分细胞甚至无明显突起形成；GFAP免疫组织化学染色变浅，原位杂交见GFAP mRNA表达水平明显下降，反应性胶质化的典型特征消失(图3)。
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图3 PLBskG对损伤Ast的影响。A.培养正常Ast的免疫组织化学染色；B.损伤3d后Ast的免疫组织化学染色：细胞呈团状聚集，GFAP染色增强，突起增多，呈网状聚集；C.PLBskG感染划伤Ast 3d后免疫组织化学染色，显示细胞突起回缩，GFAP染色减弱，核/浆比例增大×200；D.PLBskG感染划伤Ast 3d后原位杂交：Ast表达GFAP mRNA水平下降，反应性胶质化的典型特征消失 ×200
Fig.3 The effect of PLBskG on injured astrocytes.
A,The immunocytochemistry stain of normal astrocyte.The astrocytes appeared as round or irregular,their processes were thick and short. ×400
, 百拇医药 B,The immunocytochemistry stain of 3 days after injured astrocyte:the injured astrocyte get together,the stain of GFAP stranger,the process increased, ×200
C,The immunocytochemistry stain of 3days after the injured astrocytes infected by PLBskG.These cells appeared to have smaller,round,ellipoid or irregular cell bodies,their cytoplasmic processes extracted,GFAP staining reduced. ×200
D,The in situ hybridization of 3 days after the injured astrocytes infected by PLBskG.The expression of GFAP mRNA reduced,the reactive gliosis characteristic of injured astrocyte disappeared. ×200
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7. PCR扩增Neo基因
扩增产物经凝胶电泳分析可见250bp的阳性扩增条带影，片段大小与设计吻合，表明PLBskG成功整合入宿主细胞中。
8. 细胞生长曲线
PLBskG感染培养正常Ast及损伤Ast后，Ast生长抑制，而PLXSN感染培养正常Ast及损伤Ast后，抑制作用不明显(图4)。
图4 PLBskG感染正常及损伤Ast后细胞生长曲线(×105)
Fig.4 Cell growth curve after PLBskG infecting normal
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and injurd astrocyte(×105)
9. 细胞增殖周期分析
PLBskG感染正常Ast及划伤Ast后，G1期细胞增多，S期及G2M期细胞明显减少，而PL对正常及划伤Ast细胞增殖周期无明显影响。
10. RT-PCR检测靶细胞中GFAP基因表达水平
PLBskG感染正常Ast及损伤Ast后，其GFAP mRNA表达水平下降，而PLXSN对正常及损伤Ast GFAPmRNA无显著影响(图5)。
图5 RT-PCR检测PLBskG感染培养划伤
, http://www.100md.com Ast的GFAP基因表达
a.pLXSN感染组；b.PLBskG感染1d;c.PLBskG感染3d；d.PLBskG感染5d；e.PLBskG感染7d；f.φ174/Hae marker
Fig.5 Analysis of expression of GFAP mRNA by RT-PCR.
a,lanes:pLXSN infection group.b,lanes:1 day after infected by PLBskG,c,lanes:3 days after infected by PLBskG;d,lanes:5 days after infected by PLBskG,e,lanes:7 days after infected by PLBskG;f,φ 174/Hae marker
讨 论
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GFAP基因最早由Lewis等在1984年克隆并测序。该序列包含8个内含子，9个外显子，由9 971个碱基组成。GFAP基因与其他中间丝序列，尤其是结蛋白和波形蛋白的碱基序列具有较高的同源性，其中与结蛋白的同源性达65%，与波形蛋白的同源性达67%，它们在进化上都属于保守性较高的序列。所不同的是，GFAP基因内含子中含有大量与Alu序列密切相关的重复序列，该序列很可能是一个插入元件。另一个有意义的结合特征就是其羧基端的丝氨酸和苏氨酸残基的高度保守性。这些氨基酸可能是中间丝的磷酸化和翻译后修饰的潜在部位，提示这些部位可能是GFAP的重要功能部位。
GFAP的确切功能尚不清楚。从本实验结果看，反义GFAP逆转录病毒感染培养正常Ast后，Ast的生长延缓、胞体缩小、变圆，突起回缩，核浆比例增大，提示GFAP对维持Ast形态结构的完整性起重要作用，并决定着Ast对损伤反应的程度。
Ast对CNS各种损伤均表现出迅速而活跃的反应，以反应性胶质化为特征。Ast介导的多种病理生理反应均是在反应性胶质化的基础上发生、发展的。尽管激活Ast反应的确切机制尚不清楚，但大量的资料表明，损伤、炎症、变性坏死的组织碎片、缺血、缺氧等因素均可诱导Ast起反应，提示Ast反应是一个十分复杂的病理生理过程[4，5]。然而，这些因素在在体情况下没有一种是容易控制的，使得分析和评价Ast对损伤的反应比较困难。如何解决这一难题对于研究反应性胶质化的机制，以及Ast在胶质瘢痕形成中的作用十分重要。Yu等[2]在体外分离培养Ast的基础上，利用机械划伤培养Ast的办法复制出具有反应性胶质化典型特征的体外培养模型，称之为“培养皿的划伤模型”(scratch disk model)，为体外研究Ast反应创造了良好的条件。本实验在复制体外培养Ast损伤模型时，按照Yu等介绍的方法用橡皮头擦划培养物以制作Ast的反应性胶质化，发现该方法易造成伤道边缘Ast的严重损伤和伤道中心部位Ast的完全脱落，在继续培养中，Ast反应迟缓，往往需2～3d才表现出典型的Ast反应性改变，而且在1张盖片上至多仅能划2～3道，损伤的范围较小。本实验采用点搓法，在盖片上多点损伤，点搓范围较小，既造成了Ast的损伤，又不至于使Ast从盖玻片上完全擦掉，损伤程度适中，Ast对损伤的反应出现较早，往往在伤后1d即可见到典型的Ast反尖。免疫组织化学染色显示，Ast呈现出反应性胶质化的典型特征表现，效果满意。体外分离培养Ast作为研究Ast的各种生理、病理反应具有许多优点。首先，Ast纯化培养比较容易，可以形成能传代的二倍体细胞系；其次，Ast在培养基中生长稳定，不易自发转化，保持了在体情况下的生理功能和对外界因素刺激的良好反应性；再者，纯化培养的Ast，既无神经元存在，又消除了在体情况下各种因素对Ast的影响，对Ast施加的各种干扰因素也很容易控制。因此，利用培养Ast作为模拟在体条件下Ast的功能不失为一个良好的体外模型。
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从免疫组织化学和原位杂交的结果来看，反应性胶质化的显著特征表现为GFAP表达上调。大量GFAP的堆积可能是造成反应性Ast胞体肥大，突起增粗、延长的主要原因。而GFAP作为构成Ast细胞骨架的主要成分，对于维持Ast形态结构的稳定至关重要。因此，如果能够抑制GFAP基因的表达，将有望抑制Ast的生长和反应性胶质化的形成。反义核酸技术的创立与应用为解决这一难题带来了希望。利用基因工程技术，在适宜的启动子和增强子之间反向插入一段靶基因，使其表达反义RNA，通过与靶mRNA的结合，阻止mRNA的翻译；或者人工合成一段反义RNA，抑制靶mRNA的表达，均可达到特异性抑制靶基因表达的目的。Yu等人最先利用人工合成的反义RNA，成功抑制了培养Ast的GFAP基因表达，减轻了反应性胶质化的发生，从理论和实践上为利用基因工程技术达到减轻反应性胶质化的目的奠定了基础。然而，人工合成的反义RNA，具有作用时间短暂(一般3～5d)的特点，相对GFAP基因表达在1～2周后达高峰的时间过余短暂，其效果难尽人意。逆转录病毒具有整合入基因组中稳定表达的特点，作为基因的运载工具是目前研究较为成熟的一种[6]。本实验针对GFAP基因结构的特点，将含编码GFAP基因第1外显子起始密码区的一段长约1.1kb的cDNA质粒反向插入逆转录病毒载体中，通过病毒DNA整合到Ast基因组中，利用LTR启动反义GFAP基因的转录，合成反义RNA，特异性的封闭GFAP mRNA的表达。结果表明，重组逆转录病毒感染正常Ast，使其胞体变圆，突起变细、回缩。细胞生长曲线表明，Ast呈生长抑制状态，细胞周期分析发现，G1期阻滞。免疫细胞化学染色及原位杂交结果显示，GFAP基因表达明显抑制。重组逆转录病毒感染划伤Ast后，Ast对划伤的反应明显抑制，与单纯划伤Ast及空载体PLXSN感染的Ast比较，肥大的胞体缩小，呈圆形或椭圆形，突起变细、甚至完全回缩；GFAP免疫组织化学染色变浅，原位杂交和RT-PCR结果均提示GFAP mRNA表达下降。因此，从本实验结果看，重组反义GFAP逆转录病毒能有效的抑制GFAP基因表达，以及Ast对损伤的反应，提示利用重组反义GFAP逆转录病毒抑制Ast对损伤的反应，将有可能在体内抑制或延缓胶质瘢痕形成，从而，为神经再生和功能重建创造良好的微环境。
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【基金项目】97重庆市青年科研基金及全军九五面上基金资助项目(96M090)
作者简介：黄其林(1960—)，男(汉族)，重庆市人，医学博士，主治医师，讲师
参考文献
[1]Liedtke W,Edelmann W,Bieri PL,et al.GFAP in necessary forth the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination[J].Neuron,1996,17(4):607-615.
[2]Yu ACH,Lee YL,Eng LF.Inhibition of GFAP synthesis by antisense RNA in astrocytes[J].J Neuroscience Res,1991,30(1):72-79.
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[3]蔡文琴，王伯云主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版社，1994：82-86.
[4]Eddleston M,Mucke L.Molecular profile of reactive astrocytes-implications for their role in neurologic disease[J].Neurosci 1993,54(1):15-36.
[5]Lucas RL,Salm AK.Astroglia proliferate in response to oxytocin and vaso- pressin[J].Brain Res,1995,681(1-2):218-222.
[6]Vile RG,Russell SJ.Retroviruses as vectors[J].British Medical Bulletin,1995,51(1):12-30.
【收稿日期】1999-03-09
【修稿日期】1999-08-17, http://www.100md.com
单位：黄其林(第三军医大学新桥医院神经外科，)；蔡文琴(第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400037)；张可成(第三军医大学新桥医院神经外科，)
关键词：星形胶质细胞；逆转录病毒；胶原纤维酸性蛋白；脑损伤
解剖学报000202 【摘要】 目的 构建反义GFAP逆转录病毒表达载体，评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞(Ast)形态及GFAP基因表达的影响。 方法 用定向克隆技术，将1.1kb的GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN上，获得重组体PLBskG，经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等，挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养，收获病毒上清液感染体外培养的Ast，通过免疫组织化学、原位杂交、RT-PCR、Southern blot和流式细胞仪分析等方法，研究PLBskG对正常及损伤Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响。 结果 插入PLBskG中的GFAPcDNA片段序列、方向完全正确，Southern杂交及RT-PCR分析表明，PLBskG成功整合入PA317细胞中，并实现了在NIH3T3细胞中的表达。PLBskG使正常及反应性Ast生长抑制，G1期阻滞，Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩，核浆比例增大。GFAP免疫组织化学染色减弱；GFAP mRNA表达水平降低。 结论 获得了构建正确的反义GFAP逆转录病毒表达载体，并证实其对正常及反应性Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响，为深入研究Ast反应及GFAP基因的功能创造了条件。
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【中图分类号】Q189 【文献标识码】A
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THE CONSTRUCTION OF ANTISENSE GFAP RETROVIRUS
EXPRESSING VECTOR AND THE EFFECT ON ASTROCYTE
HUANG Qi-lin,ZHANG Ke-cheng
(Department of Neurosurgery,Xingqiao Hospital,)
CAI Wen-qin
(the Third Military Medical University,Chongqing 400037,China)
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【Abstract】 Objective
To recombinant antisense GFAP retrovirus expressing vector and to investigate its effect on morphology and GFAP expression of normal,reactive astrocyte. Methods A 1.1kb from the coding region of mouse GFAP gene was cloned in the antisense orientation to PLXSN,a retrovirus vector.The recombinant expressing vector was named as PLBskG.The efficiency of PLBskG on the growth,cell cycle,morphology and GFAP gene expression of normal and reactive astrocyte in vitro was investigated by cell growth curve,flow cytometer immunocytochemistry,in situ hybridization,RT-PCR,Southern blot. Results The sequence and the orientation of GFAP cDNA fragment inserted into PLBskG was completely accuracy.The PLBskG was successfully conformed into PA317 cell and expressed in NIH3T3 cell as showed by Southern blot and RT-PCR analyze.The PLBskG infection resulted in growth suppression and G1 stage arrest of the normal and scratched astrocyte.The normal and reactive astrocytes infected by PLBskG became round or ellipse.The process of this cell became fine or retracted,the ratio of nuclei/cytoplasm was larger.The staining of GFAP substance was reduced and transcription level of GFAP mRNA was down-regulated. Conclusions We obtained a normal construction of the antisense GFAP retrovirus expressing vector,and confirmed that this vector could effectively inhibit the growth and GFAP expression of normal and reactive astrocyte in vitro.
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【Key words】 Astrocyte;Retrovirus;Glial fibrillary acidic protein;Brain injury
星形胶质细胞(astrocyte,Ast)在中枢神经系统(CNS)中起着重要的作用，它不仅参与了CNS各种生理功能的调节，而且在CNS的多种病理变化中，尤其是在CNS的损伤修复中起着重要的作用。研究发现，胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)对维持Ast的形态结构及功能具有重要作用，抑制GFAP基因表达，可能影响Ast的生长、增殖，以及Ast对损伤的反应[1]。反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的，与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性的与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。本研究采用基因重组技术，成功构建了反义GFAP逆转录病毒表达载体，通过体外实验研究了其对培养正常及反应性Ast形态结构、GFAP基因表达的影响，并探讨了作用机制与意义。
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材料和方法
1. 主要材料
内切酶SaⅡ、HindⅢ、EcoRI、XhoI及M-MLV逆转录酶为Promega公司产品，Lipofectin、G418、Dulbecco' modified Eagle medium(DMEM)为GIBCO公司产品，细胞系PA317、NIH3T3、ψ2为军事医学科学院贺福初研究员惠赠，胎牛血清为天津血制品研究所产品，TriPure试剂盒为宝灵曼公司产品，免疫组织化学与原位杂交试剂为中山公司产品。
2. 重组反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
质粒pBR322/GFAP(含GFAP基因第1外显子起始密码区1.1kb DNA片段，由美国纽约大学医学中心Nicholas J.Cowan教授惠赠，用Sal I和Hind Ⅲ双酶切后，回收目的片段，亚克隆至pBluscript sk-载体上，重组子命名为BskG。在插入位点的外侧，用EcoRI和XhoI双酶切BskG质粒，回收目的片段，反向插入逆转录病毒载体PLXSN上，重组子命名为PLBskG，酶切鉴定及序列分析。
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3. 病毒包装与滴度测定
PLBskG及空载体PLXSN质粒用脂质体Lipofectin包裹后转染PA317细胞，G418筛选2周，随机挑选各4个克隆细胞扩增培养，收获病毒上清，感染NIH3T3细胞，G418筛选，根据克隆形成数，计算病毒滴度。挑选滴度高的克隆细胞继续扩增培养。收获的病毒上清，交叉感染ψ2及PA317细胞，重复两次，再次测定病毒滴度。
4. Southern杂交鉴定PLBskG在包装细胞中的整合
提取病毒感染的PA317细胞基因组DNA，酶切后，凝胶电泳分离，转NC膜，32P-GFAPcDNA探针进行Southern杂交。
5. RT-PCR检测目的基因在NIH3T3细胞中的表达
用TriPure试剂盒提取PLBskG感染的NIH3T3细胞总RNA，经M-MLV逆转录酶反转录成cDNA后，PCR扩增，凝胶电泳分析。GFAP引物上游序列为：5′-CTGAATTCTGCTGGCTTCA-AGG-3′，下游序列：5′-CTAAGCTTGCTCTGCG-TTGCGG-3′，扩增片段增长624bp。β-actin引物上游序列为，5′-GCG-GGAAATCGTGCTGACATT-3′，下游序列为5′-GATGGAGTTGAAGGTAGT-TTCGTG，扩增片段长314bp。扩增条件：94℃,4min；接94℃,30s;60℃,1min;72℃,1min;循环30次后，接72℃,7min。
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6. Ast分离培养
取新生当天Wistar大鼠皮层组织，制成细胞悬液。200目金属滤网过滤，收集滤液，转入培养瓶中，补加含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5%CO2孵箱培养24h，细胞贴壁后换液。继续培养至约90%融合时，0.25%胰酶消化，传3～4代，纯化Ast培养。
7. 反应性Ast体外模型的建立
改良Yu[2]等建立的体外培养Ast划伤模型，采用点搓法造成Ast损伤，即取24孔板，每孔中置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片，Ast生长在经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，达80%～90%融合后，用自制消毒橡皮头，无菌钳夹持后，在盖片的不同部位上轻轻点搓3～4次，制成体外Ast损伤模型。加D-Hank清洗1次，去除损伤碎片，补加新鲜培养基继续培养。
8. PLBskG感染靶细胞
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取病毒上清1ml,滴加在50%～60%融合的培养Ast上，37℃,5%CO2孵箱中孵育3h，补充含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。
9. PCR扩增Neo基因鉴定PLBskG在靶细胞中的整合
提取PLBskG感染的培养Ast细胞基因组DNA，PCR扩增。反应条件：94℃，4min;接94℃,30s;60℃,1min;72℃,1min，循环30次后，接72℃,7min。Neo基因引物上游序列为5′-CGAGGCAGCGCGGCTATCGT-3′，下游序列为5′-ACGT-GCTCGCTCGA-TGCGAT-3′，扩增片段长度240bp。
10. RT-PCR检测靶细胞中GFAP mRNA基因的表达
提取PLBskG及PLXSN感染的正常Ast、划伤Ast细胞总RNA，经M-MLV反转录成cDNA后，PCR扩增。
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11. 生长曲线测定
Ast按1×105接种24孔板，长至60%融合后，弃培养基，每孔加病毒上清1ml,24h后，换含10%胎牛血清的新鲜培养液，分别于换液后0、1、3、5d，各取3孔细胞，胰酶消化后，收集细胞，台盼蓝染色，计数活细胞，取平均值，绘制生长曲线。
12. 生长周期检测
收集培养的正常Ast、划伤Ast及病毒感染后0、1、3、5d的细胞，碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色，流式细胞仪检测。
13. 免疫细胞化学染色(ICC)
生长于盖玻片上的Ast，经70%酒精+10%冰醋酸固定30min后，按本室常规方法进行ICC染色[3]。
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14. 原位杂交
生长于盖玻片上的Ast，经4%多聚甲醛固定5min后，用Dig-GFAP cRNA探针，按本室常规方法进行原位杂交[3]。
15. 统计学处理
采用计算机统计程序对所得数据作单因数方差分析。
结 果
1. 反义GFAP重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
重组子BskG经酶切后，凝胶电泳证实，1.1kb的插入片段与载体成功连接；序列分析表明，插入片段的序列与方向与文献报道完全一致。回收目的片段后，定向克隆至pLXSN载体上，获得的重组子PLBskG经酶切鉴定，构建正确(图1)。
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图1 重组反义GFAP逆转录病毒PLBskG酶切图谱
a.λDNA/EorRI+Hind Ⅲ marker b.回收的GFAP片段 c.重组PLBskG质粒 d.PLBskG质粒EcoRI酶切图谱 e.PLBskG质粒XhoI+EcoRI双酶切图谱
Fig.1 The electrophoresis of restriction enzyme digest of PLBskG
a,λDNA/EorRI+Hind Ⅲ marker b,fragment of GFAP c,plasmid of PLBskG d,restriction enzyme of PLBskG by EcoR I e,restriction enzyme of PLBskG by XhoI and EcoRI
2. 病毒滴度测定
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收获的第1代病毒上清液，滴度为：PLBskG 5.2×104，pLXSN 5.6×104，交叉感染ψ2及PA317细胞后，PLBskG滴度上升为4.8×105，pLXSN滴度上升为3.7×105。
3. Southern杂交
获得清晰的阳性杂交带，表明PLBskG在包装细胞中成功实现了整合(图2)。
图2 Southern blot鉴定PLBskG在PA317细胞中的整合
a.PA317/PLBskG克隆细胞1个月 b.PA317/PLBskG克隆细胞2个月
Fig.2 Identification of integration of DNS of PLBskG in PA317 cell by Southern blot
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a,one month,PA317/PLBskG clone cells b,two months,PA317/PLBskG clone cells
4. RT-PCR
扩增产物经凝胶电泳分析，获得了1条620bp的阳性扩增带，表明PLBskG在NIH3T3细胞中成功表达。
5. Ast纯化培养及划伤模型的建立
分离细胞接种于培养基中，24h后，存活细胞贴壁，5～7d后，细胞分层铺满瓶底。胰酶消化，传3～4代，形成大致均一的单层细胞，为扁平、多角形，并具有短而粗大的突起，GFAP免疫组织化学染色阳性。如此传代培养的Ast，其纯度达95%以上。划伤Ast 24h后，可见细胞体积增大，长出突起，3～4d后突起变细长，彼此交织，成网状聚集，GFAP免疫组织化学染色增强。
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6. PLBskG对正常Ast及损伤Ast的影响
PLBskG感染培养正常Ast在48h后，可见Ast细胞体积缩小，胞浆减少，突起回缩；3～5d后，Ast形态明显改变，胞体变成圆形，或椭圆形；胞浆显著减少，胞突变细，回缩，胞核无明显改变，核浆比例增大，GFAP免疫组织化学染色强度减弱；原位杂交显示GFAP mRNA表达降低。PLBskG感染损伤Ast后，可见Ast增大的胞体缩小，呈圆形、椭圆形或不规则形，突起回缩，部分细胞甚至无明显突起形成；GFAP免疫组织化学染色变浅，原位杂交见GFAP mRNA表达水平明显下降，反应性胶质化的典型特征消失(图3)。
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图3 PLBskG对损伤Ast的影响。A.培养正常Ast的免疫组织化学染色；B.损伤3d后Ast的免疫组织化学染色：细胞呈团状聚集，GFAP染色增强，突起增多，呈网状聚集；C.PLBskG感染划伤Ast 3d后免疫组织化学染色，显示细胞突起回缩，GFAP染色减弱，核/浆比例增大×200；D.PLBskG感染划伤Ast 3d后原位杂交：Ast表达GFAP mRNA水平下降，反应性胶质化的典型特征消失 ×200
Fig.3 The effect of PLBskG on injured astrocytes.
A,The immunocytochemistry stain of normal astrocyte.The astrocytes appeared as round or irregular,their processes were thick and short. ×400
, 百拇医药 B,The immunocytochemistry stain of 3 days after injured astrocyte:the injured astrocyte get together,the stain of GFAP stranger,the process increased, ×200
C,The immunocytochemistry stain of 3days after the injured astrocytes infected by PLBskG.These cells appeared to have smaller,round,ellipoid or irregular cell bodies,their cytoplasmic processes extracted,GFAP staining reduced. ×200
D,The in situ hybridization of 3 days after the injured astrocytes infected by PLBskG.The expression of GFAP mRNA reduced,the reactive gliosis characteristic of injured astrocyte disappeared. ×200
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7. PCR扩增Neo基因
扩增产物经凝胶电泳分析可见250bp的阳性扩增条带影，片段大小与设计吻合，表明PLBskG成功整合入宿主细胞中。
8. 细胞生长曲线
PLBskG感染培养正常Ast及损伤Ast后，Ast生长抑制，而PLXSN感染培养正常Ast及损伤Ast后，抑制作用不明显(图4)。
图4 PLBskG感染正常及损伤Ast后细胞生长曲线(×105)
Fig.4 Cell growth curve after PLBskG infecting normal
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and injurd astrocyte(×105)
9. 细胞增殖周期分析
PLBskG感染正常Ast及划伤Ast后，G1期细胞增多，S期及G2M期细胞明显减少，而PL对正常及划伤Ast细胞增殖周期无明显影响。
10. RT-PCR检测靶细胞中GFAP基因表达水平
PLBskG感染正常Ast及损伤Ast后，其GFAP mRNA表达水平下降，而PLXSN对正常及损伤Ast GFAPmRNA无显著影响(图5)。
图5 RT-PCR检测PLBskG感染培养划伤
, http://www.100md.com Ast的GFAP基因表达
a.pLXSN感染组；b.PLBskG感染1d;c.PLBskG感染3d；d.PLBskG感染5d；e.PLBskG感染7d；f.φ174/Hae marker
Fig.5 Analysis of expression of GFAP mRNA by RT-PCR.
a,lanes:pLXSN infection group.b,lanes:1 day after infected by PLBskG,c,lanes:3 days after infected by PLBskG;d,lanes:5 days after infected by PLBskG,e,lanes:7 days after infected by PLBskG;f,φ 174/Hae marker
讨 论
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GFAP基因最早由Lewis等在1984年克隆并测序。该序列包含8个内含子，9个外显子，由9 971个碱基组成。GFAP基因与其他中间丝序列，尤其是结蛋白和波形蛋白的碱基序列具有较高的同源性，其中与结蛋白的同源性达65%，与波形蛋白的同源性达67%，它们在进化上都属于保守性较高的序列。所不同的是，GFAP基因内含子中含有大量与Alu序列密切相关的重复序列，该序列很可能是一个插入元件。另一个有意义的结合特征就是其羧基端的丝氨酸和苏氨酸残基的高度保守性。这些氨基酸可能是中间丝的磷酸化和翻译后修饰的潜在部位，提示这些部位可能是GFAP的重要功能部位。
GFAP的确切功能尚不清楚。从本实验结果看，反义GFAP逆转录病毒感染培养正常Ast后，Ast的生长延缓、胞体缩小、变圆，突起回缩，核浆比例增大，提示GFAP对维持Ast形态结构的完整性起重要作用，并决定着Ast对损伤反应的程度。
Ast对CNS各种损伤均表现出迅速而活跃的反应，以反应性胶质化为特征。Ast介导的多种病理生理反应均是在反应性胶质化的基础上发生、发展的。尽管激活Ast反应的确切机制尚不清楚，但大量的资料表明，损伤、炎症、变性坏死的组织碎片、缺血、缺氧等因素均可诱导Ast起反应，提示Ast反应是一个十分复杂的病理生理过程[4，5]。然而，这些因素在在体情况下没有一种是容易控制的，使得分析和评价Ast对损伤的反应比较困难。如何解决这一难题对于研究反应性胶质化的机制，以及Ast在胶质瘢痕形成中的作用十分重要。Yu等[2]在体外分离培养Ast的基础上，利用机械划伤培养Ast的办法复制出具有反应性胶质化典型特征的体外培养模型，称之为“培养皿的划伤模型”(scratch disk model)，为体外研究Ast反应创造了良好的条件。本实验在复制体外培养Ast损伤模型时，按照Yu等介绍的方法用橡皮头擦划培养物以制作Ast的反应性胶质化，发现该方法易造成伤道边缘Ast的严重损伤和伤道中心部位Ast的完全脱落，在继续培养中，Ast反应迟缓，往往需2～3d才表现出典型的Ast反应性改变，而且在1张盖片上至多仅能划2～3道，损伤的范围较小。本实验采用点搓法，在盖片上多点损伤，点搓范围较小，既造成了Ast的损伤，又不至于使Ast从盖玻片上完全擦掉，损伤程度适中，Ast对损伤的反应出现较早，往往在伤后1d即可见到典型的Ast反尖。免疫组织化学染色显示，Ast呈现出反应性胶质化的典型特征表现，效果满意。体外分离培养Ast作为研究Ast的各种生理、病理反应具有许多优点。首先，Ast纯化培养比较容易，可以形成能传代的二倍体细胞系；其次，Ast在培养基中生长稳定，不易自发转化，保持了在体情况下的生理功能和对外界因素刺激的良好反应性；再者，纯化培养的Ast，既无神经元存在，又消除了在体情况下各种因素对Ast的影响，对Ast施加的各种干扰因素也很容易控制。因此，利用培养Ast作为模拟在体条件下Ast的功能不失为一个良好的体外模型。
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从免疫组织化学和原位杂交的结果来看，反应性胶质化的显著特征表现为GFAP表达上调。大量GFAP的堆积可能是造成反应性Ast胞体肥大，突起增粗、延长的主要原因。而GFAP作为构成Ast细胞骨架的主要成分，对于维持Ast形态结构的稳定至关重要。因此，如果能够抑制GFAP基因的表达，将有望抑制Ast的生长和反应性胶质化的形成。反义核酸技术的创立与应用为解决这一难题带来了希望。利用基因工程技术，在适宜的启动子和增强子之间反向插入一段靶基因，使其表达反义RNA，通过与靶mRNA的结合，阻止mRNA的翻译；或者人工合成一段反义RNA，抑制靶mRNA的表达，均可达到特异性抑制靶基因表达的目的。Yu等人最先利用人工合成的反义RNA，成功抑制了培养Ast的GFAP基因表达，减轻了反应性胶质化的发生，从理论和实践上为利用基因工程技术达到减轻反应性胶质化的目的奠定了基础。然而，人工合成的反义RNA，具有作用时间短暂(一般3～5d)的特点，相对GFAP基因表达在1～2周后达高峰的时间过余短暂，其效果难尽人意。逆转录病毒具有整合入基因组中稳定表达的特点，作为基因的运载工具是目前研究较为成熟的一种[6]。本实验针对GFAP基因结构的特点，将含编码GFAP基因第1外显子起始密码区的一段长约1.1kb的cDNA质粒反向插入逆转录病毒载体中，通过病毒DNA整合到Ast基因组中，利用LTR启动反义GFAP基因的转录，合成反义RNA，特异性的封闭GFAP mRNA的表达。结果表明，重组逆转录病毒感染正常Ast，使其胞体变圆，突起变细、回缩。细胞生长曲线表明，Ast呈生长抑制状态，细胞周期分析发现，G1期阻滞。免疫细胞化学染色及原位杂交结果显示，GFAP基因表达明显抑制。重组逆转录病毒感染划伤Ast后，Ast对划伤的反应明显抑制，与单纯划伤Ast及空载体PLXSN感染的Ast比较，肥大的胞体缩小，呈圆形或椭圆形，突起变细、甚至完全回缩；GFAP免疫组织化学染色变浅，原位杂交和RT-PCR结果均提示GFAP mRNA表达下降。因此，从本实验结果看，重组反义GFAP逆转录病毒能有效的抑制GFAP基因表达，以及Ast对损伤的反应，提示利用重组反义GFAP逆转录病毒抑制Ast对损伤的反应，将有可能在体内抑制或延缓胶质瘢痕形成，从而，为神经再生和功能重建创造良好的微环境。
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【基金项目】97重庆市青年科研基金及全军九五面上基金资助项目(96M090)
作者简介：黄其林(1960—)，男(汉族)，重庆市人，医学博士，主治医师，讲师
参考文献
[1]Liedtke W,Edelmann W,Bieri PL,et al.GFAP in necessary forth the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination[J].Neuron,1996,17(4):607-615.
[2]Yu ACH,Lee YL,Eng LF.Inhibition of GFAP synthesis by antisense RNA in astrocytes[J].J Neuroscience Res,1991,30(1):72-79.
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[3]蔡文琴，王伯云主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版社，1994：82-86.
[4]Eddleston M,Mucke L.Molecular profile of reactive astrocytes-implications for their role in neurologic disease[J].Neurosci 1993,54(1):15-36.
[5]Lucas RL,Salm AK.Astroglia proliferate in response to oxytocin and vaso- pressin[J].Brain Res,1995,681(1-2):218-222.
[6]Vile RG,Russell SJ.Retroviruses as vectors[J].British Medical Bulletin,1995,51(1):12-30.
【收稿日期】1999-03-09
【修稿日期】1999-08-17, http://www.100md.com